旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期排泄分泌物抗原在免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用研究

吳秀萍，孫召金，翟鋮鋮劉曉雷，唐　斌，劉明遠(yuǎn)

（1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲(chóng)和絲蟲(chóng)病合作中心，上?！?00025；2. 吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教 育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春　130062）

旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期排泄分泌物抗原在免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用研究

吳秀萍1，2，孫召金1，2，翟鋮鋮1，劉曉雷2，唐斌2，劉明遠(yuǎn)2

（1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)與病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲(chóng)和絲蟲(chóng)病合作中心，上海200025；2. 吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教 育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130062）

［目的］系統(tǒng)了解并比較旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期排泄分泌物（ES）抗原的免疫學(xué)特性，探索可用于臨床檢測(cè)出欄豬旋毛蟲(chóng)感染的血清學(xué)診斷技術(shù)。［方法］ 分別以旋毛蟲(chóng)腸道期10 h肌幼蟲(chóng)（10 h ML）、腸道期30 h成蟲(chóng)（30 h Ad）、3 d 成蟲(chóng)（Ad3）、6 d 成蟲(chóng)與新生幼蟲(chóng)混合（Ad6+NBL）以及肌幼蟲(chóng)（ML）五個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的ES作為包被抗原，應(yīng)用ELISA方法，檢測(cè)感染不同劑量、不同天數(shù)的豬血清中的抗旋毛蟲(chóng)抗體IgM和IgG水平，繪制抗體消長(zhǎng)規(guī)律曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。［結(jié)果］10 h ML ES和ML ES作為包被抗原適合檢測(cè)不同感染劑量、感染35 d之前的豬抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體，低劑量感染10 d左右可以檢出，高劑量感染5 d也可以檢出；Ad3 ES作為包被抗原對(duì)高劑量感染35 d之前的豬抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體檢測(cè)敏感；Ad3和ML的ES作為包被抗原可檢測(cè)不同劑量、感染35 d之后的豬抗旋毛蟲(chóng)IgG抗體，其中Ad3 ES抗原檢測(cè)低劑量感染的效果優(yōu)于ML ES抗原。［結(jié)論］ 腸道期肌幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)的ES抗原可用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的早期感染，成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)的ES抗原可用于檢測(cè)出欄豬的旋毛蟲(chóng)感染。本研究為進(jìn)一步合理有效利用旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的ES抗原，建立更有效的檢測(cè)屠宰動(dòng)物旋毛蟲(chóng)感染的方法提供了重要理論基礎(chǔ)和參考。

旋毛蟲(chóng)；排泄分泌物；豬血清；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

旋毛蟲(chóng)屬線蟲(chóng)，是除南極洲外在世界廣泛均有分布的人獸共患寄生蟲(chóng)［1］，目前為止，至少被55個(gè)國(guó)家記錄或報(bào)道［2-3］。人通過(guò)生食或半生食感染旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的豬肉、馬肉、狗肉和野生動(dòng)物肉（如野豬、熊、獾和海象）及肉類(lèi)制品而被感染［3］。近年來(lái)，家養(yǎng)豬被認(rèn)定為旋毛蟲(chóng)（T.spiralis）的主要宿主，豬肉被認(rèn)定為人類(lèi)旋毛蟲(chóng)病的主要感染源［4］。

旋毛蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要包括：鏡檢法、集樣消化法和血清學(xué)檢測(cè)。集樣消化法是目前旋毛蟲(chóng)檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)；血清學(xué)方法如ELISA，是目前檢測(cè)旋毛蟲(chóng)最為敏感的方法。目前所采用的抗原主要來(lái)自旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的ES抗原。而ES抗原存在特異性及診斷盲區(qū)等弊端，使得ELISA檢測(cè)無(wú)法納入旋毛蟲(chóng)國(guó)際檢測(cè)法規(guī)［5-7］。Boireau［8］、Kapel［9］等人證明旋毛蟲(chóng)ML、Ad和NBL抗原可被實(shí)驗(yàn)感染旋毛蟲(chóng)的豬抗體所識(shí)別，并研究了其作為抗原檢測(cè)感染血清中IgG抗體消長(zhǎng)情況。

本研究以中國(guó)長(zhǎng)白豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔闹袊?guó)河南豬旋毛蟲(chóng)分離株T1 （ISS534）感染長(zhǎng)白豬，采用旋毛蟲(chóng)五個(gè)不同發(fā)育時(shí)期：腸道10 h肌幼蟲(chóng)期、腸道30 h成蟲(chóng)期、成蟲(chóng)期（Ad）、新生幼蟲(chóng)期和肌幼蟲(chóng)期（ML）分泌的不同抗原（ES）作為診斷抗原，采用ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)豬感染旋毛蟲(chóng)2個(gè)月內(nèi)不同天數(shù)的血清抗旋毛蟲(chóng)IgM和IgG抗體水平，分析了旋毛蟲(chóng)刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生抗旋毛蟲(chóng)抗體的消長(zhǎng)變化規(guī)律，為進(jìn)一步合理利用旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的排泄分泌物抗原，建立快速、有效的檢測(cè)屠宰動(dòng)物旋毛蟲(chóng)感染的免疫學(xué)診斷方法提供重要的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

傳代小鼠：實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔袊?guó)河南豬旋毛蟲(chóng)分離株的昆明小鼠；長(zhǎng)白豬：3月齡，每頭50 kg左右，共12頭，購(gòu)自吉林省惠昌畜牧科技有限公司；大鼠：6～8周齡的雄性Wistar大鼠，每只250 g，共80只，購(gòu)自白求恩醫(yī)學(xué)院。

1.2旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)株

中國(guó)河南豬旋毛蟲(chóng)分離株T1（ISS534），由實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?/p>

1.3主要試劑和儀器

胃蛋白酶（1∶1 000和1∶3 000）購(gòu)自 AMRESCO公司；燒杯、80目篩子、移液器、顯色液TMB均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；山羊抗小鼠 IgM或IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司；ELISA板購(gòu)自Corning公司；灌胃針、醫(yī)用低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫磁力攪拌器和顯微鏡等均購(gòu)自上海醫(yī)療器械股份有限公司。

2　方法

2.1感染性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)攻蟲(chóng)數(shù)量所需，取實(shí)驗(yàn)室保種傳代的昆明小鼠或wistar大鼠，剖殺，通過(guò)消化法收集中國(guó)河南豬旋毛蟲(chóng)分離株T1（ISS534）肌幼蟲(chóng)。用絞肉機(jī)絞碎豬肉，混合面粉做成肉球，將蟲(chóng)體按不同實(shí)驗(yàn)劑量分別包裹在肉球中，投喂給12頭實(shí)驗(yàn)豬。根據(jù)Boireau［8］、Kapel［9］等人的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)所需感染劑量如下：50條蟲(chóng)體（＜1l pg）、375條蟲(chóng)體（≈1l pg）、150條蟲(chóng)體（＞1l pg）和1 000條蟲(chóng)體（陽(yáng)性對(duì)照），各感染3頭長(zhǎng)白豬，接種后每天觀察其狀況。

2.2感染豬血清的收集

將感染豬前腔靜脈采血，分離血清放于-80℃冰箱保存。采血時(shí)間點(diǎn)分為感染前和感染后（5 dpi、8 dpi、11 dpi、14 dpi、17 dpi、21 dpi、26 dpi、35 dpi、45 dpi、60 dpi）。

2.3腸道期肌幼蟲(chóng)、腸道期成蟲(chóng)、成蟲(chóng)、新生幼蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)的培養(yǎng)與排泄分泌物收集

10 h腸道期肌幼蟲(chóng)（10 h ML）即對(duì)Wistar大鼠灌胃感染10 h后，剖殺、收集的肌幼蟲(chóng)，用于培養(yǎng)收集10 h ML的ES抗原；30 h腸道期成蟲(chóng)（30 h Ad）即為對(duì)Wistar大鼠灌胃感染30 h后，剖殺、收集的腸道期成蟲(chóng)，用于培養(yǎng)收集腸道30 h Ad的ES抗原；3 d 成蟲(chóng)（Ad3）即為感染后 3 d大鼠腸道內(nèi)的成蟲(chóng)，用于培養(yǎng)收集Ad3的排泄分泌物ES抗原；6 d成蟲(chóng)（Ad6）即為感染后6 d大鼠腸道內(nèi)的成蟲(chóng)，用于培養(yǎng)收集Ad6及新生幼蟲(chóng)（NBL）的混合排泄分泌物ES抗原；肌幼蟲(chóng)（ML），用于培養(yǎng)收集肌幼蟲(chóng)的排泄分泌物ES抗原。具體收集方法為：

剖殺實(shí)驗(yàn)室傳代保種T1（ISS534）的Wistar大鼠1只，用自來(lái)水將其胴體沖洗干凈后以絞肉機(jī)絞碎，放入含1%胃蛋白酶和1%鹽酸的消化液中，37 ℃消化2 h；除去未消化的組織，將濾液倒入分液漏斗中，室溫沉降2 h，收集肌幼蟲(chóng)。

將收集到的肌幼蟲(chóng)計(jì)數(shù)，一部分經(jīng)口灌胃感染20只Wistar大鼠（約10 000條/只），剩余肌幼蟲(chóng)（ML）用加有雙抗的無(wú)菌生理鹽水反復(fù)清洗干凈。將ML蟲(chóng)體分兩個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，約5 000條/mL，每瓶加入約10 mL含雙抗的1640培養(yǎng)液，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，收集的培養(yǎng)液即為所要收集的ML的ES抗原，-80 ℃保存。對(duì)灌胃的20只Wistar大鼠在第10 小時(shí)撲殺，取小腸段，收集10 h腸道期旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，經(jīng)1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，收集10 h腸道期肌幼蟲(chóng)的ES抗原，-80 ℃保存。30 h Ad、Ad3、Ad6+NBL的ES抗原收集方法同上。

超濾收集10 h、30 h、Ad3、Ad6+NEL和ML的ES抗原蛋白：將凍存于-80 ℃的10 h、30 h、Ad3、Ad6+NEL和ML的ES抗原在冰水混合物中融化，過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至超濾管中，用PBS反復(fù)洗滌超濾蛋白，至1640培養(yǎng)液顏色變?yōu)闊o(wú)色為止。然后分裝至1.5 mL EP管中，測(cè)其蛋白濃度，標(biāo)記后凍存于-80 ℃中備用。

2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中抗旋毛蟲(chóng)抗體

通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)感染豬血清中特異性抗旋毛蟲(chóng)IgM和IgG抗體［10-11］。將10 h、30 h、Ad3、Ad6+NBL和ML的ES抗原稀釋至10 μg/mL，以100 μL/孔包被酶標(biāo)板，置 37 ℃溫箱2 h后，移至4 ℃冰箱過(guò)夜。用洗液（PBS-T）洗滌板3次后，用封閉液封閉，200 μL/孔。將待檢感染豬血清1∶50稀釋后，加入到酶標(biāo)板中，100 μL/孔，置37 ℃溫箱孵育1 h。每個(gè)樣本重復(fù)3次，以感染前相對(duì)應(yīng)的血清作為陰性對(duì)照。以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgM或IgG作為二抗進(jìn)行孵育。以TMB底物溶液為顯色液，100 μL/孔。最后加入2 mol/L H2SO4100 μL/孔，終止顯色。用ELISA自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。待測(cè)樣本P值≥陰性對(duì)照O值的2.1倍時(shí)確認(rèn)為陽(yáng)性。

2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法與分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05。采用Excel軟件繪制不同包被抗原條件下感染豬血清IgM和IgG抗體消長(zhǎng)規(guī)律曲線。

3　結(jié)果

3.1不同劑量感染豬血清中IgM抗體水平

分別利用旋毛蟲(chóng)5個(gè)發(fā)育時(shí)期的ES抗原，即10 h ML、30 h Ad、Ad3、Ad6+NBL和ML的ES抗原，檢測(cè)旋毛蟲(chóng)4個(gè)不同感染劑量感染長(zhǎng)白豬60 d內(nèi)血清中IgM的變化情況。

3.1.110 h ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染早期，抗體均呈“波峰波谷”態(tài)勢(shì)變化。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第14天、第17天和第26天，血清IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性，但在第14天和26天處于高峰，隨后呈明顯呈下降趨勢(shì)，第35天后檢測(cè)變?yōu)殛幮裕?1天處于陰性“波谷”。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第8天、14天血清IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性，第17天后均為陰性，第45天處于陰性“波谷”。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后的前26 d均能檢測(cè)出IgM抗體陽(yáng)性，在第11天出現(xiàn)高峰，第14～21天出現(xiàn)陽(yáng)性“波谷”，后呈下降趨勢(shì)，第26天至第60天均為陰性。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后8～14 d內(nèi)維持IgM抗體陽(yáng)性水平，之后開(kāi)始下降，至第17天出現(xiàn)陰性“波谷”，隨后開(kāi)始上升，至第21天檢測(cè)為陽(yáng)性，之后一直維持較高水平。具體變化曲線見(jiàn)圖1。

圖1　應(yīng)用10 h ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體

3.1.230 h ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，檢測(cè)結(jié)果全部呈陰性。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天出現(xiàn)陽(yáng)性“波峰”，第45天處于陰性“波谷”，之后開(kāi)始上升，至第60天時(shí)，IgM陽(yáng)性抗體處于較高水平。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染45 d后，血清IgM抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性，之前均為陰性。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第11天檢出陽(yáng)性，在第17天出現(xiàn)陰性“波谷”，然后又開(kāi)始上升，至第21天檢測(cè)為陽(yáng)性，之后維持在較高IgM抗體水平，至第45天出現(xiàn)陽(yáng)性高峰。具體變化曲線見(jiàn)圖2。

圖2　應(yīng)用30 h ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體

3.1.3Ad3 ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第8天、第14天和第21～26天，血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性，其余均為陰性。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第5～8天，血清IgM抗體呈陽(yáng)性，第11～14天血清IgM抗體水平處于陽(yáng)性臨界值邊緣，第17天處于陰性“波谷”，第35天時(shí)呈弱陽(yáng)性，第45天出現(xiàn)陰性“波谷”，在第60天又重新檢測(cè)到較高水平的IgM抗體。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，感染后5～11 d即可檢測(cè)到IgM抗體，且第5天處于高峰，之后下降，第14～17天為陰性，第21天出現(xiàn)陽(yáng)性“波峰”，隨后在第26天出現(xiàn)陰性“波谷”，其余時(shí)間均為弱陽(yáng)性或陽(yáng)性，且在第35天后血清IgM抗體水平呈上升趨勢(shì)。具體變化曲線見(jiàn)圖3。

3.1.4Ad6+NBL ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，僅在感染后第45天血清IgM抗體水平略高于臨界值。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第8～14天血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性，第21天出現(xiàn)陰性“波谷”，第35天又處于陽(yáng)性“波峰”，第45天又出現(xiàn)陰性“波谷”，隨后呈上升趨勢(shì)，直至第60天達(dá)到較高陽(yáng)性水平。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第14天血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性，第17天處于陰性“波谷”，第35天檢測(cè)到陽(yáng)性，第45天出現(xiàn)陽(yáng)性高峰，之后下降，但在第60天血清中的IgM抗體仍為陽(yáng)性。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第8～11天和第21天血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性，第14天血清IgM抗體接近陽(yáng)性臨界值，第26天出現(xiàn)陰性“波谷”，第35天接近陽(yáng)性臨界值，第45～60天呈陽(yáng)性且處于較高水平。具體變化曲線見(jiàn)圖4。

圖3　應(yīng)用Ad3 ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體

圖4　應(yīng)用Ad6+NBL ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體

3.1.5ML ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，僅在感染后第14天和第26天檢測(cè)到血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性，其余均為陰性。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第5～8天檢測(cè)出血清IgM抗體陽(yáng)性，第14天呈弱陽(yáng)性，第35天血清IgM水平接近陽(yáng)性臨界值，第45天處于陰性“波谷”，之后開(kāi)始上升，第60天檢測(cè)到較高水平的抗體陽(yáng)性。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第14天血清IgM抗體接近陽(yáng)性臨界值，然后開(kāi)始下降，第17天出現(xiàn)陰性“波谷”，第21天接近陽(yáng)性臨界值，第26～45天血清IgM抗體呈陽(yáng)性，推測(cè)在第40天左右出現(xiàn)陽(yáng)性高峰，之后下降，第60天趨于陽(yáng)性臨界值。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第5天、第21天和第35出現(xiàn)抗體陽(yáng)性高峰，35天之后維持在原有的陽(yáng)性水平，第8天、第17天和第26出現(xiàn)陰性“波谷”，第11～14天血清IgM抗體呈弱陽(yáng)性或僅接近陽(yáng)性臨界值。具體變化曲線見(jiàn)圖5。

圖5　應(yīng)用ML ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgM抗體

3.2旋毛蟲(chóng)不同劑量感染豬血清中IgG抗體水平分別利用Ad3、Ad6+NBL和ML的ES抗原檢測(cè)豬感染不同劑量旋毛蟲(chóng)至60天血清中IgG的變化情況。

3.2.1Ad3 ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天血清IgG抗體水平呈陽(yáng)性，但高峰推測(cè)出現(xiàn)在第42天左右，之后下降，但至第60天仍為陽(yáng)性。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天血清IgG水平接近陽(yáng)性臨界值，第45～60天血清IgG抗體呈陽(yáng)性，且持續(xù)上升。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第8天和第14天血清IgG抗體接近陽(yáng)性臨界值，第35-60天血清IgG抗體呈陽(yáng)性，且保持在較高水平。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第26天IgG抗體呈弱陽(yáng)性，然后緩慢上升，至第60天達(dá)到較高的IgG抗體水平。具體變化曲線見(jiàn)圖6。

3.2.2Ad6+NBL ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條和75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第45天IgG抗體開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性，并持續(xù)上升，至第60天仍保持在較高的陽(yáng)性水平。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天IgG抗體略高于陽(yáng)性臨界值，然后持續(xù)上升，至第60天仍保持在較高的陽(yáng)性水平。具體變化曲線見(jiàn)圖7。

圖6　應(yīng)用Ad3 ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgG抗體

圖7　應(yīng)用Ad6+NBL ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgG抗體

3.2.3ML ES抗原檢測(cè)結(jié)果。感染50條肌幼蟲(chóng)的豬血清，全部為陰性。感染75條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天開(kāi)始檢測(cè)出IgG抗體陽(yáng)性，后一直持續(xù)到第60天，且呈上升趨勢(shì)。感染150條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第45天開(kāi)始出現(xiàn)IgG抗體陽(yáng)性，并緩慢上升，至第60天仍保持在較高陽(yáng)性水平。感染1 000條肌幼蟲(chóng)的豬血清，在感染后第35天出現(xiàn)IgG抗體陽(yáng)性，至第60天仍保持在較高陽(yáng)性水平，但呈緩慢下降趨勢(shì)。具體變化曲線見(jiàn)圖8。

圖8　應(yīng)用ML ES抗原檢測(cè)豬血清抗旋毛蟲(chóng)IgG抗體

4 討論

我國(guó)是世界上受旋毛蟲(chóng)病危害最為嚴(yán)重的少數(shù)幾個(gè)國(guó)家之一。旋毛蟲(chóng)病被列為重要的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，而且也是進(jìn)出口肉類(lèi)、屠宰動(dòng)物以及我國(guó)政府提出的“放心肉”首檢和必檢的食源性人獸共患?。?1-12］。

在單宿主物種中，對(duì)于旋毛蟲(chóng)的生活周期而言，主要有ML、Ad、NBL三個(gè)抗原階段［13］。它們表達(dá)多種免疫原性蛋白，這些蛋白可引起宿主的保護(hù)性反應(yīng)，并且可用于診斷人和動(dòng)物感染旋毛蟲(chóng)的診斷。目前研究顯示使用SDS-PAGE和免疫印跡法［14-15］，已確定旋毛蟲(chóng)ML、Ad和NBL抗原可被實(shí)驗(yàn)感染旋毛蟲(chóng)的豬的抗體所識(shí)別。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有感染豬進(jìn)行剖殺，對(duì)每頭豬胴體的18個(gè)不同部位分別取樣（50g）鏡檢及用消化法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位均存在不同數(shù)量的感染蟲(chóng)體，且豬只之間無(wú)顯著個(gè)體差異。此結(jié)果表明本研究中的感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法與感染劑量準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

本研究結(jié)果表明：對(duì)于低劑量感染（50條）的豬，可應(yīng)用10 h ES檢測(cè)感染后第14天和第26天的血清IgM抗體；對(duì)于感染75～150條旋毛蟲(chóng)體的豬，應(yīng)用10 h、30 h和ML ES抗原的混合物進(jìn)行檢測(cè)效果較好（可檢測(cè)出感染后第5～26天的血清IgM抗體）；對(duì)于感染1 000條旋毛蟲(chóng)體的豬，早期10 h ES抗原除在感染后第5天和第17天外，其余時(shí)間均可檢測(cè)出血清IgM陽(yáng)性抗體。此研究為解決旋毛蟲(chóng)診斷盲區(qū)（感染后第14～19天）提供了重要的參考。而對(duì)于IgG檢測(cè)，應(yīng)用Ad3 ES抗原檢測(cè)的效果相對(duì)較好。應(yīng)用ML ES抗原檢測(cè)血清IgM或IgG抗體水平，其吸光度值均非常高。

因此可利用旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的分泌物抗原混合物（至少3種ES：10 h、Ad3、ML）來(lái)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染。對(duì)于臨床出欄豬的早期檢測(cè)與診斷，應(yīng)用10 h ES，以檢測(cè)血清IgM抗體為主，輔之檢測(cè)血清IgG抗體（IgG抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且較穩(wěn)定），效果較好。感染旋毛蟲(chóng)35天前，可混合應(yīng)用腸道期10 h的肌幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)的ES抗原（即10 h ES+Ad3 ES+ML ES）來(lái)檢測(cè)血清中的IgM抗體，包括診斷盲區(qū)（感染后第15～30天）的檢測(cè)；感染旋毛蟲(chóng)35天后，混合應(yīng)用成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)的ES抗原（即Ad3 ES+ML ES）來(lái)檢測(cè)血清中IgG抗體。由于單一時(shí)期的抗原敏感性不足，無(wú)法有效應(yīng)用于旋毛蟲(chóng)的血清學(xué)檢測(cè)，因此結(jié)合旋毛蟲(chóng)的生活史及其在宿主體內(nèi)排泄分泌物的變化情況，需要聯(lián)合應(yīng)用至少2種以上抗原來(lái)提高檢測(cè)敏感性，而不同種抗原如何配比檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的感染仍有待于進(jìn)一步探索和研究。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Application Research for Trichinella spiralis Excretory-secretory Antigens from Different Growth Stages in Immunologic Diagnosis

Wu Xiuping1，2，Sun Zhaojin1，2，Zhai Chengcheng1，Liu Xiaolei2，Tang Bin2，Liu Mingyuan2
（1. National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，WHO Collaborating Center for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025；2. Institute of Zoonoses，Key Laboratory of Zoonoses of Ministry of Education，Jinlin University，Changchun，Jilin 130062）

［Objective］To systematically understand and compare the immunological characters of the Trichinella spiralis excretory-secretory（ES）antigens from different growth stages，so as to explore the serological diagnosis techniques which could be applied to slaughter pigs infected with Trichinella spiralis. ［Methods］ES antigens from 10-hour muscle larvae at intestinal stage（10 h ML），30-hour adult at intestinal stage（30 h Ad），3-day adult at adult stage（Ad3），6-day adult and newborn larvae stage（Ad6+NBL），and muscle larvae（ML）of T.spiralis were used as coating antigen，then the serum of infected pigs in different days within two months was collected and the IgM and IgG antibodies against Trichinella were detected by ELISA. At last，dynamical change curves of antibodies were drawn and data analysis was made. ［Results］ 10 h ML and ML ES antigens could be used to detect the anti-TrichinellaIgM antibodies from serum of pigs injected by different doses within 35 days after infection，low-dose infection can be detected in about 10 days and the high-dose infection in about 5 days，and Ad3 ES antigens could be applied to detect IgM antibodies when the infection dose was high；ES antigens from Ad3 and ML can be used to detect the anti-Trichinella IgG antibodies from serum of pigs injected by different doses over 35 days after infection，it's worth noting that detection effect by Ad3 ES was better than that of ML ES. ［Conclusion］The 10 h ML ES，Ad3 ES and ML ES can be used as coating antigens to detect early infection with Trichinella spiralis，Ad3 ES and ML ES antigens can be used to detect Trichinella spiralis infection in slaughter pigs. This study provided reference and theoretical basis for the suffi cient utilization of ES in different stages and for the establishment of a reasonable and effective method towards Trichinella spiralis detection.

Trichinella spiralis；excretory-secretory；pig serum；ELISA

1005-944X（2016）10-0079-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.021

國(guó)家自然科學(xué)基金（NSFC31030064）

劉明遠(yuǎn)