植物乳桿菌Zhang-LL耐胃腸道逆環(huán)境及降膽固醇特性研究

隋　夢,于立娟,謝遠紅,張紅星

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

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植物乳桿菌Zhang-LL耐胃腸道逆環(huán)境及降膽固醇特性研究

隋夢,于立娟,謝遠紅,張紅星*

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,食品質(zhì)量與安全北京實驗室,北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

利用從發(fā)酵米粉中篩選出的一株植物乳桿菌Zhang-LL探討其胃腸道耐受性及體外降膽固醇功效。本實驗分別在pH1.5～3.0、膽鹽濃度0.1%～0.5%的條件下模擬人體胃腸道環(huán)境,采用活菌計數(shù)法檢測菌株Zhang-LL耐胃腸道逆環(huán)境特性及鄰苯二甲醛法檢測降膽固醇效果。結(jié)果表明:初始菌數(shù)為1×107CFU/mL的植物乳桿菌Zhang-LL在pH1.5～3.0的環(huán)境中3 h后,活菌數(shù)仍可達106CFU/mL;在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環(huán)境中8 h,活菌數(shù)可達105～107CFU/mL;體外膽固醇降低率在20.69%～35.68%范圍。研究表明植物乳桿菌Zhang-LL具有較強的耐胃腸道逆環(huán)境特性及良好的降膽固醇能力,為開發(fā)研制降膽固醇功能食品及微生態(tài)制劑提供了實驗基礎(chǔ)。

植物乳桿菌,降膽固醇,胃腸道,耐受性

隨著生活水平的提升,人們對高營養(yǎng)食品的追求也越來越多,然而意味著食品中的膽固醇含量偏高。大量流行病學(xué)調(diào)查、科學(xué)實驗及臨床干預(yù)已經(jīng)證明,攝入過多膽固醇而導(dǎo)致的動脈粥樣硬化,血脂水平升高等是各種心腦血管疾病的主要原因[1]。因此,降低血清中膽固醇的水平直接關(guān)系到人類的健康情況。很多研究者致力于降低人體血清中膽固醇含量,防止高血脂相關(guān)疾病發(fā)生的研究[2-3]。Mann[4]很早研究發(fā)現(xiàn),非洲Maasai人大量食用發(fā)酵的乳制品,其體內(nèi)膽固醇含量普遍較低。這引起了營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的注意,從而掀起了乳酸菌降膽固醇作用的研究熱潮。學(xué)者們開始系統(tǒng)地研究能直接降解膽固醇的微生物,將其應(yīng)用于低膽固醇食品的開發(fā)。

學(xué)者們在動物模型和人體實驗對益生菌降低血漿膽固醇的研究取得了相應(yīng)成效[5-6]。Anderson[7]等人讓48名高膽固醇血癥患者在每日晚餐后服用含有嗜酸乳桿菌L1的發(fā)酵酸奶。經(jīng)過10周的實驗,得到結(jié)果,與對照組相比,L1組的血漿膽固醇平均水平下降了約2.4%(p<0.05)。Nguyen[8]等釆用提取自嬰兒糞便中的植物乳桿菌PH04對小鼠上進行降膽固醇的實驗,他們對12只雄性小鼠分別給予每天4×108CFU/mL劑量的植物乳桿菌PH04,14 d后檢測血脂指標。結(jié)果顯示,PH04組小鼠的血漿總膽固醇下降了7%左右,而血漿甘油三酯下降了約10%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。國內(nèi)有關(guān)降膽固醇乳酸菌的研究起步較晚,近幾年才開始篩選功能性菌株并研究相關(guān)功能與機制。謝寧[9]、李婷婷[10]等都在高脂血癥大鼠上驗證了益生菌的降膽固醇功效。

本研究采用從天然發(fā)酵米粉中篩選得到的一株植物乳桿菌Zhang-LL,利用活菌計數(shù)法檢測其在不同酸性環(huán)境及膽鹽濃度下的耐受情況,同時模擬胃腸道逆環(huán)境,以鄰苯二甲醛法測定其體外降膽固醇能力,為該類產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Zhang-LL北京農(nóng)學(xué)院食品與工程學(xué)院F123室保藏菌種;葡萄糖、乙醇、冰乙酸北京化工廠;蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、膽鹽、膽固醇北京奧博星生物技術(shù)有限公司;無水乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、吐溫-80、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲醛、氫氧化鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂北京精求化工有限責(zé)任公司;硫酸錳廣東汕頭西隴化學(xué)廠;瓊脂、蔗糖酯北京暢華志誠科技有限公司。

BS224S型精密電子天平德國Sartorius集團;MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋日本SANYO公司;BCN-1360B型無菌超凈工作臺哈爾濱東聯(lián)公司;WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;PHS-3B型雷磁便攜式酸度計上海精科;QL-901型旋渦振蕩器海門市其林貝爾公司;JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;WFJ-2100型可見光分光光度計龍尼柯(上海)儀器有限公司;BIOFUGE STRATOS大容量臺式冷凍離心機美國Thermo ScientificDW-40L262;低溫保存箱海爾集團Haier。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化將保藏在實驗室-80 ℃冰箱中的菌株用移液槍取100 μL接種到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,將活化一代的菌種以2%的接種量接種于100 mL滅菌的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,得到擴大培養(yǎng)液,4 ℃冷藏。

1.2.2菌落計數(shù)方法在無菌超凈工作臺中將待測樣品利用旋渦振蕩器搖勻,振蕩時間不少于30 s,對樣品進行十倍梯度稀釋。根據(jù)預(yù)計活菌數(shù)選擇3個適當稀釋梯度,吸取1 mL待測稀釋菌液以傾注平板法倒入MRS培養(yǎng)基平板中,快速搖勻,靜置10 min,于37 ℃倒置培養(yǎng)36～48 h,進行菌落計數(shù)[11],調(diào)整活菌數(shù)約為1×107CFU/mL。

1.2.3耐酸實驗將活化2代的菌液以2%的接種量分別接種于已用HCl調(diào)節(jié)pH為1.5、2.0、2.5、3.0的MRS液體培養(yǎng)基中,以MRS液體培養(yǎng)基(pH6.5)作為空白對照,在37 ℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)3 h,設(shè)定在0、1、2、3 h時間點分別取樣分析,用滅菌PBS緩沖液進行10倍梯度稀釋,在適宜稀釋度取100 μL接種于MRS平板,每個稀釋度3個平行樣,37 ℃培養(yǎng)36～48 h后計數(shù)。繪制植物乳桿菌Zhang-LL的生長曲線,從而檢測菌株對酸的耐受能力。

1.2.4耐膽鹽實驗將活化2代的菌液以2%的接種量分別接種到含0.10%、0.30%、0.50%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,以不含膽鹽的MRS培養(yǎng)基作為空白對照,在37 ℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)8 h,每2 h取樣,用滅菌PBS緩沖液10倍稀釋,在適宜稀釋度取100 μL接種于MRS平板,每組3個平行,37 ℃培養(yǎng)36～48 h后測定發(fā)酵液中的活菌數(shù),繪制植物乳桿菌Zhang-LL的生長曲線,比較菌株生長與膽鹽含量的關(guān)系,以判斷其對膽鹽的耐受性。

1.2.5模擬胃腸道逆環(huán)境降膽固醇能力實驗

1.2.5.1標準曲線的繪制將1 mg/mL的膽固醇標準母液[12]配制成濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的工作液。然后取0.5 mL工作液,置于60 ℃水浴中蒸干溶劑,加入0.5 mL含0.3%牛膽鹽MRS液體培養(yǎng)基,采用鄰苯二甲醛法進行測定,空白為4 mL鄰苯二甲醛顯色劑和2 mL濃硫酸混合體,實驗三次平行。以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,進行函數(shù)擬合得到曲線回歸方程,用于計算膽固醇的質(zhì)量濃度。

膽固醇移除率(%)=(1-ρ1∕ρ0)×100

式中:ρ1為培養(yǎng)后上清液膽固醇的質(zhì)量濃度;ρ0為初始培養(yǎng)基膽固醇的質(zhì)量濃度。

1.2.5.2實驗方法首先制備膽固醇MRS-CHOL培養(yǎng)基[13-14],準確稱取0.1 g膽固醇,放入小燒杯中,繼續(xù)添加0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫-80,并攪拌均勻,再加入5 mL冰乙酸,60 ℃水浴加熱溶解后再用超聲波破碎機進行破碎處理,趁熱用0.22 μm的濾膜將溶解液過濾,直接加入到配制好的已高壓滅菌的MRS培養(yǎng)基中,一邊加入一邊攪拌,使其形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液,得到約含0.1 mg/mL膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基。用無菌的6 mmol/L NaOH調(diào)培養(yǎng)基pH在6.0～7.0之間。將植物乳桿菌Zhang-LL在MRS培養(yǎng)基中活化2代后,按10%接種至pH為3.0的PBS緩沖液中(模擬胃環(huán)境),37 ℃靜置培養(yǎng),分別于0、30、60、90、120 min時間段取樣,離心收集菌體,用生理鹽水離心洗滌1次,將全部菌泥轉(zhuǎn)至含有0.3%牛膽鹽、0.1 mg/mL膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中。經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)8 h后,在550 nm處分別測定膽固醇質(zhì)量濃度的吸光值(A550 nm)。每組實驗做三個平行,在培養(yǎng)前和培養(yǎng)后分別取樣,并以未接菌的含有0.3%牛膽鹽、0.1 mg/mL膽固醇的液體MRS培養(yǎng)基中為空白對照。膽固醇質(zhì)量濃度采用鄰苯二甲醛法[15]進行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1耐酸實驗

益生菌要在腸道存活并發(fā)揮益生作用的前提是耐受胃中的酸性環(huán)境。食物在胃里消化時間,一般為1～3 h。人體空腹胃液pH為0.9～1.8,在進食過程中pH會有所上升,維持在3.0左右,但在消化過程中由于胃酸的分泌,胃液pH又下降[16]。因此本實驗將植物乳桿菌接種于pH1.5、2.0、2.5、3.0的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h以檢測對胃酸的耐受性,以正常MRS培養(yǎng)基(pH6.5)作對照,結(jié)果見圖1。

由圖1所示,植物乳桿菌Zhang-LL在pH為3.0的條件下,經(jīng)過1 h的培養(yǎng),活菌數(shù)基本保持不變,之后隨培養(yǎng)時間延長活菌數(shù)逐漸上升,這表明此植物乳桿菌菌株能在偏酸性環(huán)境中生長良好;在pH2.5條件下,經(jīng)過3 h的培養(yǎng)活菌數(shù)基本保持不變;在pH2.0和pH1.5環(huán)境下,隨著培養(yǎng)時間的延長活菌數(shù)逐漸下降,但經(jīng)過3 h后活菌數(shù)仍可達到106CFU/mL。結(jié)果表明,此菌株在pH1.5～3.0作用3 h活菌數(shù)可達106CFU/mL,具有較高耐酸能力,能夠在胃中存活并進入腸道。這與靳志強[17]的研究結(jié)果:植物乳桿菌H13可耐受pH2.5及pH3的酸性環(huán)境,作用3 h后活菌數(shù)能達到106CFU/mL的結(jié)果相近。

圖1　植物乳桿菌Zhang-LL的耐酸性實驗Fig.1　Acid tolerance test result of Lactobacillus plantarum Zhang-LL

2.2耐膽鹽實驗

小腸是膽固醇的吸收場所,亦是乳酸菌發(fā)揮降膽固醇功能的主要部位。在人體腸液中正常膽汁酸鹽質(zhì)量濃度為0.30%～0.50%,食物在腸道中通過時間一般為6～8 h[14]。所以本實驗測定植物乳桿菌Zhang-LL在0.10%、0.30%、0.50%(m/v)的膽鹽培養(yǎng)基中生長檢測其對膽鹽的耐受性,以未添加膽鹽的MRS培養(yǎng)基作為對照,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,在膽鹽濃度為0.10%的MRS培養(yǎng)基中,受到膽鹽的影響初始階段植物乳桿菌Zhang-LL活菌數(shù)有所降低,經(jīng)過4～6 h后開始逐漸上升,當培養(yǎng)時間達到8 h時,活菌數(shù)明顯上升,可達到107CFU/mL。菌株在膽鹽濃度為0.30%條件下,開始活菌數(shù)明顯下降,之后基本保持不變,培養(yǎng)至6 h后又逐漸上升,這可能是由于菌株適應(yīng)了膽鹽環(huán)境的結(jié)果;菌株在膽鹽濃度為0.50%條件下,活菌數(shù)明顯下降,但能保持在106CFU/mL附近,具有較強的膽鹽耐受能力。結(jié)果表明,菌株在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環(huán)境中生存8 h活菌數(shù)可達105～107CFU/mL,可見植物乳桿菌Zhang-LL對膽鹽具有良好的耐受性,能夠在腸道中存活并發(fā)揮益生作用。

圖2　植物乳桿菌Zhang-LL的耐膽鹽實驗結(jié)果Fig.2　Bile salt tolerance test result of Lactobacillus plantarum Zhang-LL

2.3降膽固醇能力實驗

2.3.1膽固醇測定標準曲線以膽固醇濃度(μg/mL)為橫坐標,550 nm下的吸光度值為縱坐標,所得的擬合直線方程為:y=0.0022x+0.0009,R2=0.9970。

2.3.2模擬胃腸道逆環(huán)境降膽固醇能力實驗?zāi)M胃腸環(huán)境實驗結(jié)果表明,植物乳桿菌Zhang-LL對模擬胃酸環(huán)境(pH1.5～3.0)和膽汁鹽環(huán)境(0.1%～0.5%)均表現(xiàn)出較強的耐受性。因此,本實驗?zāi)M胃腸道逆環(huán)境進行降膽固醇能力實驗。

由表1實驗結(jié)果可知,在胃酸環(huán)境(pH3.0)中菌體的培養(yǎng)時間對于乳酸菌體外降膽固醇能力有顯著性影響(p<0.05)。菌株Zhang-LL對膽固醇的降低率范圍在20.69%～35.68%之間,當菌液不經(jīng)過胃酸時,在1.57 μg/mL膽固醇含量0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中經(jīng)過8 h培養(yǎng),膽固醇的降低率最高為35.68%。在pH3.0 PBS緩沖液中培養(yǎng)時間越長,其在膽固醇培養(yǎng)液中膽固醇的降低率越小,隨著菌體在胃酸培養(yǎng)時間的增長,菌株Zhang-LL在培養(yǎng)基中的降膽固醇能力逐漸下降。當培養(yǎng)時間達到120 min時,膽固醇的降低率為20.69%。出現(xiàn)這種情況的原因可能是菌株活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增長逐漸下降,但仍有大部分菌株存活,故還存在降膽固醇能力。由以上結(jié)果可知,植物乳桿菌Zhang-LL具有體外降膽固醇能力,為進一步研究植物乳桿菌Zhang-LL的降膽固醇作用機理以及開發(fā)具有降膽固醇特性的產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

表1　植物乳桿菌Zhang-LL膽固醇含量的移除率

注:表中為Bonferroni t-test測驗結(jié)果,在同一列數(shù)據(jù)中,相同字母則表示差異不顯著,不同字母則表示差異顯著(p<0.05)。

乳酸菌降膽固醇的作用機理主要包括同化吸收作用[15],共沉淀作用[18]、細胞膜吸附膽固醇作用[19]等。本實驗中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Zhang-LL作用機理目前還不明確,還需要進一步實驗說明是以何種途徑降低膽固醇。并且對其體內(nèi)的降膽固醇作用機理還需要進一步探索與研究。而且降解膽固醇的程度還和菌株培養(yǎng)時間有關(guān)系,Zhao等[20]人的研究結(jié)果表明了在培養(yǎng)時間為12 h時對乳酸菌有最大的移除量,李常營[21]等人又研究了酸菜來源的植物乳桿菌S4-5在指數(shù)期結(jié)束(培養(yǎng)時間為14 h)之際,膽固醇的移除率最大,為66.7%。所以,實驗菌株Zhang-LL可以在高膽固醇培養(yǎng)液中進一步長時間培養(yǎng),以計算出其最高降膽固醇移除率。

3　結(jié)論

菌株的初始接種量為1×107CFU/mL,經(jīng)耐酸、耐膽鹽實驗,活菌數(shù)仍在105CFU/mL以上,表明有足夠數(shù)量的植物乳桿菌Zhang-LL通過胃腸道而保持活性,證明了此菌株對酸及膽鹽具有較高的耐受性,能夠在胃中存活并進入腸道。同時模擬胃腸道逆環(huán)境,以鄰苯二甲醛法測定其體外降膽固醇能力,其體外膽固醇降低率在20.69%～35.68%范圍之間;當菌液不經(jīng)過胃酸時,8 h培養(yǎng)后膽固醇的移除率最高為35.68%。當菌液經(jīng)過胃酸120 min時,膽固醇的降低率最低為20.69%。本實驗室保藏的菌株Zhang-LL在體外表現(xiàn)為一株具有良好降膽固醇能力的菌株,為進一步研究其體內(nèi)降膽固醇作用及移除膽固醇的作用機理提供參考。

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Study on tolerance characteristics of the gastrointestinal tract and cholesterol-lowering effects ofLactobacillusplantarumZhang-LL

SUI Meng,YU Li-juan,XIE Yuan-hong,ZHANG Hong-xing*

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Faculty of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

The tolerance characteristics of the gastrointestinal tract and cholesterol-lowering effects ofLactobacillusplantarumZhang-LL isolated from fermented rice noodles in Bama,Guangxi Province were investigated. Viable count was firstly used in this study to detect the tolerance characteristics under simulated gastrointestinal tract environment pH1.5～3.0. Additionally,bacterial growth was evaluated in the presence of 0.10%～0.50% bile salt. O-phthalaldehyde was used to detect its cholesterol-lowering capability. The results showed thatLactobacillusplantarumZhang-LL’s number of viable bacteria was still up to 106CFU/mL after 3 h under pH1.5～3.0,whose initial bacterial count was 1×107CFU/mL. And being cultured for 8 h in the MRS-broth(0.10%～0.50% bile salt),the viable count reached nearly to 105～107CFU/mL. A cholesterol removal rate ranging from 20.69% to 35.68% was observed under varying conditions. It showed thatLactobacillusplantarumZhang-LL had a strong capability of anti gastric intestinal reverse environment and good cholesterol lowering ability,which provided the experimental basis for the development of cholesterol-lowering functional food and micro ecological preparation.

Lactobacillusplantarum;cholesterol-lowering;gastrointestinal tract;tolerance

2016-02-17

隋夢(1992-),女,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全,E-mail:15117957701@163.com。

張紅星(1970-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,食品安全檢測與控制,E-mail:hxzhang@163.com。

北京市長城學(xué)者培養(yǎng)計劃(CIT&TCD20140315)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.036