烘烤對(duì)核桃蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性及乳化性的影響

趙潤(rùn)澤,蔣　將,李進(jìn)偉,劉元法

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

?

烘烤對(duì)核桃蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性及乳化性的影響

趙潤(rùn)澤,蔣將,李進(jìn)偉,劉元法*

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

研究了烘烤增香過(guò)程對(duì)核桃蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性以及乳化性的影響,采用掃描電鏡、圓二色譜等儀器進(jìn)行分析。結(jié)果表明,烘烤處理的蛋白微結(jié)構(gòu)成片狀,α-螺旋結(jié)構(gòu)從42.7%降低至27.6%,β-轉(zhuǎn)角從17.3%增加到25.3%,無(wú)規(guī)則卷曲從24.7%增加到32.7%,β折疊比例不變。界面張力從20.98減少為18.49,表面疏水性從316.14降低為297.55。使用turbiscan多重光散射儀對(duì)蛋白與三種植物油形成的乳化液進(jìn)行分析,其中烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.55,相比較于未處理蛋白形成的乳化液穩(wěn)定性均顯著下降。

核桃蛋白,烘烤,二級(jí)結(jié)構(gòu),表面疏水性,乳化穩(wěn)定性

核桃(JuglansregiaL.)是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、具有經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力的堅(jiān)果。核桃除了可直接食用外,還可加工成核桃油、核桃粉等產(chǎn)品。其中核桃仁蛋白質(zhì)含量在13%～20%[1],其氨基酸種類高達(dá)18種,且谷氨酸含量最高。據(jù)報(bào)道,180 ℃烘烤20 min后的花生蛋白相比于未烘烤的花生蛋白的乳化穩(wěn)定性有顯著提高[2]。此外,大豆蛋白在90 ℃和100 ℃條件下熱處理15 min后乳化性迅速升高,乳化穩(wěn)定性有顯著改善,100 ℃處理30 min乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值[3]。工業(yè)上為核桃油增香多采用烘烤方法,溫度在130 ℃左右,但國(guó)內(nèi)對(duì)增香核桃油生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物核桃粕及其烘烤后性質(zhì)的研究較少。

目前對(duì)乳化穩(wěn)定性分析以觀察分層高度和比較吸光值變化為主[4-5]。但是這兩種方法檢測(cè)精確度較低,不能采用定量方法來(lái)評(píng)價(jià)體系的穩(wěn)定情況。利用近紅外發(fā)射光譜的背散射光穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Stability Index)來(lái)研究乳化液的穩(wěn)定性已經(jīng)成為一種趨勢(shì)[6]。

本文采取烘烤對(duì)核桃蛋白進(jìn)行處理,對(duì)處理后的表面性狀、二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面張力、表面疏水性進(jìn)行測(cè)定,最后采用turbiscan穩(wěn)定性分析儀分析核桃蛋白與不同脂肪酸組成的植物油形成的乳化液的性質(zhì),并對(duì)乳化液2 h內(nèi)的變化情況做動(dòng)態(tài)分析。研究核桃油加工后的核桃蛋白性質(zhì),旨在對(duì)核桃資源進(jìn)行綜合利用,提升核桃產(chǎn)品的附加值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃(JuglansregiaL.)購(gòu)于無(wú)錫農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);大豆油、玉米油、花生油購(gòu)于歐尚超市;乙醇、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

90-1恒溫磁力攪拌器上海滬西分析儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州金壇化學(xué)儀器廠;TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;UV2100紫外可見分光光度計(jì)優(yōu)尼科中國(guó)(上海)公司;PHS-3C pH計(jì)上海上海精密科學(xué)有限公司;OCA15EC接觸角測(cè)量?jī)x德國(guó)德菲儀器股份有限公司;Quanta-200掃描電子顯微鏡荷蘭FEI公司;MOS-450圓二色光譜儀法國(guó)Bio-Logic比奧羅杰公司;turbiscan Lab多重光散射儀法國(guó)formulaction公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料制備

1.2.1.1核桃蛋白制備參照杜蕾蕾[7]等人方法,將去皮核桃仁烘干后粉碎,按照1∶5的料液比進(jìn)行脫脂處理1 h,用濾紙過(guò)濾提取液,收集殘?jiān)?將殘?jiān)俅芜M(jìn)行正己烷處理,直到濾液為無(wú)色為止。收集殘?jiān)湃胪L(fēng)櫥揮干溶劑備用。

1.2.1.2烘烤核桃蛋白制備參照徐月華[8]等人方法,將核桃放入烘箱130 ℃烘烤30 min,然后取出。將核桃仁烘干后粉碎,按照1∶5的料液比進(jìn)行脫脂處理1 h,用濾紙過(guò)濾提取液,收集殘?jiān)?將殘?jiān)俅芜M(jìn)行正己烷處理,直到濾液為無(wú)色為止。收集殘?jiān)湃胪L(fēng)櫥揮干溶劑備用。

1.2.2堿溶酸沉提取蛋白流程脫脂粉→加水溶解(料液比1∶60)調(diào)整pH為11→攪拌1 h→離心(10000 r/min,20 min,4 ℃)→上清液→調(diào)整pH為4.5→攪拌1 h→離心(10000 r/min,20 min,4 ℃)→沉淀→水洗至中性→凍干→得到純度為94.8%的核桃蛋白和91.2%的烘烤核桃蛋白。

1.2.3掃描電鏡觀察參照張海華[9]等人方法,將處理過(guò)的核桃蛋白樣品在干燥器保存15 d后,取少量樣品過(guò)100 目篩,將篩過(guò)的樣品用1%的OsO4固定1 h,以SCD-005離子濺射儀噴金,最后用掃描電子顯微鏡拍照。

1.2.4二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定參照Sreerama[10]等人方法,樣品溶于去離子水中,在25 ℃條件下磁力攪拌3 h,之后在4 ℃以10000×g離心45 min,上清液中蛋白濃度采用BCA試劑盒測(cè)定,最后將上清液蛋白濃度稀釋至50 μg/mL。在25 ℃條件下,采用MOS-450圓二色光譜儀測(cè)定樣品得到遠(yuǎn)紫外CD光譜(190～250 nm)?？瞻撞捎萌ルx子水,用平均摩爾橢圓率[θ](deg cm2·dmol-1)表示。

1.2.5蛋白表面張力測(cè)定參照Azioune[11]等人方法,將蛋白質(zhì)溶于水中,用pH7的磷酸緩沖鹽溶液制成0.1%蛋白質(zhì)溶液。在20 ℃的條件下,使用OCA15EC接觸角測(cè)量?jī)x以50 μL/s速度將蛋白質(zhì)溶液注入大豆油中,在溶液液滴完整掉落時(shí)測(cè)定油水界面張力。

1.2.6蛋白表面疏水性測(cè)定參照Kato[12]等人的方法,配制2%的蛋白溶液,用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)將其分別稀釋至0.5、0.25、0.1、0.05、0.02、0.005 mg/mL。取4 mL稀釋液,加入50 μL的ANS溶液后,用熒光分光光度計(jì)在365 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和484 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖,外推至蛋白質(zhì)濃度為0,曲線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.2.7蛋白乳化穩(wěn)定性

1.2.7.1乳化液的制備將質(zhì)量百分比1%核桃蛋白溶液和10%植物油用高速剪切機(jī)在13500 r/min轉(zhuǎn)速下剪切2 min,再將乳狀液用高壓均質(zhì)機(jī)在40 MPa壓力下均質(zhì)兩次

1.2.7.2乳化穩(wěn)定性測(cè)量將乳液加至樣品瓶中刻度線位置,放入turbiscan Lab多重光散射儀中,使用近紅外光(λ=880 nm)從樣品瓶底部開始掃描,經(jīng)中部到頂部掃描一次。設(shè)置掃描間隔30 s,掃描時(shí)長(zhǎng)2 h,溫度30 ℃。得到不同時(shí)間乳化液背散射光強(qiáng)度曲線圖,根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算穩(wěn)定性指數(shù)(Stability Index)。穩(wěn)定性指數(shù)(Stability Index)由turbiscan軟件基于從樣品瓶底部到頂部共41 mm高度,共2 h時(shí)間內(nèi)背散射光數(shù)據(jù)變化自動(dòng)計(jì)算,數(shù)值越低表明乳化液穩(wěn)定性越好[13]。

1.2.8分析方法所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),利用SPSS Statistics 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1掃描電鏡觀察

通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示?？梢杂^察到烘烤工藝對(duì)核桃蛋白微結(jié)構(gòu)的影響。未處理蛋白顯示出比較稀松的結(jié)構(gòu),烘烤后蛋白呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)加熱處理后,其高級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生去折疊,為避免暴露出疏水基團(tuán),蛋白質(zhì)分子間會(huì)發(fā)生疏水聚集引發(fā)表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化[14]。有研究表明,蛋白質(zhì)微結(jié)構(gòu)不同,對(duì)物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性會(huì)產(chǎn)生一定影響。其中稀松狀結(jié)構(gòu)蛋白體積密度相比于片狀結(jié)構(gòu)較小,有助于提高溶解性和乳化穩(wěn)定性。

圖1　掃描電鏡觀察圖片F(xiàn)ig.1　SEM picture of walnut protein

2.2二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

表1　核桃蛋白CD光譜二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

注:不同組之間字母不相同者表示組間顯著性差異,p<0.05;表2同。

核桃蛋白CD光譜二級(jí)結(jié)構(gòu)分析如表1所示。通過(guò)軟件分析得到,核桃蛋白主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲為主,分別占42.7%和24.7%。通過(guò)烘烤后,在制備過(guò)程中改變了核桃蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),在一定程度上破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu),使得無(wú)規(guī)則卷曲有所上升?？梢酝茢嗪婵咎幚砗笃茐牧说鞍踪|(zhì)分子的氫鍵,使得α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加,從而增大蛋白質(zhì)分子的柔性,對(duì)乳化穩(wěn)定性有明顯影響。

2.3界面張力

核桃蛋白界面張力變化如表2所示。相比未處理蛋白,經(jīng)過(guò)烘烤處理后蛋白質(zhì)的界面張力有一定變化,根據(jù)研究結(jié)果表明,界面張力下降源于聚集體變化,高級(jí)結(jié)構(gòu)展開使蛋白界面上親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)數(shù)量趨于平衡。通過(guò)改性,有助于形成較為穩(wěn)定的乳化液。

表2　核桃蛋白表面疏水性和油水界面張力

2.4表面疏水性

蛋白質(zhì)一般在分子內(nèi)部形成疏水內(nèi)核為非極性氨基酸側(cè)鏈,在表面的親水環(huán)境中分布的為極性氨基酸。表面疏水性比整體的疏水性而言影響著蛋白質(zhì)分子間的相互作用,對(duì)蛋白質(zhì)功能性有影響。表面疏水性如表2所示,烘烤處理蛋白質(zhì)(297.55)表面疏水性相比要未處理蛋白(316.14)略有降低,可見在制備過(guò)程中疏水相互作用引起的亞基之間相互聚合,導(dǎo)致疏水性下降?？梢姾婵咎幚碓谝欢ǔ潭壬辖档土吮砻媸杷?。一般情況下,表面疏水性降低不利于提高乳狀液穩(wěn)定性[15]。

2.5乳化穩(wěn)定性

圖2～圖9為乳化穩(wěn)定性變化分析結(jié)果。背散射光數(shù)據(jù)是從底部到液面頂部共41 mm掃描結(jié)果。兩條曲線代表起始兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)整個(gè)樣品瓶共41 mm的背散射光數(shù)據(jù)。背散射光強(qiáng)下降,說(shuō)明該位置乳化液油滴濃度下降,背散射光強(qiáng)上升,說(shuō)明該位置乳化液油滴濃度上升,背散射光強(qiáng)不變,說(shuō)明該位置乳化液油滴濃度保持不變。

圖2　未處理蛋白與花生油形成乳化液背散射光分析Fig.2　Back scattered light of untreatedwalnut protein with peanut oil emulsion

圖3　未處理蛋白與大豆油形成乳化液背散射光分析Fig.3　Back scattered light of untreatedwalnut protein with soybean oil emulsion

圖4　未處理蛋白與葵花籽油形成乳化液背散射光分析Fig.4　Back scattered light of untreatedwalnut protein with sunflower oil emulsion

由圖2～圖4可見,未處理蛋白與花生油、葵花籽油形成的乳化液在底部0～5 mm處有油滴濃度下降,在頂部35～41 mm處有油滴濃度上升,在中間油滴濃度保持相對(duì)穩(wěn)定;未處理蛋白與大豆油形成的乳化液有劇烈分層現(xiàn)象,在位置24 mm左右有明顯油滴濃度分界線,在24 mm以下油滴濃度下降劇烈,相比較于0 h時(shí)間點(diǎn)背散射光下降達(dá)到10%,在24 mm以上油滴濃度上升,相比較于0 h背散射光上升達(dá)到6%。

由圖5～圖7可見,烘烤蛋白與三種油形成的乳化液均有分層現(xiàn)象。其中烘烤蛋白與花生油、葵花籽油形成的乳化液,在20 mm附近有明顯油滴濃度分界線,在20 mm以下,相比較于0 h時(shí)間點(diǎn)背散射光下降均超過(guò)30%;與大豆油形成乳化液在17 mm有油滴濃度分界線,但是背散射光下降最大值也達(dá)到30%。

圖5　烘烤蛋白與花生油形成乳化液背散射光分析Fig.5　Back scattered light of heated walnut protein with peanut oil emulsion

圖6　烘烤蛋白與大豆油形成乳化液背散射光分析Fig.6　Back scattered light of heated walnut protein with soybean oil emulsion

圖7　烘烤蛋白與葵花籽油形成乳化液背散射光分析Fig.7　Back scattered light of heated walnut protein with sunflower oil emulsion

由圖8和圖9可見,未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液均比烘烤處理蛋白與三種植物油形成的乳化液穩(wěn)定,所有乳化液均隨著時(shí)間變化穩(wěn)定性逐漸降低。

圖8　未處理蛋白與三種油形成乳化液穩(wěn)定性分析Fig.8　The curves of emulsion stability of untreated walnut protein different oil

圖9　烘烤蛋白與三種油形成乳化液穩(wěn)定性分析Fig.9　The curves of emulsion stability of heated walnut protein different oil

未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液中,與大豆油形成的乳化液在前30 min穩(wěn)定性指數(shù)呈直線上升趨勢(shì),最終穩(wěn)定性指數(shù)達(dá)到7.5,相比其他兩種乳化液,與大豆油形成的乳化液最不穩(wěn)定。烘烤蛋白與三種植物油形成的乳化液穩(wěn)定性有很大下降,三種乳化液穩(wěn)定性指數(shù)在40 min前迅速上升,在2 h時(shí)均超過(guò)13。背散射光強(qiáng)與穩(wěn)定性指數(shù)呈正比例變化,背散射光強(qiáng)變化越大,穩(wěn)定性指數(shù)越大,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液測(cè)量終點(diǎn)穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液測(cè)量終點(diǎn)穩(wěn)定性指數(shù)為14.55。

不同植物油對(duì)乳化液的穩(wěn)定性有顯著影響,有研究表明,植物油的種類對(duì)乳化液穩(wěn)定性有顯著影響[16]?？赡苁桥c不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),不飽和脂肪酸不飽和程度越高,蛋白質(zhì)氨基酸的疏水部分能夠更好的與油滴表面結(jié)合形成穩(wěn)定的界面膜[17]。實(shí)驗(yàn)選用的植物油脂肪酸組成如表3所示。未處理蛋白與葵花籽油、大豆油形成的乳化液相對(duì)穩(wěn)定,大豆油乳化液最不穩(wěn)定。烘烤處理蛋白與三種植物油形成的乳化液相比于未處理蛋白與三種植物油形成的乳化液不穩(wěn)定程度增加,并且有明顯的油滴濃度分界線?？赡茉蚴呛婵竞笪⒔Y(jié)構(gòu)成片狀,亞基聚合,溶解性和乳化性下降,所以引起乳化液穩(wěn)定性下降。

表3　植物油脂肪酸組成(%)

3　結(jié)論

烘烤對(duì)核桃蛋白的微結(jié)構(gòu)有較大影響,烘烤核桃蛋白微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)片狀,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)大量增加,界面張力也有所下降,烘烤對(duì)核桃蛋白表面疏水性影響變化不明顯。不同植物油對(duì)乳化液穩(wěn)定性有顯著影響,未處理蛋白與葵花籽油、花生油形成的乳化液相對(duì)穩(wěn)定。烘烤處理蛋白與三種植物油穩(wěn)定性均很差,沒(méi)有明顯差別。其中烘烤處理的蛋白與花生油形成乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為15.98,與大豆油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.53,與葵花籽油形成的乳化液穩(wěn)定性指數(shù)為14.55。

[1]杜蕾蕾. 冷榨核桃制備核桃油和核桃蛋白的研究[D]. 武漢:武漢工業(yè)學(xué)院,2009.

[2]Jamdar S N,Rajalakshmi V,Pednekar M D,et al. Influence of degree of hydrolysis on functional properties,antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J]. Food Chemistry,2010,121(1):178-184.

[3]郭鳳仙,熊幼翎,何志勇,等. 熱處理對(duì)大豆分離蛋白功能特性的影響[J]. 食品與機(jī)械,2009(6):9-11.

[4]毛曉英. 核桃蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征及其制品的改性研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2012.

[5]Molina E,Papadopoulou A,Ledward D A. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J]. Food Hydrocolloids,2001,15(3):263-269.

[7]杜蕾蕾,郭濤,萬(wàn)輝,等. 核桃蛋白的分離純化及功能性質(zhì)的研究[J]. 中國(guó)油脂,2009(5):21-24.

[8]徐月華,蔣將,孟宗,等. 烘烤條件對(duì)核桃油品質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)油脂,2014,39(7):9-12.

[9]張海華,朱科學(xué),周惠明. 超聲波對(duì)小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(22):4687-4693.

[10]Sreerama N,Woody R W. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra:comparison of CONTIN,SELCON,and CDSSTR methods with an expanded reference set[J]. Analytical Biochemistry,2000,287(2):252-260.

[11]Azioune A,Chehimi M M,Miksa B,et al. Hydrophobic protein-polypyrrole interactions:The role of van der Waals and Lewis acid-base forces as determined by contact angle measurements[J]. Langmuir,2002,18(4):1150-1156.

[12]Kato A,Nakai S. Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure,1980,624(1):13-20.

[13]張強(qiáng),陳穎,付文靜,等. TURBISCAN LAB 穩(wěn)定性分析儀研究農(nóng)藥 WDG 懸浮液穩(wěn)定性[J]. 光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(4):843-846.

[14]王金梅. 大豆蛋白熱聚集行為及界面,乳化性質(zhì)研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2012.

[15]Graham D E,Phillips M C. The conformation of proteins at the air-water interface and their role in stabilizing foams[J]. Foams,1976,12(32):237-255.

[17]朱波,蔣將,李進(jìn)偉,等. 三種不同脂肪酸組成的油脂乳化液的理化性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(14):103-107.

Influence of roast processing on secondary structure,surface hydrophobicity and emulsifying properties of walnut protein

ZHAO Run-ze,JIANG Jiang,LI Jin-wei,LIU Yuan-fa*

(School of Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The properties of roasted walnut proteins were investigated in this study. The micro-structure observed by SEM were turned from vesicular to flaky. The amount ofα-helix conformation of roasted protein was reduced from 42.7% to 27.6%,the amount ofβ-turn was increased from 17.3% to 25.3%,the amount of random coil was increased from 24.7% to 32.7%,the amount ofβ-pleated sheet was not changed. The interfacial tension was declined from 20.98 to 18.49,the surface hydrophobicity was declined from 316.14 to 297.55.Three kinds of vegetable oil and toasted protein were emulsified. The stability index of peanut oil was 15.98,the soybean oil was 14.53,the sunflower seed oil was 14.55.

walnut protein;roasted;secondary structure;surface hydrophobicity;emulsifying properties

2016-01-22

趙潤(rùn)澤(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：油脂與植物蛋白，E-mail:peter1989046@sina.com。

劉元法(1974-)，男，博士，教授，研究方向：油脂營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail:yfliu@jiangnan.edu.cn。

高油高蛋白油料水酶法制油(2013AA102103-1)；糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201313011-7-3)。

TS225.1

A

1002-0306(2016)16-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.023