脫落酸對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成的影響

陶曉亞,李家寅,韓雪源,黃　斯,茅林春

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

?

脫落酸對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成的影響

陶曉亞,李家寅,韓雪源,黃斯,茅林春*

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

為研究脫落酸(abscisic acid,ABA)對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成的影響,以綠熟期櫻桃番茄為材料,對果實(shí)損傷處理后,分別用ABA及其合成抑制劑氟啶酮(fluridone,FLD)抽真空滲透處理,黑暗條件下貯藏愈傷,每天取樣測定相關(guān)生理指標(biāo)。測定了果實(shí)失重率,傷口部位的總酚、類黃酮含量及相關(guān)酶活性,丙二醛(MDA)含量。結(jié)果表明:與對照相比,ABA處理減緩果實(shí)失重率升高,可有效促進(jìn)傷口部位總酚、類黃酮的積累,提高與此相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,降低丙二醛(MDA)含量,減少傷口部位氧化損傷,加速傷口愈合;FLD處理則起相反作用,加劇傷口部位氧化損傷,減緩傷口愈合進(jìn)程。以上結(jié)果說明,ABA對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成具有促進(jìn)作用。

脫落醛,采后,番茄,愈傷,次生代謝物質(zhì),酶活性

果蔬采后易受機(jī)械損傷,這將導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降,經(jīng)濟(jì)價值降低[1]。在生物化學(xué)方面,機(jī)械損傷將誘發(fā)一系列脅迫生理反應(yīng)以促進(jìn)傷口愈合,例如受苯丙氨酸解氨酶(PAL)調(diào)控的苯丙烷類代謝速度加快,誘導(dǎo)傷口及鄰近部位合成更多的酚類和類黃酮等次生代謝物質(zhì)[2-4]。另一方面,植物受損傷脅迫時,細(xì)胞膜會發(fā)生膜質(zhì)過氧化,造成氧化損傷。這將增加植物體內(nèi)與抗氧化相關(guān)的酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的含量。SOD和CAT是果蔬中最主要的活性氧清除劑,能有效地清除自由基,減輕過量自由基對果蔬的毒害作用。

脫落酸(abscisic acid,ABA)是一種植物衰老相關(guān)激素,具有抑制種子萌發(fā)、促進(jìn)氣孔關(guān)閉、促進(jìn)衰老等作用。而其在逆境脅迫下,能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,是植物的抗逆誘導(dǎo)因子,被稱為植物的“脅迫激素”[5]。當(dāng)植物處于干旱、損傷等不利環(huán)境時,體內(nèi)ABA含量大增,啟動自我修復(fù)機(jī)制,阻止有害物質(zhì)的進(jìn)一步侵害[6]。目前,關(guān)于ABA促進(jìn)損傷愈合的研究主要集中在馬鈴薯塊莖方面,而其對采后果蔬愈傷及次生代謝物質(zhì)合成的研究鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)采用ABA及其合成抑制劑氟啶酮(fluridone,FLD)處理損傷的番茄果實(shí),研究ABA對果實(shí)愈傷過程總酚和類黃酮物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的影響,以期為加速采后番茄傷口愈合提供理論依據(jù)。

表1　番茄果實(shí)傷口部位ABA含量

注:不同字母代表相同處理組不同貯存時間的樣品差異顯著(p<0.05)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

綠熟期櫻桃番茄“新太陽”采自浙江省蕭山市溫室,于采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,挑選形狀、大小一致,無機(jī)械損傷的番茄果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料;ABA(≥ 90%)、沒食子酸(>99%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、l-苯丙氨酸(≥ 98.5%)、甲硫氨酸(≥ 99%)上海Aladdin試劑有限公司;蘆丁(≥ 98%)、考馬斯亮藍(lán)G-250(≥ 85%)、氮藍(lán)四唑(NBT,≥ 98%)、核黃素(97.5%～102.0%)上海國藥集團(tuán);FLD(99.8%)德國Fluka Analytical;牛血清白蛋白(>98%)上海生工生物工程股份有限公司;其余試劑均為分析純。

Agilent 6460 HPLC-MS美國Agilent 科技有限公司;UV-1750紫外可見分光光度計日本島津公司;UNIVERSAL 320R臺式高速離心機(jī)德國Hettich Lab Technology;SHZ-D III循環(huán)水式多用真空泵杭州明遠(yuǎn)儀器有限公司;HWS型恒溫恒濕箱寧波東南儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理用0.5%次氯酸鈉溶液清洗果實(shí)表面,無菌去離子水沖洗后室溫晾干備用。參考Dean和Kolattukudy[7]的方法進(jìn)行損傷處理:用經(jīng)75%酒精擦拭消毒的手術(shù)刀在果實(shí)赤道處對稱切除2個直徑約10 mm、厚度1～2 mm的薄片。將損傷后的果實(shí)隨機(jī)分成3組,分別用1.0 mmol/L ABA、0.1 mmol/L FLD和無菌去離子水(對照)抽真空處理(0.07 MPa,5 min)。室溫自然晾干后于黑暗條件下(20 ℃,90% RH)貯藏愈傷。每天取樣時用已消毒的打孔器切取愈傷組織(10 mm×3 mm),液氮迅速冷凍,于-80 ℃冰箱中保存待用。處理方法和藥品濃度均根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。

1.2.2ABA含量測定參考Chen等[8]的方法提取ABA,采用HPLC-MS測定ABA含量。進(jìn)樣柱型號規(guī)格:ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm× 150 mm×3.5 μm)。流動相A為甲醇,B為0.1%甲酸,洗脫體系:0～1.5 min,40% A;1.5～8 min,40% A升至100% A;8～10 min,100% A降至40% A;10～17 min,40% A。柱溫:35 ℃,流速:300 μL/min,進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.3總酚和類黃酮含量測定稱取約1 g樣品,加入6 mL 40%的乙醇溶液充分研磨后,60 ℃水浴保溫1 h,9000×g離心15 min,上清液用于測定總酚和類黃酮含量。

總酚含量測定參考Toor和Savage[9]的方法,結(jié)果以每100 g樣品中相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)表示,即mg/100 g。類黃酮含量測定采用Zhishen等[10]的方法,結(jié)果以每100 g樣品中相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)表示,即mg/100 g。

1.2.4損傷番茄果實(shí)失重率測定

失重率(%)=(m0-mt)/m0×100

式中,m0:果實(shí)初始質(zhì)量;mt:果實(shí)檢測時的質(zhì)量。

1.2.5酶活性測定稱取約1 g樣品,分別加入4 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L硼酸硼砂緩沖液(pH8.7,含3 g/L PVP,1 mmol/L EDTA)和50 mmol/L PBS(pH7.8,含1 mmol/L EDTA,2 g/L PVP),冰浴研磨,所得勻漿于4 ℃下9000×g離心15 min,上清液分別用于PAL、SOD和CAT活性測定。

PAL活性測定方法參考Yingsanga等[11],以波長290 nm處吸光度值每小時增加0.01為1 U,表示為U/mg(蛋白)。

可溶性蛋白含量測定參考Bradford[12]。

SOD活性測定參考Stewart和Bewley[13],以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個酶活力單位U,以U/g(FW)表示。

CAT活性測定參考曹建康等[14],以1 min內(nèi)吸光度值減少0.01為一個酶活力單位U,以U/g(FW)表示。

1.2.6丙二醛(MDA)含量測定MDA含量測定參考曹建康等[14]的方法。

1.2.7數(shù)據(jù)處理以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。采用SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1番茄傷口部位ABA含量變化

ABA組番茄傷口部位ABA含量在愈傷期間始終高于對照組,表明真空滲透處理方法是卓有成效的,可以保證整個愈傷過程中傷口部位ABA含量維持在較高水平。FLD組ABA含量在愈傷前2 d與對照組無明顯差異(p>0.05),從第3 d開始明顯低于對照組(p<0.05),表明FLD可以抑制果實(shí)傷口部位合成新的ABA。

2.2ABA對番茄果實(shí)失重率的影響

愈傷可減少傷口表面水分蒸發(fā),愈合程度越高,水分蒸發(fā)越慢,失重率越小,因此,可用失重率來反映損傷愈合程度。隨貯存時間增加,三組處理番茄果實(shí)失重率逐漸上升,但處理組間上升程度有差異(圖1)。貯存第1 d,ABA組與對照組無顯著差異(p>0.05),貯存第2 d,FLD組與對照組差異不大(p>0.05),貯存后期,三組處理差異顯著(p<0.05)。ABA組始終低于對照組,FLD組始終高于對照組,因此采用ABA處理番茄傷口后,可以明顯促進(jìn)愈傷,抑制水分蒸發(fā),降低失重率。

圖1　損傷番茄果實(shí)失重率變化Fig.1　Changes of weight loss in wounded tomato fruit

2.3ABA對番茄傷口處總酚和類黃酮含量的影響

番茄果實(shí)愈傷過程總酚含量總體表現(xiàn)為升高、降低、升高(圖2)。損傷后ABA組總酚含量立即升高,第2 d達(dá)到最大值,是愈合前的1.23倍,愈合后期含量基本穩(wěn)定,始終高于對照組。FLD組和對照組則稍有降低,之后升高,第2 d達(dá)到最大值,分別是愈合前的1.08倍和1.15倍,兩者變化趨勢基本一致,FLD組始終低于對照組,兩者有明顯差別(p<0.05)。愈合后期,各處理組果實(shí)總酚含量無顯著差異(p>0.05)。

圖2　番茄果實(shí)傷口部位總酚含量Fig.2　Total phenol content in wound tissues of tomato fruit

番茄傷口部位類黃酮含量隨愈合時間延長逐漸增加(圖3)。ABA組類黃酮含量始終高于對照組,FLD組則始終低于對照組。愈合第1 d,FLD組與對照組無顯著差異(p>0.05),愈合第2 d,ABA組與對照組無顯著差異(p>0.05)。愈合第3、4 d,ABA和FLD組與對照組相比,分別增加5.69%、5.84%,降低8.21%、13.25%。

圖3　番茄果實(shí)傷口部位類黃酮含量Fig.3　Flavonoids content in wound tissues of tomato fruit

2.4ABA對PAL活性的影響

愈傷可誘導(dǎo)PAL產(chǎn)生,其活性可作為植物抗逆能力的重要指標(biāo)[15]。圖4顯示,在番茄愈傷期間PAL活性先升高后降低。愈合第1 d,ABA和FLD組與對照組相比,酶活性分別增加了110.68%、降低了17.42%。愈合第3 d,ABA組和對照組酶活性達(dá)到最大值,分別是愈合前的5.17倍、3.79倍,而FLD組是愈合前的2.33倍。ABA組PAL活性明顯高于對照組(p<0.05),FLD組初期與對照組差異不顯著(p>0.05),后期明顯低于對照組(p<0.05)。

圖4　番茄果實(shí)傷口部位PAL活性Fig.4　PAL activity in wound tissues of tomato fruit

2.5ABA對SOD、CAT活性的影響

圖5　番茄果實(shí)傷口部位SOD活性Fig.5　SOD activity in wound tissues of tomato fruit

SOD對果蔬細(xì)胞清除活性氧起重要作用,其活性高低反映果蔬的抗逆能力。圖5顯示隨貯存時間增加SOD活性先升高后降低。貯存第1 d,對照組與ABA組SOD活性達(dá)到最大值,三個處理組差異顯著(p<0.05),與第0 d相比,對照組、FLD組和ABA組分別增加了22.19%、12.37%和41.77%。隨貯存時間延長,三組處理SOD活性逐漸降低,ABA組始終高于對照組,FLD組始終低于對照組,愈合后期三組處理之間差異顯著(p<0.05)。

圖6反映了不同處理番茄果實(shí)損傷部位CAT活性變化情況。損傷后ABA組CAT活性立即升高,之后緩慢下降,但始終高于對照組,對照組和FLD組則呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢,FLD組始終低于對照組。愈合初期,三個處理組CAT含量差異顯著(p<0.05),愈合第1 d,對照組、FLD組和ABA組分別是愈合前的0.92倍、0.82倍和1.14倍。愈合后期,對照組和FLD組差異不顯著(p>0.05),ABA組與對照組相比,始終差異顯著(p<0.05)。

圖6　番茄果實(shí)傷口部位CAT活性Fig.6　CAT activity in wound tissues of tomato fruit

2.6ABA對傷口處MDA含量的影響

機(jī)械損傷導(dǎo)致活性氧大量積累而促進(jìn)膜質(zhì)過氧化,MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其積累量可以反映果實(shí)在逆境下受傷害的程度[16]。由圖7可知,番茄愈傷過程MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。愈合第1 d,三組處理MDA含量無顯著差異(p>0.05),隨愈合時間延長,MDA含量逐漸降低且差距逐漸加大。愈合第2 d,與對照組相比,FLD組MDA含量下降緩慢,與第1 d無明顯差別(p>0.05),ABA組則下降最快,但與對照組差別不大(p>0.05)。愈合第3、4 d,三組處理MDA含量有明顯差異(p<0.05),FLD組高于對照組,ABA組則低于對照組,但都高于第0 d。

圖7　番茄果實(shí)傷口部位MDA含量Fig.7　MDA content in wound tissues of tomato fruit

3　討論

ABA組番茄傷口部位ABA含量始終保持較高水平,FLD組則始終保持較低水平,這是因?yàn)镕LD能有效抑制ABA合成前體類胡蘿卜素的形成,阻礙ABA合成[17]。

PAL是苯丙烷代謝的限速酶,調(diào)控代謝產(chǎn)物總酚和類黃酮等次生代謝物質(zhì)的合成。本實(shí)驗(yàn)中,愈合部位總酚和類黃酮含量的整體變化趨勢與PAL活性變化結(jié)果基本一致。ABA處理使這兩種次生代謝物質(zhì)含量增加,PAL活性升高,增強(qiáng)果實(shí)對逆境的抵抗能力。這與對馬鈴薯塊莖研究的相關(guān)報道相一致[18-20]。而FLD處理則起相反作用[18],當(dāng)ABA合成受阻時,損傷處誘導(dǎo)的PAL活性降低,施加ABA后,該誘導(dǎo)作用部分恢復(fù)[21]。此外,也有報道稱ABA處理能提高鎖陽莖PAL活性[22]。

SOD可催化超氧化物的歧化反應(yīng),是清除活性氧反應(yīng)的第一個抗氧化酶,CAT可清除過氧化氫,兩者對植物防御氧化損傷起重要作用[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在損傷初期,SOD活性快速增加,這可能是由于損傷打破了番茄組織細(xì)胞中酶和底物的空間區(qū)域化分布,使得兩者結(jié)合,酶活性增加[24]。之后活性逐漸降低,這可能是因?yàn)殡S愈合時間增加,活性氧毒性逐漸減弱,果實(shí)抗性逐漸增強(qiáng)。與對照相比,ABA處理能顯著提高番茄傷口部位SOD與CAT活性,增強(qiáng)果實(shí)對損傷脅迫的抵抗能力,加速傷口清除自由基,減緩氧化損傷,提高番茄果實(shí)對損傷的抗性,這與段園園[22]等對鎖陽莖CAT活性研究結(jié)果基本一致。膜質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA是反映果蔬受傷害程度的一個重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中,損傷使得傷口表面細(xì)胞膜遭到破壞,誘導(dǎo)傷口部位MDA含量迅速上升,膜質(zhì)過氧化加劇,隨著傷口逐漸愈合,MAD含量也呈下降趨勢。與此對比,ABA處理能減輕傷口處細(xì)胞膜系統(tǒng)的受傷害程度,這可能與ABA促進(jìn)傷口部位SOD和CAT活性升高有關(guān)。

4　結(jié)論

與對照相比,ABA處理減緩果實(shí)失重率升高,可有效促進(jìn)傷口部位總酚、類黃酮的積累,提高與此相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,降低丙二醛(MDA)含量,減少傷口部位氧化損傷,加速傷口愈合;FLD處理則起相反作用,加劇傷口部位氧化損傷,減緩傷口愈合進(jìn)程。以上結(jié)果說明,ABA對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成具有促進(jìn)作用。

[1]潘永貴,施瑞城. 采后果蔬受機(jī)械傷害的生理生化反應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)通訊,2000,36(6):568-572.

[2]Miller A R. Physiology,biochemistry and detection of bruising(mechanical stress)in fruits and vegetables[J]. Postharvest News and Information(United Kingdom),1992,3(3):53-58.

[3]彭麗桃,楊書珍. 適度加工果蔬生理特性及質(zhì)量控制措施[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2002,18(3):178-185.

[4]Diallinas G,Kanellis A K. A phenylalanine ammonia-lyase gene from melon fruit:cDNA cloning,sequence and expression in response to development and wounding[J]. Plant Molecular Biology,1994,26(1):473-479.

[5]Mantyla E,Lang V,Palva E T. Role of abscisic acid in drought-induced freezing tolerance,cold acclimation,and accumulation of LT178 and RAB18 proteins in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiology,1995,107(1):141-148.

[6]郝格格,孫忠富,張錄強(qiáng),等. 脫落酸在植物逆境脅迫研究中的進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2009,25(18):212-215.

[7]Dean B B,Kolattukudy P E. Synthesis of suberin during wound-healing in jade leaves,tomato fruit,and bean pods[J]. Plant Physiology,1976,58(3):411-416.

[8]Chen J,Mao L,Mi H,et al. Detachment-accelerated ripening and senescence of strawberry(Fragaria×ananassaDuch. cv. Akihime)fruit and the regulation role of multiple phytohormones[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2014,36(9):2441-2451.

[9]Toor R K,Savage G P. Antioxidant activity in different fractions of tomatoes[J]. Food Research International,2005,38(5):487-494.

[10]Zhishen J,Mengcheng T,Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals[J]. Food Chemistry,1999,64(4):555-559.

[11]Yingsanga P,Srilaong V,Kanlayanarat S,et al. Relationship between browning and related enzymes(PAL,PPO and POD)in rambutan fruit(NepheliumlappaceumLinn.)cvs. Rongrien and See-Chompoo[J]. Postharvest Biology and Technology,2008,50(2):164-168.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry,1976,72(1):248-254.

[13]Stewart R R C,Bewley J D. Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes[J]. Plant Physiology,1980,65(2):245-248.

[14]曹建康,姜微波,趙玉梅. 果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2007.

[15]Stadnik M J,Buchenauer H. Inhibition of phenylalanine ammonia-lyase suppresses the resistance induced by benzothiadiazole in wheat toBlumeriagraminisf. sp. tritici[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology,2000,57(1):25-34.

[16]陳少裕. 膜脂過氧化與植物逆境脅迫[J]. 植物學(xué)報,1989(4):211-217.

[17]Gamble P E,Mullet J E. Inhibition of carotenoid accumulation and abscisic acid biosynthesis in fluridone-treated dark-grown barley[J]. European Journal of Biochemistry,1986,160(1):117-121.

[18]Lulai E C,Suttle J C,Pederson S M. Regulatory involvement of abscisic acid in potato tuber wound-healing[J]. Journal of Experimental Botany,2008,59(6):1175-1186.

[19]吳覺天. 采后ABA和BTH處理對馬鈴薯塊莖快速愈傷的作用及部分機(jī)理[D]. 蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[20]Soliday C L,Dean B B,Kolattukudy P E. Suberization:inhibition by washing and stimulation by abscisic acid in potato disks and tissue culture[J]. Plant Physiology,1978,61(2):170-174.

[21]Lulai E C,Suttle J C. Signals involved in tuber wound-healing[J]. Plant Signaling & Behavior,2009,4(7):620-622.

[22]段園園,岳鑫,陳貴林. 脫落酸對鎖陽莖切口愈合及抗氧化酶活性的影響[J]. 植物生理學(xué)報,2012,48(3):298-302.

[23]Faize M,Burgos L,Faize L,et al. Involvement of cytosolic ascorbate peroxidase and Cu/Zn-superoxide dismutase for improved tolerance against drought stress[J]. Journal of Experimental Botany,2011,62(8):2599-2613.

[24]申琳,生吉萍,羅云波. 運(yùn)輸中的機(jī)械損傷對貯藏初期蘋果活性氧代謝的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,4(5):107-110.

Effect of abscisic acid on secondary metabolite production during wound-healing in postharvest tomato fruit

TAO Xiao-ya,LI Jia-yin,HAN Xue-yuan,HUANG Si,MAO Lin-chun*

(Department of Food Science and Nutrition,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory of Agro-Food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The effect of abscisic acid(ABA)on wound-healing,secondary metabolite production and related enzyme activities in postharvest mature green cherry tomato fruit was investigated in this study. Tomato fruit were treated under vacuum with ABA and fluridone(FLD)solution after wounding and allowed to heal in the dark. Weight loss of fruit,total phenol,flavonoids and MDA content,and enzyme activities(PAL,SOD,CAT)in wound tissues were determined every day during storage time. The results indicated that weight loss and MDA content were reduced in ABA-treated tomato fruit compared with control. ABA promoted wound-healing process by enhancing total phenol and flavonoids contents as well as PAL,SOD and CAT activities in wound tissues of tomato fruit. However,FLD treatment had the opposite effects. In conclusion,ABA promoted the synthesis of secondary metabolite production during wound-healing in postharvest tomato fruit.

ABA;postharvest;tomato;wound-healing;secondary metabolite production;enzyme activities

2016-01-20

陶曉亞(1990-),女,碩士,研究方向:果蔬采后損傷及修復(fù),E-mail:taoxiaoya00@163.com。

茅林春(1962-),男,博士,教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮,E-mail:linchun@zju.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31372113)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)16-0330-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.058