豬瘟兔化弱毒間接免疫熒光鑒定方法的建立

牛成明，姚　靜，楊靈芝，楊　琴，馬景霞，朱　杰

（1. 山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州　256606；2. 山東省動物病原微生物工程實驗室，山東濱州　256606；3. 濱州出入境檢驗檢疫局，山東濱州　256603；4. 山東濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州　256600）

豬瘟兔化弱毒間接免疫熒光鑒定方法的建立

牛成明1，2，姚靜3，楊靈芝1，2，楊琴1，2，馬景霞4，朱杰

（1. 山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州256606；2. 山東省動物病原微生物工程實驗室，山東濱州256606；3. 濱州出入境檢驗檢疫局，山東濱州256603；4. 山東濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州256600）

為快速有效測定豬瘟疫苗病毒含量，建立了豬瘟兔化弱毒（HCLV）間接免疫熒光試驗（IFA）方法，并與兔體定型熱試驗方法進行了初步比較。試驗結果表明，以冷甲醇固定ST細胞，將所選豬瘟活疫苗檢驗用陽性血清1∶40倍稀釋、熒光二抗1∶32倍稀釋時，IFA檢測HCLV感染的ST細胞清晰、特異，檢測豬偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒感染細胞陰性。對不同豬瘟疫苗半成品的檢測結果顯示，IFA測定半數組織感染量（TCID50）與兔體定型熱試驗測定兔體感染量（RID）具有較好的相關性，其擬合曲線為RID/mL=2.783TCID50/mL +110107.213。

豬瘟兔化弱毒（HCLV）；間接免疫熒光試驗；兔體感染量

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical Swi ne Fever Virus，CSFV）引起的一種急性、高度接觸性、致死性疾病，在世界許多國家、地區(qū)均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失［1-2］。目前，控制和預 防豬瘟的主要手段仍然是疫苗免疫。我國的豬瘟兔化弱毒活疫苗（HCLV）是世界公認的、最好的豬瘟疫苗，對世界豬瘟的預防和控制起到了巨大作用［3］。許多國家和地區(qū)利用該疫苗消滅了豬瘟。豬瘟疫苗的質量是決定免疫效果，乃至豬瘟防控成效的關鍵因素。而疫苗中有效病毒含量，是決定疫苗質量的重要指標。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗病毒含量的測定方法為兔體定型熱試驗方法［4］。該法檢測成本高、結果可重復性差、檢驗周期長，易受動物因素制約，且費時、費力，存在一定的局限性。因此，建立一種合理有效、快速準確的豬瘟疫苗檢測方法，對于提高疫苗的檢驗水平，保證疫苗的質量尤為必要。針對上述問題，本研究建立了豬瘟兔化弱毒的間接免疫熒光試驗方法（Indirect immunofl uorescence assay，IFA），用于豬瘟疫苗病毒含量的快速測定。

1　材料與方法

1.1材料

豬瘟兔化弱毒細胞毒：本實驗室制備，PCR檢測無外源病毒污染，-70 ℃保存；豬偽狂犬病毒（PRV Bathar-K61）、豬傳染性胃腸炎病毒（ TGEV華毒株）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV CV777）：本試驗 室擴繁保存；ST細胞：濟南勁牛生物科技有限公司惠贈，本試驗室擴繁凍存。

豬瘟活疫苗檢驗用陽性血清：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟單克隆抗體（A）、豬瘟高免血清（B）、豬 瘟特異性血清（C）：本實驗室保存；FITC標記兔抗豬IgG熒光二抗：購自Sigma公司， 利用PBS稀釋32倍使用；FITC標記羊抗鼠熒光二抗：購自KPL公司，PBS稀釋100倍使用；豬瘟專用新生牛血清：購自濟南勁牛生物科技有限公司；MEM：購自北京清大天一科技有限公司；胰酶：購自Gibco公司。其它試劑：滅菌PBS、-20 ℃預冷的甲醇、-20 ℃預冷的丙酮等。

1.2豬瘟病毒培養(yǎng)（同步接毒法）

將長滿單層的ST細胞消化，按照1∶3比例傳代，同時按照1/10接毒劑量同步接毒，置37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72～96 h。單層長滿后，將細胞按1∶2比例帶毒傳代，鋪96孔板，同時設不接毒對照，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h。

1.3間接免疫熒光試驗（IFA）

將96孔板已接毒ST細胞棄去培養(yǎng)液， PBS洗3次，-20 ℃預冷的有機溶劑2～8 ℃固定25 min，棄去有機溶劑，自然揮干。每孔滴加PBS稀釋的豬瘟抗體，45 μL/孔，37 ℃溫箱作用50 min，同時設陰性對照（非接毒ST細胞加一抗）、空白對照（接毒ST細胞加PBS）。PBS洗3次，每孔加PBS稀釋的FITC標記的熒光二抗，40 μL/孔，37 ℃溫箱避光作用40 min。PBS洗3次，熒光顯微鏡鏡檢。

1.4IFA試驗條件優(yōu)化

1.4.1不同有機溶劑的選擇。參照文 獻［5］，分別選用-20 ℃預冷的甲醇、丙酮、80%丙酮溶液、6∶4的丙酮乙醇溶液、1∶1的甲醇丙酮溶液，對單層長滿的接毒ST細胞4 ℃固定25 min，分別從使用的方便性、固定效果和IFA熒光染色亮度，對有機溶劑的細胞固定效果進行評價。

1.4.2IFA一抗的篩選。選取96孔板接毒ST細胞，按照1.4.1中優(yōu)選的固定溶劑進行固定。將豬瘟單克隆抗體（A）、豬瘟高免血清（B）、豬瘟特異性血清（C）分別稀釋50倍、100倍和50倍，將豬瘟活疫苗檢驗用陽性血清稀釋2 0倍，分別加入到細胞板不同孔中，進行IFA試驗，并設PBS空白對照，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.4.3豬瘟活疫苗檢驗用陽性血清最適工作濃度的確定。選取96孔板接毒ST細胞，按照1.4.1中優(yōu)選的固定溶劑進行固定。將豬瘟陽性血清進行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋，依次加入到細胞培養(yǎng)板，進行IFA試驗。熒光二抗的濃度按照說明書，1∶32倍稀釋使用。選取熒光清晰明亮的陽性血清最大稀釋倍數作為最適工作濃度。同時，設陰性和空白對照。

1.4.4最佳染色時間確定。將長滿單層的ST細胞按照1∶2傳代，鋪6塊96孔板，同時按照10 μL/孔接毒劑量同步接毒，并設陰性對照。分別于接毒后24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h，對96孔板上ST細胞進行固定，并進行IFA染色，根據熒光斑大小和染色亮度進行結果判定。

1.5IFA特異性試驗

1.5.1不同病毒抗原交叉反應試驗。將96孔板上單層長至80%的ST細胞接種HCLV，接毒劑量為10 μL/孔；48 h后將未接種HCLV的細胞分別接PRV、TGEV、PEDV，接毒劑量為10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2溫箱再培養(yǎng)24 h，并設正常細胞對照。然后按照豬瘟陽性血清和FITC標記兔抗豬IgG熒光二抗最適工作濃度進行IFA試驗，觀察是否存在交叉反應，以確定本方法的特異性。

1.5.2FITC標記兔抗豬IgG熒光二抗特異性試驗。按照1.5.1方法進行HCLV培養(yǎng)，以PBS代替豬瘟陽性血清，按照FITC標記兔IgG抗豬熒光二抗最適工作濃度進行IFA試驗，并設未加二抗的病毒對照和正常細胞對照，觀察有無非特異性熒光產生。1.6 豬瘟疫苗樣品毒價測定。利用上述IFA方法，對牛睪丸細胞制備的豬瘟疫苗半成品（PCR檢測無外源病毒污染）進行毒價測定，并利用SPSS進行回歸分析，建立TCID50與兔體感染量（Rabbit infection dose， RID）之間的線性關系。

2　結果

2.1IFA試驗條件優(yōu)化

2.1.1不同有機溶劑的選擇。從細胞固定效果來看，甲醇腐蝕性較小，固定后細胞形態(tài)較為完整；從染色亮度來看，甲醇、丙酮和丙酮溶液IFA染色亮度略好于其他有機溶劑；從使用的方便性來看，甲醇較好，且甲醇比丙酮對操作者呼吸道刺激小。綜合考慮，選取冷甲醇對細胞進行固定最佳。不同有機溶劑對豬瘟接毒ST細胞的固定效果如圖1所示。

圖1　不同有機溶劑對接種豬瘟的ST細胞的固定效果

2.1.2IFA一抗的篩選。鏡檢結果顯示，豬瘟活疫苗檢驗用陽性血清染色效果較好，胞漿染色明顯，細胞形態(tài)清晰，熒光亮度較好，其它一抗染色效果則較差。如圖2所示。

2.1.3豬瘟活 疫苗檢驗用陽性血清最適工作濃度的確定。 根據鏡檢結果，當一抗?jié)舛仍?∶20～1∶640時，均可觀察到特異性熒光，但熒光亮度從1∶80倍開始逐漸減弱，為保證每次染色效果及試驗的可重復性，選取1∶40倍稀釋作為一抗最適工作濃度。IFA染色結果如圖3所示。

圖2　不同一抗IFA染色結果

圖3　一抗不同稀釋倍數IFA染色結果

2.1.4最佳染色時間的確定。根據IFA染色結果，接毒后24 h未見特異性熒光；接毒后36 h、48 h可見較小的特異性熒光斑；接毒后72 h，熒光達到最亮；接毒后96 h，熒光亮度略有下降，且死細胞有所增加。因此，最佳染色時間定在接毒后72～96 h。不同時間IFA染色效果如圖4所示。

圖4　接豬瘟病毒后不同時間IFA染色結果

2.2IFA特異性試驗

2.2.1不同病毒抗原交叉反應試驗。鏡檢結果顯示，接種HCLV、PRV、TGEV、PEDV的ST細胞進行IFA，除接種HCLV的ST細胞具有明顯特異性的綠色熒光外，接種其他3種病毒的ST細胞均未見特異性熒光染色，表明所建立的HCLV IFA檢測方法與其他病毒感染細胞無交叉反應，具有較好的特異性。PRV、TGEV、PEDV感染細胞IFA染色結果如圖5所示。

圖5　不同病毒接ST細胞IFA染色結果

2.2.2FITC標記兔抗豬IgG熒光二抗特異性試驗。鏡檢結果顯示，PBS取代一抗進行IFA試驗，無特異性熒光，表明二抗具有較好的特異性。

2.3豬瘟疫苗半成品毒價測定結果。利用所建立的IFA方法，對牛睪丸細胞制備的豬瘟疫苗半成品進行毒價測定，并利用SPSS建立TCID50與RID之間的擬合線性回歸方程，R2=0.996，線性關系較好，其數量關系為y=2.783x+110 107.213，即RID/ mL=2.783TCID50/mL +110 107.213具體結果見表1。

表1　豬瘟疫苗半成品毒價測定結果

3　討論

豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）是我國研制的優(yōu)秀疫苗，是國家豬病防治計劃中強制免疫所用疫苗，對于我國豬瘟的防控起著重要作用。目前，商品化的豬瘟疫苗品類較多，包括乳兔組織苗、脾淋苗、細胞苗，并以細胞苗占據主導地位。不同疫苗之間效價差別較大，給豬瘟疫苗質量控制，包括病毒含量測定帶來諸多不便。因此，建立豬瘟疫苗的快速檢測方法尤為必要。

HCLV在多種細胞上增殖，包括牛睪丸細胞、ST細胞、PK15細胞等，但不引起細胞病變。除傳統(tǒng)的RID的方法外，科研人員還建立了其他一些快速檢測方法，如RT-PCR方法、實時熒光定量RT-PCR方法［6-7］、ELISA方法［8］等，也進一步探索了這些方法與RID之間的關系，但由于無法反映有效病毒含量，無法有效推廣。隨著HCLV抗體技術的發(fā)展，單克隆抗體、兔源陽性血清等被應用于IFA方法中［9-10］。該方法可檢測豬瘟疫苗中有效病毒含量，可重復性好，可替代RID方法，成為HCLV病毒含量測定方法，為進一步控制和提高豬瘟疫苗質量奠定了基礎。

本研究建立的IFA方法，進一步明確了細胞固定所用的有機溶劑，并且所選一抗為疫苗檢驗用標準陽性血清，具有 標準的制備方法，可進一步降低檢測費用。在以PCR方法進行特異性檢測的同時，利用 該法對商品化豬瘟疫苗進行病毒含量的測定，與RID效價具有較好的線性關系，為該方法的應用進一步奠定了基礎。

［1］ 斯特勞，阿萊爾，蒙家林，等. 豬病學［M］. 趙德明，張仲秋，沈建忠，等譯. 9版. 北京：中國農業(yè)大學出版社，2008.

［2］ Edwards S，Fukusho A，Lefèvre P C，et al. Classical swine fever： the global situation ［J］. Vet Microbiol， 2000，73（2/3）：103-119.

［3］ 仇華吉，童光志，沈榮顯. 豬瘟兔化弱毒疫苗——半個世紀的回顧［J］. 中國農業(yè)科學，2005（8）：1675-1685.

［4］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典：2010年版三部［M］. 北京：中國農業(yè)出版社，2010.

［5］ 崔尚金，全滟平，李曦，等. 豬圓環(huán)病毒間接免疫熒光方法的建立［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2007（1）：63-66.

［6］ 鄧力，張彥明，李維維，等. 豬瘟兔化弱毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2011（2）：1-8.

［7］ 葛葉，張興娟，朱慶虎，等. 熒光定量RT-PCR方法與兔體定型熱試驗對于檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的平行關系［J］. 中國預防獸醫(yī)學報，2011（9）：699-703.

［8］ 唐紅慧，杜希珍，劉大偉，等. 應用豬瘟抗原/血清ELISA測定豬瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量［J］. 金陵科技學院學報，2010（4）：73-78.

［9］ 李晶梅，朱薇，秦紅剛，等. IFA和IPMA方法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量［J］. 中國獸藥雜志，2013（10）：35-38.

［10］ 戴志紅，蔣卉，李翠，等. 用間接免疫熒光檢測方法評價豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究［J］. 中國獸藥雜志，2014（1）34-37.

（責任編輯：朱迪國）

Establishment of an Indirect Immunofl uorescence Assay for HCLV Titer Detection

Niu Chengming1，2，Yao Jing3，Yang Lingzhi1，2，Yang Qin1，2，Ma Jingxia4，Zhu Jie
（1. Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256606；2. Shandong Engineering Laboratory of Animal Pathogenic Microbiology，Binzhou，Shandong 256606；3. Binzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Binzhou，Shandong 256603；4. Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Binzhou，Shandong 256600）

An indirect immunofluorescence assay（IFA）was developed for detecting HCLV titer rapidly and effectively by using the positive serum of classical swine fever（CSF）as the first antibody and the fluorescein isothiocyanated（FITC）labeled rabbit anti-pig IgG as the second antibody. Results showed the optimum working concentration of the fi rst antibody was 1∶40，and the dilution ratio of second antibody was 1∶32. The IFA displayed clear and specifi c fl uorescence in ST cells inoculated with hog cholera lapinized virus（HCLV）utilizing the above mentioned method，while negative results were obtained in ST cells inoculated with pseudorabies virus （PRV），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. Detection for different CSF semi-finished vaccines showed good correlation between Rabbit infection dose（RID）tested with rabbits and 50% tissue culture infective dose（TCID50）tested with IFA，and the fitted curve was RID/mL=2.783TCID50/ mL+110107.213.

hog cholera lapinized virus（HCLV）；indirect immunofl uorescence assay；rabbit infection dose

S851.3

B

1005-944X（2016）10-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.022