H1和H3亞型豬流感病毒二重TaqMan-MGB探針熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王建華，陳小金，張俊哲，王玉玲，肖　妍，趙　丹，譚旭菲，王乃福，陳本龍，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津　300456）

H1和H3亞型豬流感病毒二重TaqMan-MGB探針熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立

王建華，陳小金，張俊哲，王玉玲，肖妍，趙丹，譚旭菲，王乃福，陳本龍，董志珍，趙祥平

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300456）

根據(jù)H1和H3亞型豬流感病毒（SIV）血凝素（HA）編碼基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)合成特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立了一種檢測(cè)H1和H3亞型SIV的二重?zé)晒釸T-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法僅對(duì)H1和H3亞型SIV呈特異性擴(kuò)增，對(duì)H9亞型SIV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（SFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）無(wú)交叉擴(kuò)增反應(yīng)；用該方法檢測(cè)H1和H3亞型SIV的HA基因的 RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照（SIV-H1-RNA，SIV-H3-RNA），最適線性檢測(cè)范圍分別為3.7×101～3.7×108拷貝數(shù)/反應(yīng)和3.4×100～3.4×108拷貝數(shù)/反應(yīng)，最低檢出限分別為38和34個(gè)拷貝數(shù)；該方法的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2.0%，顯示其具有良好的可重復(fù)性。用該方法對(duì)520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國(guó)內(nèi)豬鼻拭子樣本進(jìn)行SIV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，12份國(guó)內(nèi)豬鼻拭子樣本的H1亞型SIV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，5份國(guó)內(nèi)豬鼻拭子樣本的H3亞型SIV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。本方法的建立為H1和H3亞型SIV檢測(cè)提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段。

豬流感病毒；H1亞型；H3亞型；TaqMan探針；熒光RT-PCR

豬流感（Swine Infl uenza，SI）是由A型豬流感病毒（SIV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性和群發(fā)性呼吸道疾病，臨床上以高熱、厭食、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬繁殖障礙為典型表現(xiàn)［1］。SI廣泛流行于全球各主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)。目前我國(guó)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的H1N1和H3N2亞型SIV流行和危害比較嚴(yán)重且難以根除［2-4］，需加強(qiáng)對(duì)國(guó)內(nèi)豬群SIV的監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查與防控技術(shù)研究，以及對(duì)國(guó)外進(jìn)口種豬的SIV檢疫工作。目前診斷SI的常規(guī)方法是采用雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，繼而對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行血凝及血凝抑制試驗(yàn)，存在操作繁瑣和診斷周期長(zhǎng)等不足［5］。近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)已被用于SIV核酸的檢測(cè)［6-8］。本研究基于H1和H3亞型SIV的HA基因保守序列，建立了一種檢測(cè)H1和H3亞型SIV的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1病毒核酸及臨床樣本

H1、H3和H9亞型的SIV核酸，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（SFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的核酸，由天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。2012—2015年期間保存的520份豬鼻拭子樣本（來(lái)自美國(guó)和丹麥進(jìn)口豬）和78份國(guó)內(nèi)豬鼻拭子樣本（來(lái)自國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)的疑似病豬）。

1.2主要儀器與試劑

Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）、5417R EPPENDORF冷凍離心機(jī)和ESCO CLASS Ⅱ BSC生物安全柜；TRIzol LS Reagent 購(gòu)自Invetrogent公司；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstI 限制性內(nèi)切酶、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購(gòu)自大連寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購(gòu)自Promega公司。其他試劑均為國(guó)內(nèi)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.3引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//www.ncbi.nlm.nih. gov/）下載H1和H3亞型SIV的HA基因序列，進(jìn)行生物學(xué)信息分析，選出高度保守且特異的區(qū)域，用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針，由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。針對(duì)HA基因的探針序列5′端用FAM標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記；針對(duì)H3基因的探針序列5′端用NED標(biāo)記，3′端用MGB標(biāo)記；預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為74 bp和87 bp。引物和探針序列見(jiàn)表1 。

表1　用于檢測(cè)H1和H3亞型SIV的HA基因的引物與探針序列

1.4RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照制備

根據(jù)H1和H3亞型SIV的HA基因序列（KP336278、KM061018 ）各自設(shè)計(jì)4條寡核酸鏈，用于RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的制備，序列見(jiàn)表2。以SIV-H1-M1/ SIV-H1-M2為模板、SIV-H1-F2/ SIVH1-R2為引物，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增；將擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，與PCR2.1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑選陽(yáng)性重組克隆，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。以經(jīng)PstⅠ酶切線性化的陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA為模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；對(duì)獲得的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RQ1 DNA酶消化及純化后即制備成含有H1亞型SIV HA基因靶序列的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，命名為SIV-H1-RNA。用核酸蛋白分析儀測(cè)定NiV-M-RNA的濃度，按公式y(tǒng)（copies/μL）= ［x（g/μL）RNA/（transcript length in nucleotides×340）］×6.02×1023，換算其拷貝數(shù)。以SIV-H3-M1/SIV-H3-M2為模板、SIV-H3-F2/SIVH3-R2為引物，按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。按同法制備含有H3亞型SIV HA基因靶序列的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，命名為SIV-H3-RNA，并換算其拷貝數(shù)。

表2　用于制備RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的寡核酸鏈

1.5總RNA提取

按常規(guī)TROZOL試劑方法操作，提取樣本的總RNA， 并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用 One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑，在Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）儀上，首先確定SIV-H1-RNA（4.6×106copies /μL）和SIV-H3-RNA（4.1×106copies /μL）單一熒光RT-PCR反應(yīng)的最適引物和探針濃度，然后對(duì)25 μL二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系下的混合引物和探針濃度以及56～61 ℃范圍內(nèi)的退火延伸溫度做進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)，以確定最適的反應(yīng)條件。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA進(jìn)行10倍系列稀釋，使其濃度范圍分別為3.7×101～3.7×107copies/μL和3.4×100～3.4×108copies/μL。在優(yōu)化的25 μL二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件下，對(duì)每個(gè)稀釋度的SIV-H1-RNA 吸取1 μL為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，以Ct值為橫坐標(biāo)、SIV-H1-RNA模板起始拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；按同法繪制SIV-H3-RNA的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)

對(duì)濃度范圍為3.7×101～3.7×107copies /μL的SIV-H1-RNA和 3.4×100～3.4×108copies /μL的SIV-H3-RNA，分別吸取1 μL按1.6優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，以確定該方法可以檢測(cè)SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的最低拷貝數(shù)。對(duì)3個(gè)濃度的SIVH1-RNA 和SIV-H3-RNA 分別取1 μL為模板，分別進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)，以確定該方法的重復(fù)性。以H1亞型、H3亞型和H9亞型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸為模板，按1.6優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，以確定該方法的特異性。

1.9臨床樣本檢測(cè)

對(duì)2012—2015年期間保存的598份豬鼻拭子樣本，采用本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法進(jìn)行H1和H3亞型SIV核酸檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性。當(dāng)Ct值小于35時(shí)判定為陽(yáng)性，Ct值在35～40之間的判定為可疑，如重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的Ct值仍在35～40之間時(shí)判定為陰性，無(wú)Ct值時(shí)判定為陰性。

2　結(jié)果

2.1熒光RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

以SIV-H1-RNA（4.6×106copies /μL）和SIVH3-RNA（4.1×106copies /μL）為模板，通過(guò)對(duì)不同濃度組合的引物和標(biāo)記探針以及56～61 ℃范圍內(nèi)退火延伸溫度的優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系為：在25 μL反應(yīng)體系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS （5 U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 μL，SIV-H1-F（10 pmmol/ μL）、SIV-H1-R（10 pmmol/μL）、SIV-H1-P（4 pmmol/μL）SIV-H3-F（10 pmmol/μL）、SIV-H3-R（10 pmmol/μL） 和SIV-H3-P（4 pmmol/μL） 各0.5 μL，模板適量，補(bǔ)足水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，然后95 ℃ 10 sec，60 ℃30 sec，45個(gè)循環(huán)。在每一次循環(huán)的60 ℃延伸擴(kuò)增，結(jié)束前，采集FAM和NED通道的熒光信號(hào)。在最適反應(yīng)條件下，對(duì)SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA進(jìn)行擴(kuò)增呈現(xiàn)典型的S型熒光定量PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖1）。

圖1　二重?zé)晒釸T-PCR動(dòng)力學(xué)曲線

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的的繪制

對(duì)10倍系列稀釋的SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA，按優(yōu)化后的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)， 擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2-A和圖2-B；以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為X軸，Ct 值為Y軸繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2-C、圖2-D。對(duì)SIV-H1-RNA的定量檢測(cè)的線性范圍為3.7×101～3.7×108copies /μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y= -3.311 4X+32.244，相關(guān)系數(shù)（R2）為0. 999 4。對(duì)SIV-H3-RNA的定量檢測(cè)的線性范圍為3.4×101～3.4×108copies /μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y= -3.308 2X+36.936，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6。

2.3敏感性試驗(yàn)

對(duì)SIV-H1-RNA（3.7×101～3.7×108copies /μL）和SIV-H3-RNA（3.4×101～3.4×108copies /μL），按優(yōu)化后的二重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2-A和圖2-B。由圖2可知，該方法最低可檢出37個(gè)拷貝的SIV-H1-RNA分子和34個(gè)拷貝的SIV-H3-RNA分子。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

分別選取3個(gè)濃度的SIV-H1-RNA和SIVH3-RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為模板，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV）見(jiàn)表3和表4。3個(gè)濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的Ct值變異系數(shù)均小于2.0%，表明本試驗(yàn)所建立的二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

圖2　SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA的二重?zé)晒釸T-PCR試驗(yàn)的敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3　SIV-H1-RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4　SIV-H3-RNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5特異性試驗(yàn)

應(yīng)用本試驗(yàn)建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法，對(duì)H1、H3和H9亞型的SIV核酸，以及PRRSV、SFV、PEDV和TGEV的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，僅H1和H3亞型SIV出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而H9亞型的SIV核酸以及PRSSV、CSFV、PEDV和PGEV均無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測(cè)H1和H3亞型 SIV核酸有良好的特異性。

2.6臨床樣本的檢測(cè)

對(duì)2012—2015年保存的520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本（組A）和78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本（組B），用本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法進(jìn)行H1和H3亞型SIV檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，520份進(jìn)口豬鼻拭子樣本的SIV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，在78份采自國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本中，有12份為H1亞型SIV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，有5份為H3亞型SIV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

圖3　二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)H1、H3亞型SIV的特異性

表5　598份實(shí)際樣本的H1和H3亞型SIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3　討論

近年來(lái)，SIV因作為一種豬呼吸道疾病綜合癥的原發(fā)性病原和同時(shí)具有感染人和禽的潛力而日益受到重視。一方面SIV對(duì)豬呼吸道上皮的防御屏障破壞，極易導(dǎo)致豬發(fā)生PRRSV、PCV2、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌感染或繼發(fā)感染，從而延長(zhǎng)病程和增高死亡率，對(duì)豬群危害極大［9］；另一方面，豬被認(rèn)為是人、禽和/或豬流感病毒通過(guò)基因重排產(chǎn)生新的亞型流感病毒的“混合器”［10］。因此，對(duì)豬群SIV感染的監(jiān)測(cè)及分子流行病學(xué)分析不僅可為調(diào)查豬呼吸道疾病綜合癥的病因及制定控制措施提供重要的病原學(xué)依據(jù)，而且在預(yù)防和朔源人類流感流行方面具有重要的公共衛(wèi)生意義。與傳統(tǒng)的檢測(cè)SIV的雞胚病毒分離方法和血凝抑制試驗(yàn)相比較，應(yīng)用熒光RT-PCR檢測(cè)SIV核酸具有快速而敏感的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)研究人員已報(bào)道了多種檢測(cè)SIV的熒光RT-PCR［6-8］。根據(jù)H1和H3亞型SIV的HA基因保守序列，本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)H1和H3亞型SIV核酸的TaqMan 探針二重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的特異性，僅對(duì)H1和H3亞型SIV核酸呈特異性擴(kuò)增，對(duì)豬的其他常見(jiàn)病毒無(wú)交叉擴(kuò)增反應(yīng)，該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照SIV-H1-RNA和SIV-H3-RNA最低可分別檢出37和34個(gè)拷貝數(shù)，并顯示出良好的定量線性關(guān)系和重復(fù)性。通過(guò)對(duì)520份進(jìn)口豬的鼻拭子樣本和78份國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)豬鼻拭子樣本的實(shí)際檢測(cè)試驗(yàn)，表明本研究建立的二重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)方法可用于臨床樣本中H1和H3亞型SIV的檢測(cè)。

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Development of a Duplex TaqMan-MGB Real-time RT-PCR Assay for Detecting H1 and H3 Subtype Swine Infl uenza Virus

Wang Jianhua，Chen Xiaojin，Zhang Junzhe，Wang Yuling，Xiao Yan，Zhao Dan，Tan Xufei，Wang Naifu，Chen Benlong，Dong Zhizhen，Zhao Xiaoping
（The Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456）

Absract：A Taqman-MGB probe duplex real-time RT-PCR was developed to detect H1 and H3 subtype swine infl uenza virus（SIV）. Two pairs of primers and probes were designed according to the conserved regions of HA gene sequences of H1 and H3 subtype. The assay was specifi c to detect subtype H1 and H3 SIV，but had no cross-reaction with H9N2 subtype SIV，classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The assay has a broad linear detection range from 3.7×101copies/μL to 3.7×108copies/μL for RNA standard control of hemagglutinin（HA）of H1 subtype（SIV-H1-RNA）and 3.4×101copies/μL to 3.4×108copies/μL for RNA standard contol of HA of H3 subtype（SIV-H3-RNA），respectively. The detection limit of the assay was 37 copies for the SIV-H1-RNA and 34 copies for the SIV-H3-RNA，respectively. The coeffi cients of variation（CVs）of both inter-assay and intra-assay were less than 2.0 %，showing good reproducibility. 598 nasal swab samples were tested for subtype H1 and H3 detection by the assay. No positive H1 and H3 subtype reaction was found for all 528 samples from imported pigs. 12 and 7 of 78 nasal swab samples of domestic pigs were found to be positive for H1 and H3 respectively. In short，the development of this assay offers a useful method for the simultaneous detection of subtype H1 and H3 SIV in clinical specimens from the pigs.

swine infl uenza virus；subtype H1；subtype H3；TaqMan probe；duplex real-time RT-PCR

S852.65

B

1005-944X（2016）10-0090-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.023

天津市科技支撐項(xiàng)目（13ZCZDNCO1300）；天津市濱海新區(qū)惠民項(xiàng)目（2013-BK15H013）

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）