合浦珠母貝糖胺聚糖的分離純化及理化性質(zhì)分析

周小雙,王錦旭,楊賢慶,*,林婉玲,魏　涯

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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合浦珠母貝糖胺聚糖的分離純化及理化性質(zhì)分析

周小雙1,2,王錦旭1,楊賢慶1,*,林婉玲1,魏涯1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

研究合浦珠母貝糖胺聚糖粗品經(jīng)分離純化得到的精制品的理化性質(zhì),通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定樣品分離情況,并對(duì)樣品進(jìn)行紅外分析。經(jīng)枯草桿菌蛋白酶與胰蛋白酶雙酶酶解提取糖胺聚糖粗制品后,將粗制品利用DEAE-52離子交換柱進(jìn)行純化,純化時(shí)分別用0.5 mol/L NaAc(pH=6.0)和1.5 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫,得到精制品GAG1和GAG2。利用苯酚-硫酸法、Bradford法、明膠-氯化鋇法、Orcinol法、Wagner法、紅外光譜法分析GAG1和GAG2的理化性質(zhì)。通過(guò)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以初步猜測(cè)GAG1為肝素鈉,GAG2為硫酸軟骨素。

合浦珠母貝,糖胺聚糖,純化,理化性質(zhì)

合浦珠母貝(Pinctadamartensii)是鶯蛤目鶯蛤科真珠蛤?qū)俚囊环N,亦稱“馬氏珠母貝”。自我國(guó)成功開展其人工育苗,海水珍珠養(yǎng)殖業(yè)開始迅猛發(fā)展[1]。目前合浦珠母貝是我國(guó)海水養(yǎng)殖貝的主要種類[2]。近幾年合浦珠母貝的研究主要集中于遺傳育種、珍珠層結(jié)構(gòu)、插核育珠等[3],而針對(duì)軟體部貝肉的研究不多。合浦珠母貝貝肉的每年產(chǎn)量很大,而且貝肉中含有多種活性成分如糖胺聚糖,如果對(duì)其加以研究利用,相信一定會(huì)有很好的應(yīng)用前景。

糖胺聚糖(glycosaminoglycan),又稱氨基多糖、酸性粘多糖,是酸性多糖的一種,主要存在高等動(dòng)物組織中。糖胺聚糖是由重復(fù)的二糖單位氨基己糖和己糖醛酸構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖。目前已經(jīng)確定的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)是硫酸軟骨素C(CSC)、硫酸軟骨素A(CSA)、透明質(zhì)酸(HA)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸角質(zhì)素(KS)、肝素(HP)及硫酸乙酰肝素(HS)[4]。不同動(dòng)物中糖胺聚糖存在差異,雖然已有學(xué)者對(duì)翡翠貽貝[5]、近江牡蠣[6]、波紋巴非蛤[7]、四角蛤蜊[8]等多種貝類糖胺聚糖進(jìn)行了研究,但合浦珠母貝還沒有較全面的研究。

本實(shí)驗(yàn)主要研究合浦珠母貝糖胺聚糖粗制品的分離純化及分析精制品的理化性質(zhì),觀察其結(jié)構(gòu)特征,旨在進(jìn)一步研究其生物活性并將其應(yīng)用于保健品,高值化利用合浦珠母貝貝肉,促進(jìn)珍珠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糖胺聚糖粗制品前期從合浦珠母貝的全臟器中通過(guò)酶解法提取,經(jīng)1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法檢測(cè)后保存?zhèn)溆?1,9-二甲基亞甲基藍(lán)購(gòu)自Sigma;甘氨酸、NaCl、NaAc、氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醇均為分析純,購(gòu)自齊云生物科技。

Milli-Q超純水機(jī)、小型切向流超濾系統(tǒng)美國(guó)MILLIPORE;J26XP高速離心機(jī)美國(guó)貝克曼庫(kù)特;紫外可見分光光度計(jì)日本SHIMADZU;Alpha1-4冷凍干燥機(jī)德國(guó)Christ;GM-0.33B隔膜真空泵;TLJ-2型定時(shí)增力電動(dòng)攪拌器姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司;CBS-B程控多功能全自動(dòng)部份收集器和BT-100SD定時(shí)電腦泵上海青浦滬西儀器廠;Powetpac@Basic基礎(chǔ)電泳儀美國(guó)Bio-rad;IRAffinity-1型紅外光譜儀島津SHINADZU。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1糖胺聚糖粗制品分離純化

1.2.1.1DEAE-52填料的處理將DEAE-52填料在0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min,用蒸餾水洗滌至中性;用0.5 mol/L 的HCl浸泡填料30 min,用蒸餾水洗滌至pH7.0;最后再用0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min,用蒸餾水洗滌至pH7.0。向填料中加10倍體積的緩沖液(0.5 mol/L NaAc,pH6.0)浸泡過(guò)夜,傾倒出上層懸浮顆粒。緩慢攪拌均勻,通過(guò)玻璃棒引流將填料緩慢注入50 cm×4 cm的離子交換柱中,在灌注過(guò)程中可以將柱子與恒流泵連接使用0.5 mol/L NaAc(pH6.0)進(jìn)行緩慢壓柱,然后不斷補(bǔ)充填料重復(fù)壓柱直到上方留有10 cm左右的空隙,最后用0.5 mol/L NaAc(pH6.0)洗滌柱子2個(gè)柱床體積,使柱子平衡[6]。

1.2.1.2分離柱:DEAE-52-纖維素離子交換柱(4 cm×50 cm)。流速:10 mL/h,180滴/管,每管5 mL。進(jìn)樣量:50.0 mL,進(jìn)樣濃度:30 mg/mL。檢測(cè)方法:1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法[9-10],洗脫液:pH6.0的0.5 mol/L NaAc緩沖液和0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L氯化鈉溶液各600 mL進(jìn)行階段洗脫。通過(guò)繪制洗脫曲線,根據(jù)曲線峰型將構(gòu)成同一峰的各管收集在一起,由此確定最佳洗脫液組合。將溶液收集后透析除鹽、超濾濃縮(截留分子量5 ku)、真空冷凍干燥。

1.2.2各成分測(cè)定總糖含量測(cè)定:苯酚-硫酸法(標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)水葡萄糖)[11];蛋白質(zhì)含量測(cè)定:Bradford法(標(biāo)準(zhǔn)品為5 mg/mL蛋白溶液);糖醛酸含量的測(cè)定:Orcinol法(標(biāo)準(zhǔn)品為D-葡萄糖醛酸)[4];硫酸基含量的測(cè)定:明膠-氯化鋇法(標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)水硫酸鉀)[12];氨基己糖含量測(cè)定:Wagner法(標(biāo)準(zhǔn)品為氨基葡萄糖鹽酸鹽)[13]。

1.2.3瓊脂糖凝膠電泳以0.5%瓊脂糖溶液制成8.8 cm×6.5 cm膠板,緩沖系統(tǒng)為巴比妥鈉緩沖液(0.05 mol·L-1,pH8.5),恒壓80 V電泳,至指示劑(甲酚紅)距原點(diǎn)3.5 cm(約40 min)關(guān)閉電泳儀,取下膠板在固定液(0.1%十六烷基三甲基溴化銨)中固定60 min,將固定液回收,膠板于70 ℃烘干,0.1%甲苯胺藍(lán)溶液(用醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5∶5,V/V 配制)染色2 h,用適量脫色液(醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5∶5,V/V)進(jìn)行脫色4 h后,再用去離子水洗至背景無(wú)色,通過(guò)觀察電泳圖中的譜帶分布情況,以此確定樣品分離純化的效果。

1.2.4紅外光譜分析采用溴化鉀壓片法,取一定量的干燥溴化鉀粉末進(jìn)行研磨,取適量研磨后的粉末研制成透明薄片作為背景樣品,在剩余的溴化鉀粉末中加入約0.5 mg樣品進(jìn)行研磨混合均勻后,同樣研制成透明薄片,在IRAffinity-1型紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定。紅外光譜儀測(cè)定參數(shù):背景掃描次數(shù)32次;掃描范圍400～4000 cm-1;分辨率4.0 cm-1;檢測(cè)器:帶溫度控制系統(tǒng)的DLATGS檢測(cè)器。

2　結(jié)果與分析

2.1分離純化

利用1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)定雙號(hào)管中溶液的吸光度值,通過(guò)測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有0.5 mol/L NaAc(pH6.0)及1.5 mol/L NaCl兩種洗脫液洗下的溶液中含有糖胺聚糖。在后面的純化實(shí)驗(yàn)中只需使用這兩種洗脫液,洗脫曲線見圖1。根據(jù)曲線峰型收集樣品的各部位(峰1為GAG1,峰2為GAG2),將收集的洗脫液分別透析脫鹽、超濾濃縮、冷凍干燥。

圖1　DEAE-52梯度洗脫曲線Fig.1　DEAE-52 gradient elution curve

2.2各成分分析

2.2.1各指標(biāo)分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線利用苯酚-硫酸法、Bradford法、Orcinol法、明膠-氯化鋇法、Wagner法分別測(cè)定樣品GAG1、GAG2中總糖、蛋白質(zhì)、己糖醛酸、硫酸基、氨基己糖的含量,得線性回歸方程見表1。

表1　各分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2各組分成分測(cè)定結(jié)果分離純化所得到的組分GAG1、GAG2的成分分析見表2,從結(jié)果可以看出GAG1、GAG2是聚陰離子多糖,其中的陰離子主要是己糖醛酸和硫酸基,GAG2中硫酸基含量高于GAG1,顯示GAG2具有較強(qiáng)的生物活性,對(duì)于樣品中可能存在的其他組分還有待進(jìn)一步研究。對(duì)于樣品成分分析為研究結(jié)構(gòu)、活性和綜合利用提供了必要信息。

表2　各組分成分分析結(jié)果(%)

2.3瓊脂糖電泳

不連續(xù)的瓊脂糖凝膠電泳在糖胺聚糖分離純化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,可用于區(qū)分可能發(fā)生的部分降解而造成的結(jié)構(gòu)變化。本實(shí)驗(yàn)采用堿性瓊脂糖凝膠電泳,酸性多糖可以泳動(dòng)并特異性染色。合浦珠母貝糖胺聚糖為聚陰離子多糖,糖鏈上陰離子基團(tuán)的類別、多少和連接位置的差別,都可能使它們?cè)陔娪局械倪w移率不同,從而通過(guò)譜帶表現(xiàn)出來(lái)。圖2為樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖,其中譜帶依次為GAG2、GAG1、糖胺聚糖粗品,糖胺聚糖粗品的電泳圖為兩個(gè)譜帶,GAG2與糖胺聚糖粗品快帶的電泳特性相同,GAG1與其慢帶的電泳特性相同,說(shuō)明通過(guò)DEAE-52離子交換柱將粗品有效分離,其中GAG2染色較深,說(shuō)明其酸性較大。

圖2　瓊脂糖凝膠電泳Fig.2　Agarose gel electrophoresis

2.4紅外光譜分析結(jié)果

GAG1在3419.80 cm-1處具有強(qiáng)寬吸收峰,說(shuō)明含有-OH的O-H鍵和-N-H2的N-H鍵伸縮振動(dòng)。2933.73 cm-1左右處具有弱的吸收峰,為有-CH或CH3的C-H鍵伸縮振動(dòng),說(shuō)明含有糖類飽和C-H鍵;1651.07、1558.48 cm-1左右處具有強(qiáng)吸收峰,說(shuō)明有-NHCOCH3-存在;1411.89 cm-1處具有強(qiáng)吸收峰,為羧基C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng);1242.16 cm-1處有強(qiáng)吸收峰為S=O伸縮振動(dòng);1045.42 cm-1處強(qiáng)吸收峰為C-O伸縮振動(dòng);從圖譜的紅外吸收波數(shù)分析可知,以上描述均符合肝素鈉的光譜特征[14],可以初步猜測(cè)GAG1為肝素鈉。

圖3　GAG1的紅外光譜圖 Fig.3　IR spectrum of GAG1

GAG2在3410.15 cm-1處具有強(qiáng)寬吸收峰,說(shuō)明含有-OH的O-H鍵和-N-H2的N-H鍵伸縮振動(dòng)。2937.59 cm-1左右處具有弱的吸收峰,為有-CH或CH3的C-H鍵伸縮振動(dòng),說(shuō)明含有糖類飽和C-H鍵;1658.78、1552.70 cm-1左右處具有強(qiáng)吸收峰,說(shuō)明有-NHCOCH3-存在;1500～1250 cm-1之間有三個(gè)弱吸收峰;1242.16 cm-1處有強(qiáng)吸收峰為S=O伸縮振動(dòng);1049.28 cm-1處強(qiáng)吸收峰為C-O伸縮振動(dòng);從圖譜的紅外吸收波數(shù)分析可知,以上描述均符合硫酸軟骨素的光譜特征[15],可以初步猜測(cè)GAG2為硫酸軟骨素。

圖4　GAG2的紅外光譜圖Fig.4　IR spectrum of GAG2

3　結(jié)論

糖胺聚糖粗品經(jīng)DEAE-52柱分離純化后得到兩個(gè)組分(GAG1、GAG2),GAG1、GAG2中都含有氨基己糖、己糖醛酸、硫酸基,其中GAG2的己糖醛酸、硫酸基的含量大于GAG1。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)純化后得到的兩個(gè)組分為均一成分,而且GAG2的酸性要大于GAG1。從紅外分析結(jié)果來(lái)看,GAG1、GAG2中含有-OH的O-H鍵、-N-H2的N-H鍵伸縮振動(dòng)、-NHCOCH3-、S=O 伸縮振動(dòng)等特征基團(tuán),這些都符合糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)特征,其中GAG2在1500～1250 cm-1之間有三個(gè)弱吸收峰。綜合以上數(shù)據(jù),可以初步猜測(cè)GAG1為肝素鈉、GAG2為硫酸軟骨素。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)可以對(duì)兩組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證研究,為后續(xù)的活性研究奠定基礎(chǔ)。

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Purification and physicochemical characteristics of glycosaminoglycan fromPinctadamartensii

ZHOU Xiao-shuang1,2,WANG Jin-xu1,YANG Xian-qing1,*,LIN Wan-ling1,WEI Ya1

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

This paper studied on purification and physicochemical characteristics of glycosaminoglycan fromPinctadamartensii. The separation of the samples was identified by agarose gel electrophoresis and analyzed by infrared spectroscopy. After glycosaminoglycan was achieved from the whole viscera ofPinctadamartensiivia enzymatic hydrolysis by pancreatin and neutral protease ofBacillussubtilis,the crude glycosaminoglycan was purified by DEAE-52 ion exchange column with 0.5 mol/L NaAc(pH=6.0)and 1.5 mol/L NaCl,then the purified product of glycosaminoglycan(GAG1and GAG2)were obtained. The physicochemical properties of the purified product were analyzed by the method of phenol-sulfuric acid,Bradford,Orcinol,Wagner,Infrared spectroscopy. The results showed that GAG1was heparin sodium and GAG2was chondroitin sulfate.

Pinctadamartensii;glycosaminoglycan;purification;physicochemical characteristics

2016-01-18

周小雙(1991-),女,碩士研究生,研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全,E-mail:zxiao_shuang@163.com。

楊賢慶(1963-),男,研究員,研究方向:水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全,E-mail:yxqgd@163.com。

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016A030313144);廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)(2014A020217009);廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)科技攻關(guān)與研發(fā)項(xiàng)目(A201501C08);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014TS25);農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(NYBJG201408)資助。

TS254.1

A

1002-0306(2016)16-0127-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.17