大連市零售豬肉中沙門氏菌的耐藥性檢測與分析

杜雄偉，張珂琪，李　焱，唐文彥，耿亞娟，王婭君，王佳碩

（1.大連民族大學，遼寧大連　116600；2. 四平市職業(yè)技術教育中心，吉林四平　136000）

大連市零售豬肉中沙門氏菌的耐藥性檢測與分析

杜雄偉1，張珂琪2，李焱1，唐文彥1，耿亞娟1，王婭君1，王佳碩1

（1.大連民族大學，遼寧大連116600；2. 四平市職業(yè)技術教育中心，吉林四平136000）

［目的］為了解遼寧省大連市生鮮豬肉中沙門氏菌的污染與耐藥情況。［方法］采集該市生鮮豬肉78份，用選擇性培養(yǎng)基分離沙門氏菌并劃線純化，通過invA序列對菌株進行鑒定，利用紙片瓊脂擴散法（K-B法）檢測其對12種抗生素的耐藥性。［結果］共得到15株沙門氏菌，檢出率為19.23%。分離的沙門氏菌對12種抗生素的耐藥率在0～73.3%之間。其中，對硫酸慶大霉素的耐藥率最高，為73.3%；對其他抗菌藥物的耐藥率依次是鹽酸諾氟沙星（60%）、氟苯尼考和鹽酸環(huán)丙沙星（均為53.3%）、阿莫西林（13.3%）、頭孢噻吩、頭孢噻肟、氨芐西林（均為6.7%），頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南（均為0）。共產生10種耐藥譜。［結論］大連市開發(fā)區(qū)的超市和農貿市場沙門氏菌污染率較高，并且沙門氏菌對多種抗生素表現(xiàn)出多重耐藥譜，應給予重視。

零售豬肉；沙門氏菌；耐藥性

在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗生素不僅用于控制和治療疾病，還常用來提高動物抗病力、促進動物生長等［1］。但是由于有些養(yǎng)殖戶濫用抗菌藥物，導致細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重、耐藥譜越來越廣。通過耐藥性試驗，調查沙門氏菌的耐藥譜，為臨床醫(yī)學治療中抗生素的合理使用提供基礎數據，對食品安全具有重要意義。孫曉林等［2］對蘭州市肉與肉制品微生物污染狀況進行研究，結果表明肉樣沙門氏菌檢出率為 14%；楊保偉等［3］檢測陜西部分地區(qū)食品中沙門氏菌污染情況，結果表明沙門氏菌在豬肉中檢出率為19.4%；洪文展等［4］發(fā)現(xiàn)深圳市售肉品沙門氏菌污染率為26.2%。本研究通過對遼寧省大連市豬源性沙門氏菌進行分離鑒定，對12種抗生素進行藥敏性分析，旨在了解該地區(qū)沙門氏菌污染和耐藥情況，為確保食品安全奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。采集遼寧省大連市開發(fā)區(qū)各大超市和農貿市場的新鮮豬肉樣品78份。從這些樣品中共分離到15株沙門氏菌。耐藥性檢測質控菌株為E.coilATCC25922。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑。SS瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白（mueller-hinton，MH）液、固培養(yǎng)基購于北京奧特星生物有限公司；瓊脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTP 及分子質量標準DL2000購于大連寶生物公司。

1.1.3藥敏紙片。β-內酰胺類：頭孢曲松（CRO，30 μg/片），頭孢噻吩（KF，30 μg/片），頭孢噻肟（CTX，30 μg/片），頭孢他啶（CAE，30 μg/片），氨芐西林（AMP，10 μg/片），氨曲南（ATM，35 μg/片），亞胺培南（IPM，10 μg/片），阿莫西林（AMO，10 μg/片）。氯霉素類：氟苯尼考（FLO，30 μg/片）。氨基糖苷類：硫酸慶大霉素（GEN，10 μg/片）。喹諾酮類：鹽酸諾氟沙星（NIA，5 μg/片），鹽酸環(huán)丙沙星（CH，5 μg/片）。以上12種藥敏紙片，購于杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1采樣。每個采集點采集少量新鮮豬肉，無菌封好后放置于保鮮袋內帶回實驗室，在無菌條件下，用經酒精燈消毒的鑷子和手術刀按編號取少量樣本，剪碎后移入裝有營養(yǎng)肉湯的試管內，置于搖床中37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2選擇性培養(yǎng)與增菌。經過液體培養(yǎng)后的樣品前增菌液經過平板劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，置于（36±1） ℃下倒置培養(yǎng)18～24 h［5］。根據菌落形態(tài)，挑取沙門氏菌可疑菌落。將實驗待檢測菌株與陽性菌株劃線接種于SS斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；再從培養(yǎng)基上用滅菌的接種環(huán)挑取一環(huán)菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上進行劃線，37 ℃恒溫條件培養(yǎng)24 h，以分離單菌落。

1.2.3PCR方法。將純化的單菌落接種于裝有滅菌營養(yǎng)肉湯的1 mL EP管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，12 000 r/min離心培養(yǎng)好的菌液3 min收集菌體，用移液槍吸取200 μL無菌水于EP管內，清洗兩次，再加入200 μL的無菌水。在水浴鍋內煮10 min，然后在冰塊里冷卻5 min，最后在10 000 r/min條件下離心5 min。取上清液于1 mL EP管中。擴增基因為invA基因，擴增片段長度為284 bp。PCR擴增體系25 μL， ExTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTPMixture（各2.5 mM）2 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O加至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應完成后，進行電泳實驗。

1.2.4藥敏試驗。采用紙片瓊脂擴散法（K-B法），從平板上挑取單個菌落接種于3 mL MHB［7］，35 ℃培養(yǎng)6～8 h，用生理鹽水（0.89% NaCl）校正濃度至0.5麥氏比濁，用無菌拭子蘸取菌液，涂布MHA平板，平板在室溫下干燥5 min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼瓊脂表面，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，量取抑菌圈直徑。大腸埃希氏菌ATCC25922作為質控菌株，參照M100-S20標準［8］判斷敏感（S）、中介（I）和耐藥（R），根據藥敏實驗結果，分析病原菌的耐藥譜。

2　結果與分析

2.1鮮豬肉樣品沙門氏菌的分離鑒定結果

由表1可知，所采集的鮮豬肉樣品共分離出15株沙門氏菌，可見大連市開發(fā)區(qū)的超市和農貿市場沙門氏菌污染率較高，為19.23%。

表1　不同來源樣品中中沙門氏菌的分離情況

2.2 豬源沙門氏菌的耐藥性

由表2可知，15株沙門氏菌對各種抗生素的耐藥率為0～73.3%。其中對GEN的耐藥率最高，為73.3%；對其他抗菌藥物的耐藥率大小依次是NIA（60%）＞PLO、CH（同為53.3%）＞AMO（13.3%）＞KF、CTX、AMP（同為6.7%）；對KF、CTX、AMP的耐藥率均為6.7%，敏感性達到70%以上；對CRO、CAE、ATM、IPM的耐藥性均為0，敏感性達到90%以上。這些藥物對沙門氏菌都有極強的抗菌作用。從抗生素大類來看，耐藥率依次是：氨基糖苷類（73.3%）＞喹諾酮類（53.3%～60%）＞氯霉素類（53.3%）＞β-內酰胺類（0～13.3%）。

表2　豬源沙門氏菌耐藥率

2.3豬源沙門氏菌多重耐藥譜

分離得到的15株沙門氏菌的耐藥性情況如表3所示，15株沙門氏菌產生了10種耐藥譜，15株沙門氏菌中14株具有耐藥性，其中11株至少耐受2種抗生素，8株至少耐受3種抗生素。個別菌株可耐受4種以上抗生素。

表3　沙門氏菌的耐藥譜

3　討論

采集鮮豬肉樣品共78份，獲得沙門氏菌15株，檢出率為19.23%。研究結果表明，大連地區(qū)鮮豬肉污染較為嚴重，沙門氏菌檢出率較高，應對市場流通的鮮肉產品引起足夠的重視，加強豬肉屠宰、運輸、加工、貯存及銷售等環(huán)節(jié)的管理，防止病原菌污染。

豬源沙門氏菌表現(xiàn)出一定的耐藥性，對各種抗生素的耐藥率在0～73.3%，其中對GEN、NIA、PLO、CH、AMO耐藥率最高，依次是73.3%、60%、53.3%、53.3%、13.3%。本項研究分離的15株沙門氏菌共產生10種耐藥譜，3耐以上菌株占53.3%。狄文婷等［9］對12株豬源沙門氏菌進行了藥敏試驗，結果有11株（83.3%）至少可以耐受1種抗菌藥物，其中9株（75%）至少耐受4種抗生素。馬孟根等［10］對30 株豬源致病性沙門氏菌進行了藥敏實驗，結果有28 株菌（93.3%）至少對1種藥物有耐藥性。李郁［11］對合肥市屠宰生豬沙門氏菌耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)74.3%的沙門氏菌對至少1種抗生素產生耐藥性，64.7%的菌株為多重耐藥。以上結果表明，多重耐藥豬肉源沙門氏菌的出現(xiàn)已經成為普遍現(xiàn)象［12-13］，應引起足夠重視，注意在肉類食品流通環(huán)節(jié)中的消毒衛(wèi)生，以降低此類菌感染人的風險，保證人類的健康。四大類抗生素中，沙門氏菌對β-內酰胺類具有很高的敏感性，說明這些藥物對沙門氏菌都有極強的抗菌作用，可作為臨床治療中抗生素的選擇依據。

［1］ 萬建美，呂林，李素芬，等. 抗生素對肉雞生長屠宰性能和肉品質的影響［J］. 中國畜牧雜志，2010，46（1）：48-52.

［2］ 孫曉林，許敬東，馬軍武，等. 蘭州市肉與肉制品微生物污染狀況的研究［J］. 中國獸醫(yī)雜志，2008（3）：22-24.

［3］ 楊保偉. 食源性沙門氏菌特性及耐藥機制研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學，2010.

［4］ 洪文展. 市售肉品沙門氏菌污染狀況及防控措施［J］. 肉類衛(wèi)生，2005（4）：25-26.

［5］ 劉華偉，馬立農，郭藹光，等.畜禽及環(huán)境中沙門氏菌的PCR快速檢測與控制［J］.家畜生態(tài)學報，2005，26（2）：59-62.

［6］ Ranh K，De Grandis S A，Clarke R C，et al. Amplifi cationof an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as specific method of detection of Salmonella［J］. Mol Cell Probes，1992，6（4）：271-279.

［7］ 周庭銀，倪語星. 臨床微生物檢驗標準化操作［M］. 2版.上海：上?？萍汲霭嫔纾?010：251-252.

［8］ Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing：Twentieth Informational Supplement［M］. Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2010：40-48.

［9］ 狄文婷，杜雄偉，吳靜，等.豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析［J］.江蘇農業(yè)科學， 2014，42（10）：278-280.

［10］ 馬孟根，王紅寧，余勇，等. 豬源致病性沙門氏菌耐藥基因的分析［J］. 畜牧獸醫(yī)學報，2006，37（1）：65-70.

［11］ 李郁，焦新安，魏建忠. 屠宰生豬沙門氏菌分離株的血清型和藥物感受性分析［J］. 中國人獸共患病學報，2008，24（1）：67-70.

［12］ 譚炳乾. 耐氟喹諾酮類藥物豬源致病性沙門氏菌gyrA基因PCRRFLP及序列分析［D］. 雅安：四川農業(yè)大學，2002.

［13］ 周曉紅，孫明華，徐佩華，等. 生肉制品中沙門菌污染狀況及耐藥性分析［J］. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（12）：3425-3427.

（責任編輯：杜憲）

Antimicrobial Susceptibility Testing of Salmonella in Retail Pork in Dalian City

Du Xiongwei1，Zhang Keqi2，Li Yan1，Tang Wenyan1，Geng Yajuan1，Wang Yajun1，Wang Jiashuo1
（1. Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning 116600；2. Siping Vocational Education Center，Siping，Jilin 136000）

［Objective］To investigate and understand the contamination situation of Salmonella existed in fresh retail pork in Dalian city，as well as the drug resistance status. ［Methods］78 fresh pork samples in supermarkets were collected，then Salmonellas were isolated and purified by selective medium. After being identified by invA sequence analysis，the drug resistance of these Salmonella isolates to 12 kinds of antibiotics was detected by the disc agar diffusion method（K-B）. ［Results］The results showed that 15 Salmonella isolates were obtained with the detection rate of 19.23%. The resistance rate to antibiotics was in a range from 0 to 73.3%. 73.3% of the isolates were resistant to Gentamycin sulfate，and the resistance rate of other antibiotics decreased in the following order：norfl oxacin hydrochloride（60%）＞Florfenicol、Ciprofl oxacin Monohydrochloride（53.3%）＞Amoxicillin（13.3%）＞Cephalothin、 Cefotaxime、Ampicillin（6.7%）＞Ceftriaxone，Ceftazidime，Aztreonam，Imipenem（0），altogether 10 drug-resistance profiles were found. ［Conclusion］The Salmonella contamination was severe in the supermarkets and farmer's markets in the development zone of Dalian city，which also showed multi-resistant pattern. The results indicated suffi cient attention should be paid attention to the control of Salmonella.

retail pork；Salmonella；drug resistance

S852.61

B

1005-944X（2016）10-0023-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.10.006

大連金州新區(qū)科技計劃項目（KJCX-ZTPY-2014-0013）；大連市科技計劃項目（2014B11NC094）；中央高校自主基金項目（DC2015010020401）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）