綠色木霉纖維二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表達(dá)與鑒定

王翠艷，王玉華，樸春紅，劉俊梅，2，胡耀輝，任大勇，*，于寒松，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

綠色木霉纖維二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表達(dá)與鑒定

王翠艷1，王玉華1，樸春紅1，劉俊梅1，2，胡耀輝1，任大勇1，*，于寒松1，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.國(guó)家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

采用乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ的表達(dá)研究。參照GenBank上發(fā)表的綠色木霉（Trichoderma viride）cbhⅡ基因（GenBank登錄號(hào)：M55080）設(shè)計(jì)引物并通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆獲得其cDNA序列長(zhǎng)1 441 bp。為了達(dá)到表達(dá)分泌該酶的目的，在其基因上游序列前添加了大小為80 bp的信號(hào)肽序列。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)方法將密碼子按照乳酸菌的偏好性進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)全基因合成獲得了優(yōu)化后的cbhⅡ基因。將該基因與穿梭表達(dá)載體pMG36e連接， 構(gòu)建原核表達(dá)載體pMG36e-S-cbhⅡ；利用電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組乳酸菌，純化的重組菌蛋白通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，得到一條約為53 kD的目的蛋白條帶，與預(yù)期大小相符；利用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中水解纖維素酶的活力達(dá)到16.7 U/mL，菌體裂解液上清液和菌體沉淀幾乎沒(méi)有酶活力。結(jié)果表明，纖維二糖水解酶基因信號(hào)肽序列被乳酸乳球菌正確識(shí)別，并成功實(shí)現(xiàn)了胞外表達(dá)。

綠色木霉；纖維素酶；cbhⅡ基因；乳酸乳球菌；酶活力

纖維素酶主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶［1］。由于纖維素酶可以應(yīng)用于食品、紡織等行業(yè)，所以其產(chǎn)量的提高備受國(guó)內(nèi)外人士關(guān)注，它將是繼糖化酶、淀粉酶和蛋白酶后的第四大工業(yè)酶種，目前已在食品和環(huán)境行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用［2］。但是，由于纖維素酶很難提純，所以在實(shí)際應(yīng)用中還會(huì)含有一些其他的酶類物質(zhì)，比如半纖維素酶、蛋白酶等，且來(lái)自不同生物的纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能也不同［3］。目前由于真菌產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量多、活性高，所以在實(shí)際生產(chǎn)中用的多是真菌纖維素酶，但是真菌難培養(yǎng)、發(fā)酵周期長(zhǎng)、難以規(guī)模化，雖然細(xì)菌纖維素酶的產(chǎn)量與真菌相比有一定差距，但易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵時(shí)間短、穩(wěn)定［4-5］。因此，尋找適宜的方法克隆來(lái)源于真菌的纖維素酶基因到細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中，以便構(gòu)建兼?zhèn)浼?xì)菌易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快和真菌高纖維素酶活力優(yōu)點(diǎn)的工程菌。

目前，如何選育高產(chǎn)、高酶活力的工程菌成為纖維素酶基因工程的一個(gè)重要研究方向。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種高效纖維素降解菌，并克隆了纖維二糖水解酶基因cbhⅡ，進(jìn)而構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-S-cbhⅡ（S表示信號(hào)肽），得到了重組乳酸乳球菌纖維二糖水解酶基因工程菌。乳酸乳球菌是公認(rèn)的安全益生菌，廣泛存在于人體和動(dòng)物腸道，有利于人體和動(dòng)物的健康。本實(shí)驗(yàn)以乳酸乳球菌作為表達(dá)蛋白的受體菌，且由于在目的基因前添加了信號(hào)肽序列［6-8］，使該蛋白實(shí)現(xiàn)了胞外分泌，為后期的實(shí)驗(yàn)操作奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株及質(zhì)粒

乳酸乳球菌NZ3900、大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、表達(dá)載體pMG36e均由本實(shí)驗(yàn)室保存；纖維二糖水解酶基因cbhⅡ-S（S代表信號(hào)肽usp45）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1　pMG36e圖譜Fig.1　Map of expression vector pMG36e

1.1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基；M17肉湯培養(yǎng)基；GM17培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、葡萄糖5 g/L；GM17抗性培養(yǎng)基：在M17培養(yǎng)基中加入適量紅霉素貯存液，使其最終質(zhì)量濃度為20 μg/mL；GSGM17培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、蔗糖0.5 mol/L、甘氨酸25 g/L、葡萄糖5 g/L；GM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基：M17培養(yǎng)基、葡萄糖5 g/L、 MgCl220 mmol/L、CaCl22 mmol/L；溶液Ⅰ：0.5 mol/L蔗糖+100 mol/L甘油；溶液Ⅱ：0.5 mol/L蔗糖+100 mol/L 甘油+0.05 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）。

1.1.3工具酶和生化試劑

限制性內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質(zhì)、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、M17肉湯培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基成分、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tirs）、SDS、EDTA、溴化乙錠、水飽和酚、氯仿-異戊醇（49∶l，V/V）、丙酮 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

ECM399型電轉(zhuǎn)化儀 美國(guó)BTX公司；PCR儀美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器公司；垂直電泳槽、凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；HHF1-SE260電泳儀 北京中西化玻公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、分析天平 日本島津公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、干式恒溫器 杭州瑞誠(chéng)儀器公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋 上海茸研儀器公司；SW-CJIF超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司；infinite M200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；MDF-290A超低溫冰柜 日本三洋公司；高速冷凍離心機(jī) 上海離心機(jī)研究所。

1.3方法

1.3.1綠色木霉纖維素酶基因cbhⅡ的獲得

參照GenBank上發(fā)表的綠色木霉纖維素酶cbhⅡ基因（GenBank登錄號(hào)：M55080）設(shè)計(jì)引物并克隆獲得該基因的cDNA序列，通過(guò)生物信息學(xué)方法將密碼子按照乳酸菌的偏好性進(jìn)行優(yōu)化后［9-10］（http://www.jcat.de/），送生工生物工程（上海）股份有限公司，通過(guò)全基因合成方法獲得了優(yōu)化密碼子后的cbhⅡ基因，合成后經(jīng)寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序驗(yàn)證符合預(yù)期。

1.3.2纖維素酶基因cbhⅡ信號(hào)肽堿基序列的添加及酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

由于綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ在乳酸乳球菌中的表達(dá)是胞內(nèi)表達(dá)，而后續(xù)研究需要工程菌表達(dá)方式為胞外表達(dá)，所以將cbhⅡ基因序列在合成前添加了信號(hào)肽usp45的序列［11］；信號(hào)肽usp45在乳酸菌中的應(yīng)用已經(jīng)非常成熟，可以將外源基因進(jìn)行表達(dá)分泌。同時(shí)，為了將添加了信號(hào)肽序列的目的基因與穿梭表達(dá)載體pMG36e連接［12］，加入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)ClaⅠ和SphⅠ。

1.3.3引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已經(jīng)合成并測(cè)序正確的綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了引物Signal-cbhⅡ-Up：5’-ATGAAGAAAAA GATCATCAGTGCTATCTCA-3’和Signal-cbhⅡ-Down：5’-TTATAAAAATGATGGATTCGCATTT-3’，引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用ClaⅠ和SphⅠ分別對(duì)測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-S-cbhⅡ和表達(dá)載體pMG36e進(jìn)行雙酶切，分別回收目的條帶并純化，經(jīng)T4連接酶在16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、雙酶切法及基因測(cè)序進(jìn)行鑒定，將重組表達(dá)成功的質(zhì)粒命名為pMG36e-S-cbhⅡ。

1.3.5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

挑取乳酸乳球菌NZ3900劃線培養(yǎng)的單菌落接種于5 mL GM17液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h，然后參照Holo等［13］的方法，稍作修改，制備乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞；將測(cè)序正確的重組乳酸菌表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA，取1 μL加入到60 μL的感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻，然后轉(zhuǎn)入到已經(jīng)冰預(yù)冷的電擊杯中，5 ms電擊一次，電轉(zhuǎn)化條件為25 μF、2 020 V、200 Ω，然后迅速加入960 μL冰預(yù)冷的GM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下靜置復(fù)蘇培養(yǎng)2 h，再取適量的菌液涂布于具有紅霉素抗性的GM17固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24～48 h［14-15］，待單菌落長(zhǎng)出后，提取乳酸乳球菌質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

1.3.6重組質(zhì)粒在乳酸乳球菌中的表達(dá)及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)鑒定正確的乳酸乳球菌并按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于GM17培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)不同時(shí)間的重組菌的培養(yǎng)基，離心后獲得的上清液和經(jīng)超聲波裂解的菌體，分別采用SDS-PAGE方法及雙酶切進(jìn)行分析。

1.3.7重組乳酸乳球工程菌酶活力及菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別挑取已分離純化的單菌落至GM17液體培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)不同時(shí)間，分別收集經(jīng)離心后的發(fā)酵液上清液、菌體超聲裂解液上清液和菌體超聲裂解液沉淀，測(cè)定纖維素酶活力。測(cè)定方法：采用微晶纖維素作底物［16-17］，3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）測(cè)定纖維素酶活力［18-19］。酶活力單位的定義為：在pH 5、50 ℃條件下，30 min內(nèi)催化微晶纖維素水解生成1 μg葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。采用比濁法在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的平均光密度（OD600nm）值，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1綠色木霉纖維二糖水解酶cbhⅡ基因的獲得

圖2　合成基因ccbbhhⅡ的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　Agarose gel electrophoresis of synthetic cbhⅡgene

圖3　pMD18-T-S-cbh//PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3　Identification of the recombinant vector pMD18T-S-cbhⅡ by PCR and double enzyme digestion

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成經(jīng)密碼子優(yōu)化并添加信號(hào)肽的基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增及核苷酸序列測(cè)定后（圖2）可知合成基因大小為1 521 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示合成基因與設(shè)計(jì)的基因序列完全相符。將鑒定后序列完全正確的基因片段連接到pMD18-T克隆載體上，得到重組的克隆載體pMD18-T-S-cbhⅡ，轉(zhuǎn)入E. coli DH5α，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒采用ClaⅠ和SphⅠ雙酶切，PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，獲得的基因片段大小與預(yù)期大小相符，表明已將纖維二糖水解酶基因cbhⅡ-S與載體pMD18-T連接成功。

2.2重組乳酸乳球菌表達(dá)載體pMG36e-S-cbhⅡ的構(gòu)建及鑒定

將纖維素酶基因S-cbhⅡ與表達(dá)載體pMG36e連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMG36e-S-cbhⅡ，構(gòu)建結(jié)果如圖4所示。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)大腸桿菌克隆系統(tǒng)擴(kuò)增并重新提取質(zhì)粒后，經(jīng)過(guò)雙酶切和PCR擴(kuò)增分析，可見(jiàn)一條約為1 521 bp的條帶（圖5），條帶大小與預(yù)期一致。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建成了重組乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36e-S-cbhⅡ。

圖4　重組乳酸乳球菌表達(dá)載體pMG36e-S-cbhⅡ結(jié)構(gòu)Fig.4　Construction of expression vector pMG36e-S-cbhⅡ

圖5　重組表達(dá)載體pMG36e-S-cbhⅡ的鑒定結(jié)果Fig.5　Identification of the expression vector pMG36e-S-cbhⅡ

2.3重組乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子的鑒定

使用電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒pMG36e-S-cbhⅡ?qū)氲饺樗崛榍蚓鶱Z3900中，采用抗生素培養(yǎng)基篩選重組菌，結(jié)果見(jiàn)圖6。為了進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)過(guò)篩選的轉(zhuǎn)化子是否為假陽(yáng)性，提取篩選到的乳酸乳球菌質(zhì)粒DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示。以pMG36e-S-cbhⅡ/NZ3900質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及ClaⅠ、SphⅠ雙酶切后均得到一條大小約為1 521 bp的特異性條帶，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMG36e-S-cbhⅡ已成功轉(zhuǎn)入NZ3900中，并獲得了正確的乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子pMG36e-S-cbhⅡ/NZ3900，保存菌種用于下一步工程菌的表達(dá)和酶活力分析實(shí)驗(yàn)。

圖6　重組乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子篩選Fig.6　 Screening of recombinant Lactococcus lactis transformants

圖7　陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子pMG36ec-Sb-hcbhⅡ/NZ3900的鑒定結(jié)果Fig.7　Identification of the positive transformant pMG36e-S-cbhⅡ/NZ3900

2.4cbhⅡ基因在乳酸乳球菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖8　重組子總蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.8　SDS-PAGE analysis of total protein from the positive recombinant transformant

為了驗(yàn)證cbhⅡ基因是否成功在乳酸乳球菌中獲得表達(dá)，蛋白質(zhì)是否分泌到胞外，分別提取重組乳酸乳球菌pMG36e-S-cbhⅡ/NZ3900菌體超聲裂解沉淀、菌體超聲裂解上清液及培養(yǎng)液上清液，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以pMG36e/NZ3900做陰性對(duì)照。如圖8所示，在泳道1、3的53 kD處有一條新的蛋白條帶，而陰性對(duì)照pMG36e/ NZ3900則無(wú)該條帶，與預(yù)期的結(jié)果一致。同時(shí)，在菌體超聲裂解上清液及培養(yǎng)基上清液中未檢測(cè)到目的蛋白（未給出圖）。因此，結(jié)果表明，綠色木霉纖維二糖水解酶cbhⅡ基因在乳酸乳球菌中成功表達(dá)，且胞外表達(dá)的信號(hào)肽被乳酸乳球菌正確識(shí)別。

2.5重組乳酸乳球工程菌的酶學(xué)性質(zhì)分析

采用DNS法，以微晶纖維素為底物，測(cè)定纖維二糖水解酶（cbhⅡ）活力，分別取不同培養(yǎng)時(shí)間的重組工程菌pMG36e-S-cbhⅡ/NZ3900的超聲裂解菌體沉淀進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖9。重組菌株pMG36e-S-cbhⅡ/ NZ3900在培養(yǎng)0～20 h間，酶活力不斷升高，培養(yǎng)到20 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大值16.7 U/mL，20～28 h酶活力慢慢下降，說(shuō)明在培養(yǎng)期間，纖維二糖水解酶在培養(yǎng)液中積累，在達(dá)到最高點(diǎn)后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和部分酶失活，導(dǎo)致體系中的整體酶活力逐漸下降，因此確定培養(yǎng)20 h為重組菌獲取重組酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間。以上結(jié)果表明綠色木霉cbhⅡ基因前部的信號(hào)肽能夠被乳酸乳球菌NZ3900正確的識(shí)別，并將重組酶分泌到胞外培養(yǎng)基中；而測(cè)定超聲裂解的菌體上清液、超聲裂解菌體沉淀幾乎沒(méi)有酶活力（未給出結(jié)果圖）；目前報(bào)道的工程菌，如綠色木霉纖維二糖水解酶在粟酒裂殖酵母中表達(dá)量為82.5 U/mL［20］，在釀酒酵母中的表達(dá)量為7.71 U/mL［21］，而在乳酸桿菌中的表達(dá)量為0.156 2 U/mL［22］。本研究克隆綠色木霉來(lái)源的纖維素酶基因到乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建了具有綠色木霉及乳酸菌NZ3900共同優(yōu)點(diǎn)的工程菌，酶活力最高達(dá)到16.7 U/mL，與之前報(bào)道的工程菌相比有明顯的優(yōu)越性。

圖9　重組菌的生長(zhǎng)曲線及cbhⅡ酶活力Fig.9　Cellubiohydrolase activity and growth curve analysis of the recombinant strain

3　討 論

綠色木霉是產(chǎn)纖維素酶活力最高的菌株之一，其中纖維二糖水解酶（cbhⅡ）是纖維素酶系中起關(guān)鍵作用的酶。本實(shí)驗(yàn)中所用纖維二糖水解酶基因cbhⅡ，是在前人研究的基礎(chǔ)上［23］，參照GenBank上發(fā)表的綠色木霉cbhⅡ的基因，經(jīng)密碼子偏好性優(yōu)化合成的基因。因此在乳酸菌中得以表達(dá)并獲得了較高的表達(dá)量。

乳酸乳球菌屬于乳酸菌的代表菌種，是乳球菌屬中最典型的一種兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性球菌。由于它易培養(yǎng)、生長(zhǎng)速率快、安全性高等優(yōu)點(diǎn)使其成為表達(dá)外源基因的最佳菌株。但與其他微生物如大腸桿菌、木霉菌等相比，對(duì)乳酸菌在分子生物學(xué)水平上的研究較晚。但是隨著人們對(duì)乳酸菌各類表達(dá)調(diào)控元件的不斷研究，陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了適用于乳酸菌的多種載體，如克隆載體、表達(dá)載體（分泌性表達(dá)載體、組成型表達(dá)載體）、整合載體等，從而使食品級(jí)乳酸菌工程菌的構(gòu)建成為當(dāng)代研究的熱點(diǎn)［24］。

本實(shí)驗(yàn)克隆了綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ，同時(shí)與usp45信號(hào)肽連接，選用乳酸乳球菌為表達(dá)系統(tǒng)，pMG36e為表達(dá)載體，構(gòu)建乳酸乳球菌工程菌，由于在cbhⅡ基因前端加了信號(hào)肽，不僅能使乳酸乳球菌能正常表達(dá)該基因，而且能使表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，這就為后期乳酸乳球菌作為發(fā)酵劑發(fā)酵豆渣纖維素的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ能否在乳酸乳球菌中成功表達(dá)，將鑒定正確的重組乳酸乳球菌制備為對(duì)數(shù)期的菌液種子，并按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量加入GM17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，得到了與預(yù)期一致的蛋白條帶，證明了綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ在乳酸乳球菌中獲得成功表達(dá)，同時(shí)對(duì)重組乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清液、菌體裂解液上清液和菌體裂解液沉淀進(jìn)行酶活力測(cè)定，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明人工連接信號(hào)肽到cbhⅡ基因可以被乳酸乳球菌正確識(shí)別，并可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外。以上結(jié)果驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了具有纖維二糖水解酶活力的乳酸乳球工程菌，且其分泌表達(dá)的重組纖維素酶具有相應(yīng)的生物活性，從而為利用具有纖維素酶活性的乳酸乳球工程菌降解纖維素提供了理論依據(jù)。

［1］ 閻伯旭， 齊飛， 張穎舒， 等. 纖維素酶分子結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 1999， 26（3）: 233-237. DOI:10.3321/ j.issn:1000-3282.1999.03.012.

［2］ 郝月， 楊翔華， 洪新. 纖維素酶的應(yīng)用研究［J］. 青?？萍?， 2005， 12（3）: 31-36. DOI:10.3969/j.issn.1005-9393.2005.03.010.

［3］ MULAKALA C， REILLY P J. Hypocrea jecorina （Trichoderma reesei） Cel7A as a molecular machine： a docking study［J］. Proteins：Structure， Function， and Bioinformatics， 2005， 60（4）： 598-605. DOI：10.1002/PROT.20547.

［4］ 李方正. 纖維素降解菌的分離、鑒定及產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶基因工程乳酸菌的構(gòu)建［D］. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011: 2-5.

［5］ 孫喆， 鮑男， 王濤， 等. 纖維素酶來(lái)源的研究進(jìn)展［J］. 吉林畜牧獸醫(yī)，2014， 35（9）: 22-25. DOI:10.3969/j.issn.1672- 2078.2014.09.006.

［6］ 張艷麗， 聶春明， 周利偉， 等. 牛凝乳酶原基因在食品級(jí)乳酸乳球菌中的重組表達(dá)［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（7）: 123-127. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201407025.

［7］ LOIR Y L， NOUAILLE S， COMMISSAIRE J， et al. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2001，67（9）: 4119-4127. DOI:10.1128/AEM.67.9.4119-4127.2001.

［8］ van ASSELDONK M， RUTTEN G， OTEMAN M， et al. Cloning of usp45， a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363［J］. Gene， 1990， 95（1）: 155-160. DOI:10.1016/0378-1119（90）90428-T.

［9］ JIA Huiyong， FAN Guangsen， YAN Qiaojuan， et al. Highlevel expression of a hyperthermostable Thermotoga maritima β-xylanase in Pichia pastoris by codon optimization［J］. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic， 2012， 78:72-77. DOI:10.1016/ J.molcatb.2012.02.009.

［10］ FUGLSANG A. Lactic acid bacteria as prime candidates for codon optimization［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2003， 312（2）: 285-291. DOI:10.1016/ j.bbrc.2003.10.120.

［11］ 馬超， 王丕武， 付永平， 等. 乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)載體的改造［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 38（19）: 10247-10250. DOI:10.3969/j.issn.1009-4229-B.2010.04.018.

［12］ TSENG W C， FANG T Y， CHANG K C， et al. Expression of Synechocystis sp. PCC6803 cyanophycin synthetase in Lactococcus lactis nisin-controlled gene expression system （NICE） and cyanophycin production［J］. Biochemical Engineering Journal， 2013，78（37）： 114-119. DOI：10.1016/j.bej.2013.02.009.

［13］ HOLO H， NES I F. High-frequency transformation， by electroporation，of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media［J］. Applied & Environmental Microbiology， 1989， 55（12）: 3119-3123.

［14］ 任大勇， 李昌， 秦艷青， 等. 乳酸乳球菌高效電轉(zhuǎn)化方法的建立［J］. 中國(guó)獸藥雜志， 2012， 46（1）: 5-9. DOI:10.3969/ j.issn.1002-1280.2012.01.002.

［15］ 張玉蘭， 柯曉靜， 郭紅敏， 等. 利用組成型表達(dá)載體pMG36e電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌ML23的研究［J］. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 33（4）: 71-76. DOI:10.3969/j.issn.1000-1573.2010.04.015.

［16］ 張煜， 劉剛， 余少文， 等. 里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ在畢赤酵母中的高效表達(dá)［J］. 菌物學(xué)報(bào)， 2005， 24（3）: 367-375. DOI:10.3969/ j.issn.1672-6472.2005.03.011.

［17］ DASHTBAN M， MAKI M， LEUNG K T， et al. Cellulase activities in biomass conversion: measurement methods and comparison［J］. Critical Reviews in Biotechnology， 2010， 30（4）: 302-309. DOI:10.310 9/07388551.2010.490938.

［18］ GHOSE T K. Measurement of cellulase activities［J］. Pure and Applied Chemistry， 1987， 59（2）: 257-268. DOI:10.1351/pac198759020257.

［19］ 王琳， 國(guó)生， 王林嵩， 等. DNS法測(cè)定纖維素酶活力最適條件研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 1998， 26（3）: 66-69.

［20］ 付永平， 宋冰， 王丕武， 等. 綠色木霉纖維二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表達(dá)［J］. 食品科學(xué)， 2012， 33（21）: 164-168.

［21］ 劉澤寰， 全艷彩， 唐根云， 等. 綠色木霉cbhⅡ基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá)［J］. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009， 37（6）: 91-95. DOI:103321/jissn:1000-565x.2009.06.018.

［22］ 趙瑩. 酸性纖維素酶基因在大腸桿菌和乳酸桿菌的表達(dá)及其活性檢測(cè)［D］. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008: 13-16. DOI:10.7666/ d.y1511940.

［23］ 石矛. 纖維素酶工程菌的構(gòu)建及表達(dá)［D］. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008: 24-28. DOI:10.7666/d.y1511746.

［24］ 阮孟斌， 朱明月， 周鵬. 外源基因在乳酸菌中的表達(dá)［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2004， 10（4）: 526-529. DOI:10.3321/j.issn:1006-687x.2004.04.029.

Cloning， Expression and Identification of Trichoderma viride Cellobiohydrolase Gene in Lactic Acid Bacteria

WANG Cuiyan1， WANG Yuhua1， PIAO Chunhong1， LIU Junmei1，2， HU Yaohui1， REN Dayong1，*， YU Hansong1，*
（1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. Division of Soybean Processing， Soybean Research & Development Center， Changchun 130118， China）

The expression of the cbhⅡ （cellobiohydrolase） gene from Trichoderma viride was studied by using Lactobacillus expression system. Primers were designed according to T. viride cbhⅡ gene （GenBank accession number: M55080） and the cbhⅡ gene cDNA was obtained by PCR method with a sequence length of approximately 1 441 bp. An 80 bp signal peptide sequence was inserted into the upstream gene for the secretory expression of the target protein. Then， the gene was optimized according to the codon usage of lactic acid bacteria for the synthesis of the whole cbhⅡ gene. The prokaryotic expression vector pMG36e-S-cbhⅡ was constructed through connection between the target gene and the shuttle vector pMG36e. Electrotransformation was used to obtain recombinant lactic acid bacteria in competent cells of Lactococcus lactis NZ3900. The recombinant protein displayed a molecular weight of approximately 53 kD as determined by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis， which is consistent with the expected size. The cellulase activity was 16.7 U/mL in culture supernatants by 3，5-dinitrosalicylic acid assay， and there was almost no activity in cell lysate precipitates or supernatants. These results showed that the signal peptide sequence was correctly identified by Lactococcus lactis and extracellular expression was achieved successfully.

Trichoderma viride； cellulase； cbhⅡ gene； Lactococcus lactis； cellubiohydrolase activity

10.7506/spkx1002-6630-201619024

Q7

A

1002-6630（2016）19-0141-06

王翠艷， 王玉華， 樸春紅， 等. 綠色木霉纖維二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表達(dá)與鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（19）： 141-146. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619024. http：//www.spkx.net.cn

WANG Cuiyan， WANG Yuhua， PIAO Chunhong， et al. Cloning， expression and identification of Trichoderma viride cellobiohydrolase gene in lactic acid bacteria［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 141-146. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619024. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-27

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（大豆）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-04）；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150204036NY）

王翠艷（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：1249137780@qq.com

任大勇（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全。E-mail：rdy79@163.com

于寒松（1979—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槎怪破芳庸づc副產(chǎn)物綜合利用。E-mail：yuhansong@163.com