熒光定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HBV方法比較

林牧，龔亞東，高紹瑩，丁政，馬慶慶

（貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563000）

·綜述·

熒光定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HBV方法比較

林牧，龔亞東，高紹瑩，丁政，馬慶慶△

（貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563000）

目的探討熒光定量PCR（FQ-PCR）與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）的區(qū)別，并分析其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取2015年8～12月在該院就診的221例疑似乙型肝炎患者的血清標(biāo)本，分別使用FQ-PCR及ELISA法對(duì)HBV進(jìn)行檢測(cè)，探討FQ-PCR的檢測(cè)方法、陽性率及臨床意義。結(jié)果FQ-PCR檢測(cè)共檢出134例陽性標(biāo)本，陽性率為60.63%；ELLSA檢測(cè)乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原、乙型肝炎核心抗體、乙型肝炎e抗體和乙型肝炎表面抗體陽性率（36.20%、6.33%、33.48%、15.32%、43.90%）均低于FQ-PCR對(duì)HBV-DNA檢出的陽性率（60.63%），且分別與大三陽組和小三陽組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論FQ-PCR能夠直觀地反映HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況，適合早期診斷并指導(dǎo)臨床用藥，其診斷和指導(dǎo)意義高于ELISA法，且操作快速簡(jiǎn)便，值得臨床推廣。

聚合酶鏈反應(yīng)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；肝炎病毒，乙型；DNA，病毒；熒光定量PCR

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，可引發(fā)肝臟炎性損傷，且傳播途徑復(fù)雜、流行面廣、感染率高［1］。疾病早期癥狀不明顯，發(fā)病緩慢、易被忽視，常使患者終身攜帶病毒，引發(fā)肝細(xì)胞壞死、纖維化，是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的重要原因［2，3］。我國是HBV感染的高發(fā)區(qū)，乙型病毒性肝炎的發(fā)病率和患病人數(shù)均居世界首位，對(duì)我國居民的健康造成了嚴(yán)重危害，故加強(qiáng)對(duì)該病的診斷及治療意義重大［4］。

目前，臨床多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行乙型肝炎五項(xiàng)檢測(cè)［分別為乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（HBsAb）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎e抗體（HBeAb）、乙型肝炎核心抗體（HBcAb）］，但血清標(biāo)志物檢測(cè)易受乙型肝炎五項(xiàng)復(fù)雜組合模式的影響，診斷準(zhǔn)確率不高［5］。熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）操作方便、檢測(cè)速度快，是在PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行熒光標(biāo)記定量，其濃度高低可直接判斷病毒復(fù)制水平、傳染性強(qiáng)弱、抗病毒藥物療效等，在提高靈敏度和特異性的同時(shí)降低了假陽性率。故探討FQ-PCR對(duì)HBV檢測(cè)的臨床意義顯得尤為重要［6］。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年8月至2015年12月在本院就診的疑似乙型肝炎患者221例，其中男135例，女86例，男女比例約為1∶1.5；年齡20～78歲，平均約36.7歲。

1.2方法早晨空腹采集所有患者靜脈血3 mL（標(biāo)本質(zhì)量合格），分別采用FQ-PCR及ELLSA檢測(cè)乙型肝炎五項(xiàng)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的陽性率分別與乙肝核酸定量DNA的陽性率比較；再將“大三陽”（HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBcAb陽性）和“小三陽”（HBsAg陽性、HBeAb陽性、HBcAb陽性）的陽性率分別與乙肝核酸定量DNA結(jié)果比對(duì)。

1.2.1判定標(biāo)準(zhǔn)ELLSA檢測(cè)乙型肝炎五項(xiàng)時(shí)，若樣本的吸光度值（optical density，OD值）≥1則結(jié)果為陽性，OD值小于1則結(jié)果為陰性；而HBV-DNA濃度檢測(cè)中，若其濃度大于或等于500 copy/mL則為陽性，小于500 copy/mL則為陰性［7］。

1.2.2觀察指標(biāo)（1）對(duì)比ELISA法及FQ-PCR法對(duì)乙型肝炎五項(xiàng)的檢測(cè)結(jié)果，分析FQ-PCR檢測(cè)陽性率；（2）按照乙型肝炎五項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組（大三陽組、小三陽組），分析FQ-PCR檢測(cè)HBV-DNA病毒含量與ELISA檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

1.2.3檢測(cè)方法

1.2.3.1乙型肝炎五項(xiàng)檢測(cè)采用ELISA法來檢測(cè)HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等乙型肝炎標(biāo)志物（由本院檢驗(yàn)科完成檢測(cè)及結(jié)果發(fā)布）。

1.2.3.2HBV-DNA定量檢測(cè)采取221例患者的空腹靜脈血，收集于真空惰性分離膠促凝管內(nèi)，使用離心機(jī)以3 500 r/min離心5 min以制備血漿標(biāo)本，4℃保存（24 h內(nèi)測(cè)定）。（1）儀器設(shè)備：FQ-PCR儀為美國ABI公司7500型、HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒由艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司提供。（2）核酸提取血清標(biāo)本50 μL，加入等量提取液（吸取前吹打以便吸取固體沉淀顆粒物）50 μL并震蕩混勻，瞬時(shí)離心后100℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心10 min，留取上清液（可4℃暫存）。（3）FQ-PCR檢測(cè)：配制PCR反應(yīng)液（35.6 μL HBV反應(yīng)混合液+0.4 μL Taq酶），每管分別加入待測(cè)樣本HBV-DNA、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各2 μL，混勻后瞬時(shí)離心，置入ABI 7500型實(shí)時(shí)FQ-PCR儀中，以95℃3 min、94℃15 s、60℃30 s（40個(gè)循環(huán)）擴(kuò)增，每次延伸結(jié)束進(jìn)行FAM、HEX通道熒光信號(hào)收集，記錄HBV-DNA FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12種方法檢測(cè)陽性率比較FQ-PCR確診134例，陽性率較高為60.63%；ELISA檢測(cè)中乙型肝炎五項(xiàng)的陽性率分別為6.33%、36.20%、33.48%、15.32%、43.89%。見表1。

表12　種方法檢測(cè)陽性率比較［n=221，n（%）］

2.2大三陽、小三陽組與HBV-DNA組檢測(cè)陽性率比較HBV-DNA組檢測(cè)陽性率最高，與大三陽組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.63，P＜0.01）；與小三陽組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.60，P＜0.01），見表2。

表2　大三陽、小三陽組與HBV-DNA組檢測(cè)陽性率比較［n=221，n（%）］

2.3定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線處除未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增的陰性對(duì)照曲線外大致分為3種形態(tài)：（1）Ct值從18開始上揚(yáng)的曲線，形狀呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”形，說明該樣本中含有的HBV-DNA很多；（2）Ct值從24～28區(qū)間開始上揚(yáng)的曲線，形狀基本呈“S”形，說明該樣本中含有的HBV-DNA較多；（3）Ct值從32開始上揚(yáng)的曲線，形狀暫無法看出呈現(xiàn)“S”形，但若再經(jīng)過數(shù)個(gè)循環(huán)后便會(huì)出現(xiàn)“S”形曲線，說明該樣本中含有較少的HBV-DNA，見圖1。

圖1　FQ-PCR法檢測(cè)HBV-DNA的擴(kuò)增曲線

3　討論

目前，HBV在我國的感染率高達(dá)60%～70%，易通過持續(xù)感染誘導(dǎo)機(jī)體持續(xù)免疫耐受狀態(tài)而造成肝臟損傷，因此高效和早期的確診降低該病死亡率的關(guān)鍵［8］。我國現(xiàn)階段多采用乙型肝炎五項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果來判斷是否存在HBV感染，該方法對(duì)患者體內(nèi)病毒的復(fù)制水平及傳染程度無判斷意義，且部分患者因HBV感染復(fù)制狀況難以判斷而漏診［9-10］。FQ-PCR可從分子水平直接檢測(cè)HBV-DNA的存在，直觀地反映HBV存活及復(fù)制水平、活動(dòng)性及傳染性等指標(biāo)［11］。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)QPCR對(duì)HBV-DNA檢出的陽性率（60.63%）高于ELLSA（HBsAg 36.20%，HBeAg 6.33%，HBcAb 33.48%，HBeAb 15.38%，HBsAb 43.90%）；大三陽組和小三陽組檢測(cè)陽性率（6.33%、15.38%）分別與HBV-DNA組（60.63%）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.63、9.60，P＜0.01），說明FQ-PCR檢測(cè)的診斷價(jià)值較高。其中大三陽組的陽性率為6.33%，該組HBV大量存在且高度復(fù)制，具有較強(qiáng)的傳染性，應(yīng)及時(shí)確診，予以長期、足量的抗病毒治療［12-13］。小三陽組陽性率為15.32%，該組HBV數(shù)量較少且復(fù)制較弱，傳染性不強(qiáng)，其機(jī)制可能與前C區(qū)和基本核心啟動(dòng)子區(qū)變異引發(fā)的終止密碼子形成有關(guān)，此類患者處于感染潛伏狀態(tài)，除積極監(jiān)測(cè)病情外，應(yīng)及時(shí)予以抗病毒治療等［14-15］。

綜上所述，乙型肝炎五項(xiàng)ELLSA檢測(cè)和FQ-PCR檢測(cè)均能有效檢出乙型病毒性肝炎，但HBV-DNA檢測(cè)還能實(shí)時(shí)反映患者HBV感染的變化情況，有利于指導(dǎo)臨床用藥，可對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果做出補(bǔ)充修正［16-17］。ELISA法對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)有較好的檢測(cè)作用，而FQ-PCR法對(duì)HPV感染狀態(tài)可做到客觀表達(dá)，可認(rèn)為FQ-PCR對(duì)抗病毒治療和療效評(píng)價(jià)均有較大的應(yīng)用價(jià)值［18］。因此，F(xiàn)QPCR的診斷和指導(dǎo)意義高于ELISA法，值得臨床廣泛應(yīng)用。當(dāng)然，F(xiàn)Q-PCR法檢測(cè)HBV-DNA含量的方法也存在一定的局限性，與ELISA檢測(cè)法聯(lián)合應(yīng)用可為乙型病毒性肝炎的確診提供可靠、全面的判定依據(jù)，在防控和臨床治療上具有重要意義。

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Comparison of FQ-PCR and ELISA for detecting HBV

Lin Mu，Gong Yadong，Gao Shaoying，Ding Zheng，Ma Qingqing
（Central Laboratory，Guizhou Spaceflight Hospital，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo investigate the difference between fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）in detecting hepatitis B virus（HBV），and to analyze their clinical values.MethodsThe serum samples in 221 cases of suspected hepatitis B in our hospital from August to December 2015 were selected and HBV was respectively detected by using FQ-PCR and ELISA for exploring FQ-PCR detection method，positive rate and clinical significance.ResultsTotally 134 cases of positive samples were detected by FQ-PCR，with the positive rate of 60.63%；the detection positive rates of HBsAg，HBeAg，HBcAb，HBeAb and HBsAb by ELISA were 36.20%，6.33%，33.48%，15.32%and 43.90%respectively，which were lower than 60.63%by FQ-PCR，moreover which were compared with the"large 3-positve"group and"small 3-positive" group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionFQ-PCR can intuitively reflect the HBV replication situation in liver cells，is suitable for the early diagnosis and guides clinical medication，its diagnosis and guidance significance are higher than those of the ELISA method，moreover its operation is simple and rapid，which deserves to be promoted in clinic.

Polymerase chain reaction；Enzyme-linked immunosorbent assay；Hepatitis B virus；DNA，viral；Fluorescence quantitative PCR

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.09.017

A

1009-5519（2016）09-1329-03

林牧（1987-），碩士研究生，主要從事分子診斷研究。△

，E-mail：1053596072@qq.com。

（2016-01-16）