β-1，3-1，4-葡聚糖酶研究進(jìn)展

夏許寒，朱成林，李　誠(chéng)*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

β-1，3-1，4-葡聚糖酶研究進(jìn)展

夏許寒，朱成林，李誠(chéng)*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

β-1，3-1，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一類內(nèi)切型糖苷水解酶，廣泛存在于各類微生物及植物中，對(duì)谷物β-1，3-1，4-葡聚糖的水解具有重要作用。在食品工業(yè)及飼料工業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。目前已有GH16、GH17及GH26 3 個(gè)糖苷水解酶家族的β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)得到解析。本文針對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的來(lái)源、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

β-1，3-1，4-葡聚糖酶；酶學(xué)性質(zhì)；結(jié)構(gòu)與功能；應(yīng)用

β-1，3-1，4-葡聚糖是由β-D-葡萄糖殘基通過(guò)β-1，3和β-1，4糖苷鍵混合連接的一類直鏈高分子葡聚糖，主鏈由β-1，3糖苷鍵連接的纖維三糖和纖維四糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元形成（圖1），在大麥、燕麥、高粱等谷物胚乳細(xì)胞壁中的含量極為豐富。β-1，3-1，4-葡聚糖酶（又稱地衣多糖酶；EC 3.2.1.73）作為一種重要的β-葡聚糖水解酶，能夠特異性水解β-1，3-1，4-葡聚糖中與β-1，3糖苷鍵相鄰的β-1，4糖苷鍵（圖1），生成3-O-β-纖維二糖基-D-吡喃葡萄糖（G4G3G）和3-O-β-纖維三糖基-D-吡喃葡萄糖（G4G4G3G）［1］。β-1，3-1，4-葡聚糖酶作為一種重要的糖苷水解酶類，對(duì)谷物β-1，3-1，4-葡聚糖的水解具有重要作用，能夠有效降低麥汁黏度和消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，因而被廣泛應(yīng)用于啤酒和飼料行業(yè)中［1-2］。然而，受到質(zhì)量、價(jià)格等因素的影響，目前市場(chǎng)上的β-1，3-1，4-葡聚糖酶并不能完全滿足現(xiàn)有工業(yè)應(yīng)用的需求。因此，如何開(kāi)發(fā)種類更多、酶活力更高、性質(zhì)更好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶來(lái)消除谷物類β-葡聚糖造成的負(fù)面作用，一直是酶制劑工業(yè)、釀造工業(yè)和飼料工業(yè)的研究重點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶展開(kāi)了系統(tǒng)性研究，為了歸納總結(jié)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)，本文對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的來(lái)源、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用等方面的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，為β-1，3-1，4-葡聚糖酶的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考。

圖1　1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶降解大麥β-葡聚糖的作用方式［1］1Fig.1　Enzymatic depolymerisation of barley β-glucan by β-1，3-1，4-glucanase［1］

1　1 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的來(lái)源

β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要來(lái)源于各種微生物以及高等植物中［3］。由于微生物來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有生產(chǎn)周期短、酶活力穩(wěn)定、生產(chǎn)容易放大等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為β-1，3-1，4-葡聚糖酶研究的最主要來(lái)源。一些微生物來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶能夠高效水解植物胚乳中的β-葡聚糖，具有良好應(yīng)用前景。關(guān)于β-1，3-1，4-葡聚糖酶來(lái)源，早期的研究主要集中在產(chǎn)酶菌株的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化、酶的分離純化和性質(zhì)的研究。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)天然來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶往往難以同時(shí)滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)酶活性、反應(yīng)溫度和pH值等多方面的實(shí)際需求，無(wú)法直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。因此近年來(lái)，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因克隆和外源表達(dá)成為獲得工業(yè)用酶另一種有效途徑。同時(shí)，隨著生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及酶催化作用機(jī)理研究的深入，一些宏基因組來(lái)源或人工分子改造β-1，3-1，4-葡聚糖酶也逐步得到重視。

1.1細(xì)菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶

細(xì)菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶是報(bào)道最為廣泛，研究較為透徹的一類β-1，3-1，4-葡聚糖酶，也是目前工業(yè)應(yīng)用β-1，3-1，4-葡聚糖酶的主要來(lái)源。產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的細(xì)菌主要是芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［4-8］、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）［9］、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）［10-12］、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）［13-14］、嗜堿芽孢桿菌（Bacillus halodurans）［15］、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）［16］、類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）［17］、多黏芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）［18］和高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）［19］等。此外，還有一些產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的細(xì)菌，如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）［20-22］、牛鏈球菌（Streptococcus bovis）［23］、硫磺菌（Laetiporus sulphureus）［24］和熱纖維梭菌（Clostridium thermocellum）［25-26］等。其中在畢赤酵母（Pichia pastoris）中異源表達(dá)的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌來(lái)源的重組β-1，3-1，4-葡聚糖酶比活力達(dá)到10 800 U/mg，為已報(bào)道的細(xì)菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最高比活力［21］。一些芽孢桿菌所產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的性能較為優(yōu)異，其熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，且對(duì)底物有較強(qiáng)特異性。由于發(fā)酵條件較為成熟，目前工業(yè)應(yīng)用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵制備。

1.2真菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶

真菌是β-1，3-1，4-葡聚糖酶的一個(gè)重要來(lái)源。產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的真菌以嗜熱真菌為主，包括嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）［27］、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）［28］和樟絨枝霉（Malbranchea cinnamomea）［29］，嗜酸真菌，如Bispora sp.［30］以及埃默森籃狀菌（Talaromyces emersonii）［31］、致病疫霉（Phytophthora infestans）［32］、碎囊毛霉［33］等。其中米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶胞外活力達(dá)到6 230 U/mL，在最適條件下的比活力達(dá)到28 820 U/mg，為已報(bào)道的真菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最高比活力［28］。酵母菌也能產(chǎn)生幾種β-葡聚糖酶，但基本不能水解由β-1，3糖苷鍵和β-1，4糖苷鍵混合連接的β-葡聚糖，且分泌量相對(duì)較少，作用也較弱［34］。由于飼料造粒溫度及麥芽汁糖化工藝溫度的需求，熱穩(wěn)定性成為考察β-1，3-1，4-葡聚糖酶適應(yīng)性的重要指標(biāo)，因此基于嗜熱真菌發(fā)掘耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶成為目前的一大研究趨勢(shì)［27-29］。此外，利用真菌固態(tài)發(fā)酵能夠有效降低酶發(fā)酵制備成本，簡(jiǎn)化發(fā)酵流程，使得真菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶的開(kāi)發(fā)利用日漸受到重視。

1.3植物來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶

β-1，3-1，4-葡聚糖酶也廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中，尤其在大麥、燕麥和黑麥等谷類作物的胚乳細(xì)胞壁中含量最為豐富［35-36］。谷物種子本身不含有β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但在其發(fā)芽過(guò)程中，胚乳細(xì)胞受到胚上皮細(xì)胞分泌的赤霉酸刺激，將逐步合成一系列內(nèi)源性β-1，3-1，4-葡聚糖酶，用于分解胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，解除其對(duì)胚乳中的抗性作用，保證種子的正常發(fā)芽［18］。但植物來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶分泌量極少，且比活力較低，適應(yīng)性較差，不適用于工業(yè)生產(chǎn)。目前研究多限于β-1，3-1，4-葡聚糖酶的植物生理活性功能或新來(lái)源的探索。

2　2 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理

糖苷水解酶基于氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系可分類為不同家族，到目前為止，根據(jù)碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（Carbohydrate-Active Enzymes Database，http:// www.cazy.org/［36］）的分類，共有135 個(gè)糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase family，GH）分屬于14 個(gè)超家族（super family）：GH-A-GH-N。已發(fā)現(xiàn)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶可以歸屬于9 個(gè)GH：GH5、GH7、GH8、GH9、GH11、GH12、GH16、GH17和GH26。目前已有GH16、GH17及GH26 3個(gè)GH的β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)得到解析（表1）。到目前為止，所有已報(bào)道的典型β-1，3-1，4-葡聚糖酶均歸屬于GH16和GH17家族，其他GH中β-1，3-1，4-葡聚糖酶分布較少，且多為纖維素酶/β-1，3-1，4-葡聚糖酶多功能酶或昆布多糖酶/β-1，3-1，4-葡聚糖酶多功能酶，不屬于嚴(yán)格意義上的β-1，3-1，4-葡聚糖酶。植物和微生物來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)上都存在較大差異。根據(jù)氨基酸序列的進(jìn)化關(guān)系分類，已發(fā)現(xiàn)的微生物來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要?dú)w屬于GH16家族，而植物（如大麥芽、大米和煙草）來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要?dú)w屬于為GH17家族。

表1　已解析的β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)Table1　Structures oβf-1，3-1，4-glucanasesnases

2.1GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶

圖2　GH16及GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理Fig.2　Structures and catalytic mechanisms of β-1，3-1，4-glucanases belonging to GH16 and GH17 families

GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶屬于GH-B超家族，其三維結(jié)構(gòu)由兩組反相平行的β-折疊體系構(gòu)成的緊密的β-折疊果凍卷結(jié)構(gòu)（β-jelly roll），β-折疊堆砌在頂端形成蛋白質(zhì)中心，每一個(gè)環(huán)的結(jié)構(gòu)通過(guò)β-轉(zhuǎn)角穩(wěn)定，中心由7 條彎曲的反向平行鏈通過(guò)一端形成裂隙，構(gòu)成貫穿于酶分子表面的狹長(zhǎng)催化凹槽，作為與長(zhǎng)鏈底物的結(jié)合區(qū)域［37］。兩個(gè)保守的谷氨酸殘基位于β-折疊果凍卷結(jié)構(gòu)的第8個(gè)β-折疊上，分別發(fā)揮親核試劑與酸/堿催化基團(tuán)作用（圖2a）。GH16家族遵循糖苷水解酶“保留型”催化機(jī)制。酶解反應(yīng)在保守的活性氨基酸殘基參與下執(zhí)行兩步反應(yīng)，在反應(yīng)歷程中同樣會(huì)形成不穩(wěn)定的酶-糖基中間體。在反應(yīng)的第一步，活性中心的谷氨酸殘基作為廣義酸攻擊底物的異頭碳。底物的β-1，4糖苷鍵斷裂，離去基團(tuán)被切去，并形成了酶-糖基不穩(wěn)定中間體。隨后，活性中心的谷氨酸殘基作為廣義堿，協(xié)助水分子攻擊酶-糖基不穩(wěn)定中間體的異頭碳位置。最終，β-1，4糖苷鍵斷裂，形成了最終的底物水解產(chǎn)物（圖2c）。GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶屬于內(nèi)切型糖苷水解酶，從β-1，3-1，4-葡聚糖長(zhǎng)鏈底物內(nèi)部隨機(jī)切斷β-1，3糖苷鍵鄰近的β-1，4糖苷鍵，水解產(chǎn)物為一系列聚合度不同的低聚糖。目前已有芽孢桿菌［38］、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）［22］、嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）［37］等一些GH16家族的β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)得到解析。一些GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶-底物/抑制劑復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表明，GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶的催化凹槽中存在一些位阻氨基酸，將催化凹槽阻隔成為曲折構(gòu)型，從而適宜于β-1，3與β-1，4糖苷鍵混合連接的非直線型底物的結(jié)合。這些復(fù)合物信息從結(jié)構(gòu)上解釋了GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物特異性作用機(jī)制，闡述了三維結(jié)構(gòu)類似的不同GH16家族蛋白具有水解不同類型底物的根本原因［38］。GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶分子內(nèi)普遍存在一些二硫鍵，對(duì)酶的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用。由于“保留型”催化機(jī)制，在反應(yīng)歷程中形成了不穩(wěn)定的酶-糖基中間體，部分GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶存在微弱的轉(zhuǎn)糖苷活性。目前已有針對(duì)GH16家族β-1，3-葡聚糖酶的分子改造研究，通過(guò)活性位點(diǎn)突變使其成為糖基轉(zhuǎn)移酶用于合成環(huán)狀β-1，3-葡寡糖［39］。因此，基于催化凹槽的理性設(shè)計(jì)改造使得GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶同樣具有潛在的合成異源糖苷或低聚寡糖能力。同時(shí)，GH16家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶豐富的結(jié)構(gòu)信息及催化機(jī)制研究也為下一步的分子改造提供了理論基礎(chǔ)。

2.2GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶

已發(fā)現(xiàn)的GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶全部為植物來(lái)源，在植物生理代謝中發(fā)揮著重要功能。GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶屬于GH-A超家族，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的TIM桶狀結(jié)構(gòu)（TIM-barrel fold），由8 個(gè)α-螺旋和8 個(gè)β-折疊環(huán)繞形成。酸堿催化、親核試劑谷氨酸殘基分別位于第4和第7個(gè)β-折疊上（圖2b）。一個(gè)能夠容納長(zhǎng)鏈底物的狹長(zhǎng)催化凹槽貫穿整個(gè)酶的表面。已有的研究表明GH17家族內(nèi)切β-1，3-14-葡聚糖酶與GH16家族蛋白類似，遵從“保留型”反應(yīng)機(jī)制。酶解反應(yīng)在保守的活性氨基酸殘基（谷氨酸殘基）參與下執(zhí)行兩步反應(yīng)，在反應(yīng)歷程中同樣會(huì)形成不穩(wěn)定的酶-糖基中間體（圖2c）。目前僅有1 例大麥（Hordeum vulgare）來(lái)源的GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)得到解析［40-41］。研究者同時(shí)解析了相同來(lái)源的GH17家族β-1，3-葡聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)兩者對(duì)比，狹長(zhǎng)催化凹槽內(nèi)的氨基酸殘基位阻排布差異造成了兩種酶對(duì)應(yīng)底物的差異。盡管GH17家族中存在外切型β-1，3-葡聚糖酶，但已發(fā)現(xiàn)的GH17家族β-1，3-1，4-葡聚糖均屬于內(nèi)切型糖苷水解酶，從β-1，3-1，4-葡聚糖長(zhǎng)鏈底物內(nèi)部隨機(jī)切斷β-1，3糖苷鍵鄰近的β-1，4糖苷鍵，水解產(chǎn)物同樣為一系列聚合度不同的低聚糖。

3　3 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

表2　不同β-1，3-1，4-葡聚糖酶性質(zhì)Table2　Characterization of β-1，3-1，4-glucanases from different microbial origins

不同來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶的性質(zhì)各不相同，這種差異不僅表現(xiàn)在物種上，而且還表現(xiàn)在種屬間（表2）。其中大多數(shù)為胞外酶，一般都采用常規(guī)處理方法進(jìn)行分離純化，如離心和/或超濾、硫酸銨或有機(jī)溶劑沉淀、離子交換等各種柱層析、電泳等。真菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶分子質(zhì)量通常在30～50 kD之間，最適pH值在4.8～7.0之間，以酸性酶居多，最適溫度在55～80℃，一般具有較好的耐酸性和耐熱性。耐熱性較好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶一般都是糖基化蛋白，但糖基化程度卻大不相同。不同真菌來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的米氏常數(shù)（Km）值差異較大，一般介于1.11～13.38 mg/mL之間，表明β-1，3-1，4-葡聚糖酶對(duì)于底物的親和能力具有較大差異。目前，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究主要以細(xì)菌為主，關(guān)于真菌發(fā)酵產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究報(bào)道較少。Yang Shaoqing等［27］以玉米芯作為碳源，首次報(bào)道了嗜熱擬青霉發(fā)酵產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶為分子質(zhì)量為34.6 kD的單亞基蛋白，最適反應(yīng)溫度和pH值分別為70 ℃和7.0，具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍（pH 4.0～10.0）和溫度穩(wěn)定性（＜65℃）。Tang Yanbin等［28］利用米黑根毛霉液體發(fā)酵得到了一種耐熱β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其酶活力高達(dá)6 230 U/mL，該酶最適pH值為5.5，最適溫度為60 ℃，在pH 4.5～8.5范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，在80 ℃處理30 min，酶活力仍能保持70%以上，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。真菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶一般為耐酸性或中性酶，目前僅有樟絨枝霉來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶顯示出耐堿特性。Yang Shaoqing等［29］以玉米芯為碳源，對(duì)樟絨枝霉進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶最適pH值為10.0，在pH 4.5～10.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，最適作用溫度為55 ℃，在50 ℃以下保持穩(wěn)定，作為耐堿性β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在洗滌劑工業(yè)具有一定潛在應(yīng)用價(jià)值。細(xì)菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶分子質(zhì)量在20～50 kD之間，通常都是單亞基蛋白，最適pH值在5.0～7.0之間，最適溫度在40～65 ℃之間。不同細(xì)菌來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的Km值一般介于1.82～10.00 mg/mL之間，對(duì)于β-1，3-1，4-葡聚糖酶底物的水解能力差異較大。Mao Shurui等［19］從淤泥中篩選得到1 株產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），純化得到該酶的分子質(zhì)量為27 kD，最適反應(yīng)溫度和pH值分別為60 ℃和6.0，具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍（pH 5.0～9.0）和溫度穩(wěn)定性（＜60 ℃），該酶能夠被Co2+、Fe2+、Ca2+等金屬離子激活，比活力達(dá)到3 191.5 U/mg。Na等［17］報(bào)道了一種類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，該酶屬于GH8家族，與常見(jiàn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶不同，該酶具有較寬的底物特異性，除水解大麥葡聚糖外，還能水解殼聚糖、羧甲基纖維素鈉。該酶分子質(zhì)量為41.5 kD，最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50 ℃、5.0。細(xì)菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性普遍低于真菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶，最適pH值以中性居多。僅芽孢桿菌N137來(lái)源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶最適pH值為9.0，在pH 12.0條件下仍然保持80%以上的活性［42］。由于細(xì)菌來(lái)源β-1，3-1，4-葡聚糖酶來(lái)源廣泛、表達(dá)量大、制備條件成熟，目前已大規(guī)模用于工業(yè)生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因得到克隆表達(dá)，利用大腸桿菌、畢赤酵母等表達(dá)載體高效異源表達(dá)進(jìn)一步拓寬了β-1，3-1，4-葡聚糖酶的來(lái)源，降低了β-1，3-1，4-葡聚糖酶的生產(chǎn)成本。

4　4 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的應(yīng)用

β-1，3-1，4-葡聚糖酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用潛力非常廣泛。主要包括：提高果汁澄清度、提高啤酒及食用油榨取產(chǎn)率、提高烘焙食品質(zhì)量以及飼料工業(yè)中用于提高飼料吸收率。其中在啤酒釀造及飼料工業(yè)中的應(yīng)用目前研究較為充分。

4.1啤酒釀造中的應(yīng)用

β-1，3-1，4-葡聚糖廣泛應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中。大麥?zhǔn)巧a(chǎn)啤酒的主要原料，在啤酒制麥過(guò)程中，大麥中內(nèi)源性β-1，3-1，4-葡聚糖酶因熱失活，其胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖大量溶解在麥芽汁中，不僅使麥芽浸出率降低，而且還增大了麥芽汁黏度，造成過(guò)濾困難，最終還可能在啤酒中形成凝膠絮狀沉淀，這不僅提高了啤酒的生產(chǎn)成本，還影響啤酒的質(zhì)量。在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中添加適量的β-1，3-1，4-葡聚糖酶能較好地解決上述問(wèn)題。β-1，3-1，4-葡聚糖酶在啤酒生產(chǎn)中發(fā)揮的主要4 種功能為：降解麥芽中的β-葡聚糖，降低麥汁黏度，提高過(guò)濾速度與麥汁的澄清度；提高糖化生產(chǎn)能力，促進(jìn)可發(fā)酵性糖比例的提高，降低糧耗；提高啤酒的膠體穩(wěn)定性，消除β-葡聚糖引起的冷渾濁；降解β-葡聚糖，提高純生啤酒生產(chǎn)過(guò)程中濾膜的使用效率，延長(zhǎng)膜的使用壽命。目前商品β-1，3-1，4-葡聚糖的價(jià)格一般在800～1 500元/kg，β-1，3-1，4-葡聚糖在啤酒麥芽汁中的添加量一般為0.01%～0.02%（以麥芽干質(zhì)量計(jì)）［2］。Bai Yingguo等［43］從Alicyclobacillus sp. A4中得到一種新的屬于GH9家族的β-葡聚糖酶并將其應(yīng)用于麥芽糖化實(shí)驗(yàn)中，添加20 U/mL的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，能將麥芽汁過(guò)濾時(shí)間縮短26.7%，黏度降低6.12%，將該葡聚糖酶與商用木聚糖酶混合使用，麥芽汁過(guò)濾時(shí)間和黏度分別降低31.7%和8.79%。Celestino等［44］利用Rhizopus microsporus var. microsporus產(chǎn)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶能將麥芽汁過(guò)濾時(shí)間縮短20.4%，黏度降低4.7%，而其用酶量?jī)H為11.0 μg。McCarthy等［45］利用Talaromyces emersonii的紫外突變菌株所產(chǎn)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶粗酶液能將麥芽汁的黏度由3.680 mPa·s最低降到1.587 mPa·s，相同過(guò)濾時(shí)間內(nèi)，濾液由100 mL增加到115 mL。其所用的粗酶液中同時(shí)具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性、纖維素酶活性、β-1，3-葡聚糖酶活性以及β-葡萄糖苷酶活性。

4.2飼料工業(yè)中的應(yīng)用

β-1，3-1，4-葡聚糖目前也廣泛應(yīng)用在飼料工業(yè)中。用大麥作為飼料的主要原料時(shí)，豬及禽類等單胃動(dòng)物自身不能合成β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其消化道內(nèi)也沒(méi)有能夠分泌該酶的微生物，從而使β-葡聚糖成為單胃動(dòng)物飼料的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低了飼料的效果和養(yǎng)分的消化吸收，限制了大麥等在飼料中的應(yīng)用。此外，飼料中無(wú)法消化的葡聚糖使得飼料黏度較高，不利于小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。而β-葡聚糖酶能將大麥中的β-葡聚糖降解為小分子，使之失去抗?fàn)I養(yǎng)特性，從而有利于動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和糧食的轉(zhuǎn)化率［46］。研究表明，飼料中添加β-葡聚糖及木聚糖酶后，仔豬小腸對(duì)飼料中葡萄糖的有效攝取率有一定程度提高［47］。β-1，3-1，4-葡聚糖目前在禽類飼料添加中的研究較為廣泛，其在家禽飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果也要明顯好于家畜中的效果。調(diào)質(zhì)制粒、擠壓膨化是目前飼料生產(chǎn)中最主要的熱處理工藝。飼料在制粒時(shí)，除了蒸汽加熱作用外，還有環(huán)模與壓輥的高壓剪切作用，以及飼料中其他添加劑的混合作用，易對(duì)飼料中酶制劑的活性造成損壞。因此，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性較強(qiáng)，尤其是熱穩(wěn)定性較好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶對(duì)于其在飼料中的應(yīng)用具有重要意義。

5　結(jié) 語(yǔ)

β-1，3-1，4-葡聚糖酶作為一種新型添加劑，具有廣泛而顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。但目前已有的β-1，3-1，4-葡聚糖酶還存在一些不足，例如穩(wěn)定性較差、酶活力偏低、酸堿及溫度適應(yīng)性較差等，還不能完全滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。因此，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)種類更多、酶活力更高、穩(wěn)定性和適用性更好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶還有待進(jìn)一步探索。此外，目前已報(bào)道的β-1，3-1，4-葡聚糖酶主要來(lái)源于GH16及GH17家族，其他家族的β-1，3-1，4-葡聚糖酶報(bào)道并不多見(jiàn)，其酶學(xué)性質(zhì)、應(yīng)用及催化機(jī)理均有待進(jìn)一步研究。

隨著基因工程及蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多不同來(lái)源及特異性各異的β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)已得到解析。近年來(lái)，利用β-1，3-1，4-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息，采用酶工程理性設(shè)計(jì)改造手段，得到具有更優(yōu)異性能的β-1，3-1，4-葡聚糖酶也成為一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究者涉及到這一領(lǐng)域，一些研究表明，對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的定點(diǎn)突變能夠有效提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性或提高酶的催化能力［13，48-49］。通過(guò)對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶催化凹槽的改造能夠改變酶的底物特異性，使得β-1，3-1，4-葡聚糖酶同時(shí)能夠接受支鏈木聚糖底物［50］。此外，定向進(jìn)化等手段也是改造β-1，3-1，4-葡聚糖酶的一個(gè)有效手段。一些研究表明，通過(guò)定向進(jìn)化能夠得到熱穩(wěn)定性改善的新型β-1，3-1，4-葡聚糖酶［7，51］。因此，解析具有特殊功能的β-1，3-1，4-葡聚糖酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，了解其催化機(jī)理，并利用現(xiàn)有結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息改造現(xiàn)有β-1，3-1，4-葡聚糖酶仍是今后的一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。

嗜熱或嗜酸微生物是微生物資源中較為特殊的一類，它們通常能夠在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中產(chǎn)生一些具有特殊催化能力的酶類，這些酶類與一般微生物來(lái)源的酶相比具有穩(wěn)定性強(qiáng)、適用面廣等優(yōu)勢(shì)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有更好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，嗜熱及嗜酸微生物中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的篩選以及基因資源的開(kāi)發(fā)也逐漸得到重視。一系列嗜熱真菌中的β-1，3-1，4-葡聚糖酶得到純化或部分新型β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因得到克隆表達(dá)［19，27］。利用極端環(huán)境微生物這些優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)新型β-1，3-1，4-葡聚糖酶仍然值得進(jìn)一步研究。

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Advances in Research on β-1，3-1，4-Glucanase

XIA Xuhan， ZHU Chenglin， LI Cheng*
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

β-1，3-1，4-Glucanases （EC 3.2.1.73） are a class of endo-type glucoside hydrolases widely distributed in bacteria，fungi and plants. They can randomly hydrolyze β-1，4-linkages in β-1，3-1，4-glucans from cereals and have great potential in the food and feed industries. To date， there are three glycoside hydrolase families （GH16， GH17 and GH26） which β-1，3-1，4-glucanases belong to whose crystal structures have been resolved. This paper reviews the current knowledge about the sources， properties， structures and functionalities of β-1，3-1，4-glucanases as well as their recent applications in the food and feed industry.

β-1，3-1，4-glucanase； enzyme characteristics； structure and functionality； application

10.7506/spkx1002-6630-201619048

Q814.4

A

1002-6630（2016）19-0289-07

夏許寒， 朱成林， 李誠(chéng). β-1，3-1，4-葡聚糖酶研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（19）： 289-295. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619048. http：//www.spkx.net.cn

XIA Xuhan， ZHU Chenglin， LI Cheng. Advances in research on β-1，3-1，4-glucanase［J］. Food Science， 2016， 37（19）：289-295. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619048. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-10

夏許寒（1995—），男，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：xiaxuhanxh@163.com

李誠(chéng)（1964—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com