成熟前后水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組的初步研究

陳凌聲，代小麗，徐永茹，羅　嬋，陸鳳花，蔣建榮，石德順，徐　平，李湘萍*

(1．廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005； 2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京)，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

?

成熟前后水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組的初步研究

陳凌聲1，2，代小麗1，徐永茹1，2，羅嬋1，陸鳳花1，蔣建榮1，石德順1，徐平2，李湘萍1*

(1．廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005； 2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京)，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳聯(lián)合反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(RP-LC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組，以期為揭示水牛卵母細(xì)胞體外成熟分子機(jī)理、篩選與卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量相關(guān)蛋白質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。從GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞中分別鑒定到647和570種蛋白質(zhì)(FDR<1%)。其中，鑒定相同蛋白質(zhì)414種；GV期和MII期卵母細(xì)胞特有鑒定蛋白質(zhì)分別為233種和156種。通過譜圖計(jì)數(shù)法獲得鑒定蛋白質(zhì)的半定量信息，從GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞中篩選到9種高豐度蛋白質(zhì)。其中8種為相同蛋白質(zhì)，包括穹窿體蛋白、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶M3、蛋白精氨酸脫亞氨酶6、過氧化物氧化還原酶2、二磷核苷酸激酶B、動力蛋白輕鏈1、醛糖還原酶、類甘油醛-3-三磷酸脫氫酶同源物2等。熱激蛋白90α和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P分別為GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞特有的高豐度蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能與水牛卵母細(xì)胞成熟過程密切相關(guān)。GO(Gene Ontology)和KEGG分析顯示，鑒定相同蛋白質(zhì)主要集中在丙酮酸鹽代謝、三羧酸循環(huán)(TCA)、糖酵解/糖原生成、磷酸戊糖途徑等能量代謝通路，提示水牛卵母細(xì)胞成熟過程中可能需要維持高的能量代謝水平，以保證卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的完成。GV期細(xì)胞特有鑒定蛋白質(zhì)主要集中在氧化磷酸化、核糖體以及蛋白酶體等KEGG通路，表明GV期卵母細(xì)胞可能具有高的氧化磷酸化和蛋白合成水平，蛋白酶體在推動水牛卵母細(xì)胞成熟進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。MII期細(xì)胞特有鑒定蛋白質(zhì)主要集中在DNA復(fù)制和氨基糖、核苷糖代謝等KEGG通路，提示水牛卵母細(xì)胞可能在為后續(xù)的受精過程和早期卵裂進(jìn)行遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)備。綜上表明，成熟前后水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)模式，為進(jìn)一步深入了解水牛卵母細(xì)胞成熟分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

水牛；體外成熟；卵母細(xì)胞；蛋白質(zhì)組

哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)可為體外受精、胚胎生產(chǎn)和動物克隆等胚胎工程技術(shù)提供大量可用的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量直接影響卵母細(xì)胞受精率，早期胚胎的存活，妊娠的維持，甚至胎兒的發(fā)育[1]。然而，目前體外成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能、成熟率和囊胚發(fā)育率均遠(yuǎn)低于體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞[2]，這與體外成熟條件下，卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟不同步、胞質(zhì)成熟不充分和不完善的體外成熟體系密切相關(guān)[1]。從基因表達(dá)和蛋白質(zhì)調(diào)控水平研究卵母細(xì)胞的成熟機(jī)理，將有助于優(yōu)化卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，提高體外成熟效率和胚胎生產(chǎn)效率。

近年來，功能基因組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于包括小鼠[3-4]、豬[5]、牛[6-7]等物種的基因功能研究，使得人們對哺乳動物卵母細(xì)胞成熟、早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)理有了更多的認(rèn)識，鑒定了一系列可作為反映卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的標(biāo)志性因子。然而研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的mRNA豐度與蛋白質(zhì)表達(dá)水平相關(guān)性較低。卵母細(xì)胞內(nèi)大量母源性mRNA未被聚腺苷酸化而不翻譯為蛋白質(zhì)[8]。此外，一些蛋白質(zhì)存在多種不同亞型，并通過復(fù)雜的翻譯后修飾調(diào)控執(zhí)行各種功能[9]。蛋白質(zhì)組學(xué)是以細(xì)胞、組織中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)為研究對象，系統(tǒng)揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能，蛋白質(zhì)表達(dá)動態(tài)變化。因此，開展哺乳動物卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究對于認(rèn)識卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制具有十分重要的意義。目前，哺乳動物卵母細(xì)胞/胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已陸續(xù)在小鼠[10-11]、豬[12]和牛[13]等物種展開。研究內(nèi)容包括成熟前后卵母細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)組比較，卵母細(xì)胞母源性蛋白質(zhì)組的鑒定，以及不同發(fā)育時(shí)期胚胎蛋白質(zhì)表達(dá)模式等。劉振方[14]采用雙向電泳(2DE)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定了成熟前、后水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組，僅鑒定到8個蛋白質(zhì)，這與2DE技術(shù)存在分辨率差，操作繁瑣等諸多不足有關(guān)。陳富美等[15]應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)，從水牛卵母細(xì)胞中成功鑒定到574種蛋白質(zhì)。但該報(bào)道的研究對象為GV期和MII期混合細(xì)胞，所構(gòu)建的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜為兩個時(shí)期卵母細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的整合，對于兩個時(shí)期細(xì)胞獨(dú)立的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，以及這些蛋白在細(xì)胞生長特定時(shí)期中所執(zhí)行的功能并不清楚。

無標(biāo)記定量對不同狀態(tài)的樣本單獨(dú)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。由于其操作簡便，耗費(fèi)成本低，不受樣品數(shù)量、條件的限制，同時(shí)克服了標(biāo)記定量技術(shù)在對多個樣本進(jìn)行相對定量比較的不足，日益受到研究者的廣泛關(guān)注和應(yīng)用。目前，無標(biāo)記定量方法根據(jù)其定量原理的不同可分為兩種：第一種是基于離子流色譜峰(Extracted ion current，XIC)的定量方法。根據(jù)肽段母離子的質(zhì)荷比提取不同保留時(shí)間下的相應(yīng)同位素峰簇的信號強(qiáng)度，構(gòu)建XIC，并根據(jù)XIC計(jì)算出肽段的豐度表征。第二種是基于譜圖計(jì)數(shù)法(Spectral counting，SC)。根據(jù)蛋白質(zhì)的豐度與其對應(yīng)的肽段被質(zhì)譜檢測到的頻率成正比的原理，將一個蛋白質(zhì)對應(yīng)的鑒定譜圖數(shù)(Peptide spectrum match，PSM)定義為蛋白質(zhì)的相對豐度[16]。

本研究應(yīng)用一維聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了體外成熟的水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。通過譜圖計(jì)數(shù)法獲得鑒定蛋白的半定量信息，篩選獲得成熟前后水牛卵母細(xì)胞中高豐度表達(dá)蛋白，同時(shí)借助生物信息學(xué)工具對鑒定到的蛋白進(jìn)行功能注釋和KEGG信號通路分析，為促進(jìn)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的分子機(jī)制研究奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1水牛卵母細(xì)胞采集

水牛卵巢取自廣西南寧市屠宰場。共收集到315個卵巢，卵巢用75%酒精消毒，25 ℃生理鹽水清洗干凈。用注射器抽取卵巢表面直徑為2～6 mm卵泡中的卵母細(xì)胞。

成熟前卵母細(xì)胞(GV期)的采集：從卵泡抽吸出的液體中，挑取出卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，具有3層或3層以上卵丘顆粒細(xì)胞包被的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體。洗卵液(TCM-199，5 mmol·L-1NaHCO3，15 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1HEPES，2% 新生犢牛血清)漂洗數(shù)次后，用移液槍反復(fù)吹打去除包被的卵丘細(xì)胞。卵母細(xì)胞置于預(yù)冷的PBS清洗數(shù)次，-80 ℃保存?zhèn)溆?。共收集到GV期細(xì)胞522個。

成熟后卵母細(xì)胞(MII期)的收集：挑取卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，具有3層及3層以上卵丘顆粒細(xì)胞包被的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，洗卵液漂洗數(shù)次后，轉(zhuǎn)移至含有成熟培養(yǎng)液(TCM-199，26.2 mmol·L-1NaHCO3，5 mmol·L-1HEPES，60 mg·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，0.1 mg·L-1促卵泡素，5% 發(fā)情牛血清)的玻璃平皿，在38.5 ℃，5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22～24 h。挑取細(xì)胞質(zhì)均勻，具有3層以上完整卵丘顆粒細(xì)胞層包被，排出第一極體的卵母細(xì)胞[17]。去除包被卵丘顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞置于預(yù)冷的PBS清洗數(shù)次，-80 ℃保存?zhèn)溆?。共收集到MII期細(xì)胞545個。

1.2卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取及電泳分離

卵母細(xì)胞樣品中加入裂解液(8 mmol·L-1尿素，50 mmol·L-1碳酸氫銨(NH4HCO3))后，使用渦旋振蕩儀器渦旋1 min，然后冰上靜置30 s，反復(fù)此操作15次。4 ℃，13 300 r·min-1離心3 min，收集上清。樣品濃度通過BCA方法定量并進(jìn)行10% SDS-PAGE分離。

1.3酶解樣品

電泳結(jié)束后，切取目的條帶并制成小膠粒，脫色液(50 mmol·L-1NH4HCO，乙腈(ACN)，按1∶1比例配制)脫至無色，加入乙腈脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。按照胰酶∶蛋白質(zhì)比為1∶50的比例加入濃度為13 ng·μL-1胰蛋白酶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育14～16 h。蛋白酶解結(jié)束后，加入蛋白抽提液(5% 甲酸(FA)，50% ACN)抽提，肽段溶液樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4質(zhì)譜檢測

采用LTQ-Oribitrap Velos進(jìn)行質(zhì)譜檢測。流動相A(0.1% ACN)溶解多肽樣品，自動上樣，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測參數(shù)：一級質(zhì)譜掃描為300～1 600 m·z-1，噴霧電壓2 kV，二級質(zhì)譜掃描模式為碰撞誘導(dǎo)解離模式，35%歸一化碰撞能量。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)搜索軟件為SorcererTM-SEQUEST?(Version 4.0.4 build，Sage-N Reasearch，Inc.)，數(shù)據(jù)庫為NCBIBostaurus蛋白數(shù)據(jù)庫(20 131 213、24、210個編碼基因)。

1.5生物信息學(xué)分析

利用DAVID (https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)分析工具對鑒定蛋白進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能注釋和KEGG pathway分析。

2　結(jié)　果

2.1成熟前后水牛卵母細(xì)胞蛋白SDS-PAGE分離

按照1.2方法分別提取GV期和MII期卵母細(xì)胞總蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，分別取10 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離。結(jié)果顯示，分子量為20～220 ku，蛋白樣品得到有效分離，蛋白條帶清晰，兩組樣品蛋白帶型基本一致(圖1)。

圖1　GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞總蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE profile of total protein from GV and MII stage buffalo oocyte

2.2LC-MS/MS鑒定

蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，采用膠內(nèi)消化方法獲得肽段樣品后進(jìn)行LC-MS/MS鑒定?？傠x子流(Total ion chromatography，TIC)圖顯示成熟前后樣品質(zhì)譜檢測的信號強(qiáng)度均達(dá)到E8級別(圖2)。數(shù)據(jù)庫搜庫結(jié)果如表1所示，從GV期水牛卵母細(xì)胞共鑒定到7 494張二級譜圖，鑒定蛋白647種，雙肽段匹配蛋白313種，占總鑒定蛋白的48%。成熟后水牛卵母細(xì)胞共鑒定到6 710張二級譜圖，鑒定蛋白570種，雙肽段匹配蛋白278種，占總鑒定蛋白的48.6%。成熟前后水牛卵母細(xì)胞相同鑒定蛋白414種，占兩種細(xì)胞鑒定蛋白總數(shù)的51.6%。成熟前卵母細(xì)胞特有鑒定蛋白233種，成熟后卵母細(xì)胞特有鑒定蛋白156種(圖3)。

圖2　GV期和MII 期水牛卵母細(xì)胞的LC-MS/MS總離子流圖Fig.2　Total ion chromatography of GV and MII stage buffalo oocyte by LC-MS/MS

表1GV期、MII期水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)LC-MS/MS鑒定

Table 1Overview of proteins identified from GV and MII stage buffalo oocytes by LC-MS/MS

樣品Sample鑒定譜圖數(shù)No.ofspectralidentified肽段Peptides蛋白Proteins兩鑒定肽段以上的蛋白數(shù)Proteinwith≥2peptidesidentifiedGVstageoocytes74942147647572MIIstageoocytes67101969570278

2.3鑒定蛋白的GO分析

根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫第3級的注釋結(jié)果，414種相同鑒定蛋白，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激、蛋白定位、骨架蛋白組裝、受精等生物學(xué)進(jìn)程顯著富集。GV期水牛卵母細(xì)胞233種特有鑒定蛋白，顯著富集的生物學(xué)進(jìn)程包括前體代謝物及能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白定位建立等。MII期水牛卵母細(xì)胞131種特有鑒定蛋白，在蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)進(jìn)程顯著富集(圖4)。

2.4KEGG pathway分析

如圖5A所示，相同鑒定蛋白在丙酮酸鹽代謝、糖酵解/糖原生成、TCA循環(huán)、和磷酸戊糖途徑等21條KEGG 信號通路顯著富集。表明能量代謝在水牛卵母細(xì)胞成熟過程中可能起著重要的作用。GV期水牛卵母細(xì)胞特有鑒定蛋白在氧化磷酸化、核糖體及蛋白酶體等KEGG 信號通路顯著富集。表明水牛GV期卵母細(xì)胞中具有高的ATP產(chǎn)生速率，ATP含量的提高可能為卵母細(xì)胞的生長、蛋白合成等提供能量來源。此外，水牛卵母細(xì)胞在生長階段可能需要高的蛋白質(zhì)合成水平，為隨后的減數(shù)分裂成熟過程做準(zhǔn)備。MII期水牛卵母細(xì)胞特有鑒定蛋白在DNA復(fù)制和氨基糖、核苷糖代謝信號通路顯著富集(圖5B)。表明卵母細(xì)胞可能在為隨后的受精過程和早期胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。

圖3　GV期、MII期水牛卵母細(xì)胞蛋白鑒定維恩圖Fig.3　Venny diagrams represent the identified proteins from GV and MII stage buffalo oocytes

A.相同蛋白生物學(xué)進(jìn)程注釋；B.特有蛋白生物學(xué)進(jìn)程注釋A．Biological process categories of common protein；B.Biological process categories of unique protein圖4　GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞相同、特有蛋白的生物學(xué)進(jìn)程分類Fig.4　Biological process categories of common and unique proteins from GV and MII stage buffalo oocyte identified by LC-MS/MS

2.5成熟前后水牛卵母細(xì)胞高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)

通過譜圖計(jì)數(shù)法(Spectral counting，SC)計(jì)算鑒定蛋白質(zhì)的相對豐度。由于內(nèi)參蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)較為恒定且其表達(dá)豐度相對較高，本研究以β-actin作為高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)的參照蛋白。從成熟前、后的水牛卵母細(xì)胞中均分別篩選到9種高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)，其中8種為相同鑒定蛋白質(zhì)，包括穹窿體蛋白(MVP)、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶M3(GSTM3)、蛋白精氨酸脫亞氨酶6(PADI6)、過氧化物氧化還原酶2(PRDX2)、二磷核苷酸激酶B(NME2)、動力蛋白輕鏈1(DYNLL1)、醛糖還原酶(AKR1B1)、類甘油醛-3-三磷酸脫氫酶同源物2。而熱激蛋白90α(HSP90α)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P(GSTP1)分別為成熟前、后卵母細(xì)胞特有的高豐度蛋白質(zhì)(表2)。

A.相同蛋白KEGG 信號通路分析；B.GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞特有蛋白KEGG信號通路分析A．KEGG pathway analysis of common proteins；B.KEGG pathway analysis of unique proteins圖5　KEGG pathway分析Fig.5　KEGG pathway analysis

3　討　論

本研究應(yīng)用一維SDS-PAGE結(jié)合LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)，建立了GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。分別從成熟前、后的水牛卵母細(xì)胞中鑒定到648和572種蛋白質(zhì)。與劉振芳[14]和陳富美[15]等報(bào)道的水牛卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究相比，筆者也鑒定到了一些在其數(shù)據(jù)集中已報(bào)道的蛋白，如MVP，血清白蛋白前體(ALB)，α-2-HS-糖蛋白前體(AHSG)，跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白2前體EMP24(TMED2)，透明帶精子結(jié)合蛋白2(ZP2)，透明帶精子結(jié)合蛋白3(ZP3)，透明帶精子結(jié)合蛋白4(ZP4)，核質(zhì)蛋白(NPM2)，熱休克同族蛋白71(HSC71)，熱激蛋白60(HSP60)和B淋巴細(xì)胞210L(BCL210L)。此外，還鑒定到了一些原來未報(bào)道的蛋白，這些蛋白已被證實(shí)在其他物種卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要的母源性蛋白作用，如Nlrp5/Mater，合子阻滯蛋白(Zar1)，骨形態(tài)生成蛋白(BMP15)和生長分化因子9(GDF9)等。

根據(jù)譜圖計(jì)數(shù)的方法獲得蛋白質(zhì)的半定量信息，以內(nèi)參蛋白為高豐度表達(dá)蛋白的參照蛋白。從成熟前、后的水牛卵母細(xì)胞中分別篩選出9種高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)，其中8種為相同的蛋白，提示這些高豐度表達(dá)的蛋白在卵母細(xì)胞成熟過程中可能起重要作用。PADI6屬于肽?；搧啺泵讣易?，僅在卵母細(xì)胞和早期胚胎中高豐度表達(dá)[18]。PADI6已被證實(shí)是一種重要的母源性效應(yīng)蛋白，對于早期胚胎發(fā)育是必需的[19]。P.Yurttas等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PADI6基因失活導(dǎo)致雌性小鼠不孕，而敲除PADI6基因可導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯在2-細(xì)胞期。此外，PADI6對于含有核糖體和核糖體組件的細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的形成和維持是必需的，而后者在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[21]。此前，S.F.Wang等[22]通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)PADI6蛋白在成熟前、后的小鼠卵母細(xì)胞中均高豐度表達(dá)。DYNLL1是一種分子馬達(dá)，可將ATP高能磷酸鍵的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，主要參與細(xì)胞的有絲分裂、染色體分離、mRNA定位和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。S.E.Racedo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，可發(fā)育到囊胚階段的牛卵母細(xì)胞DYNLL1具有較高的mRNA表達(dá)水平，提示DYNLL1可能與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能有關(guān)。此外，DYNLL還被證實(shí)作為調(diào)控基因參與牛卵泡和早期胚胎的發(fā)生[25]。

表2GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞高豐度表達(dá)蛋白質(zhì)

Table 2List of high-abundance proteins of GV and MII stage buffalo oocytes

蛋白質(zhì)ID蛋白質(zhì)名稱Description理論分子量/kuMWGV期卵母細(xì)胞數(shù)GVoocyteNo.MII期卵母細(xì)胞數(shù)MIIoocyteNo.GV期卵母細(xì)胞豐度GVoocyteabundanceMII期卵母細(xì)胞豐度MIIoocyteabundanceNP_001030394.1Majorvaultprotein(Bostaurus)99318252160.61127.27NP_001040025.1GlutathioneS-transferasemu3(Bostaurus)27444481.4881.48XP_609569.4Predicted:protein-argininedeiminasetype-6(Bostaurus)77999364.2960.39NP_777188.1Peroxiredoxin-2(Bostaurus)22191943.1843.18NP_001069844.1NucleosidediphosphatekinaseB(Bostaurus)17141241.1835.29XP_003582390.1Predicted:dyneinlightchain1,cytoplasmic-like(Bostaurus)108740.0035.00NP_001012537.1Aldosereductase(Bostaurus)36282938.8940.28XP_001252512.1Predicted:glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase-likeisoform2(Bostaurus)36283738.8951.39NP_001012688.1Heatshockprotein,HSP90-alpha(Bostaurus)85625236.4730.59NP_803482.1GlutathioneS-transferaseP(Bostaurus)24161833.3337.50NP_776404.2Actin,cytoplasmic1(Bostaurus)4229`2934.5234.52

HSP90α屬于熱休克蛋白家族，作為一種分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，具有應(yīng)激保護(hù)作用[26]。小鼠中，HSP90α受熱休克因子蛋白1(HSF1)調(diào)控，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中起重要作用[27]。敲除HSF1導(dǎo)致卵母細(xì)胞中HSP90α表達(dá)受到抑制，卵母細(xì)胞生長表現(xiàn)生發(fā)泡破裂(GVBD)延遲，MI(Metaphase I)期部分受阻以及不對稱分裂缺陷[28]。本研究中，HSP90α是GV期水牛卵母細(xì)胞中唯一特有的高豐度蛋白，表明該蛋白在GV期生長過程中可能扮演重要角色。

過氧化物酶(Peroxiredoxin，PRDXs)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)在卵母細(xì)胞中均為中高豐度表達(dá)的抗氧化蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原調(diào)控、抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。PRDX2是過氧化物酶家族的一員，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮保護(hù)蛋白和脂質(zhì)抗氧化損傷和抗凋亡功能，參與細(xì)胞分化與增殖[28]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟前后的牛卵母細(xì)胞和早期胚胎中均可檢測到PRDX2的表達(dá)[30]。小鼠中，PRDX2在GV期和MII期卵母細(xì)胞中均高水平表達(dá)，MII期后表達(dá)水平開始下降。此外，研究表明PRDX2可能通過NFKB和IKB的作用在保護(hù)卵丘細(xì)胞免受活性氧簇(ROS)損傷過程中發(fā)揮重要作用[31]。GSTM3和GSTP1均屬于GSTs家族，具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激的功能，在保護(hù)機(jī)體免受致癌性化學(xué)物質(zhì)的損壞中發(fā)揮重要作用，它們可以解除許多致癌劑的活性代謝物的毒性[28]。林雍峰等[28]報(bào)道顯示，GSTM3在綿羊卵母細(xì)胞中高豐度表達(dá)，并且在成熟過程中表達(dá)量明顯增加。表明GSTM3可能在綿羊卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮抗氧化和解毒作用。本研究中，PRDX2、PRDX2和GSTP1等這些抗氧化蛋白在成熟前后的水牛卵母細(xì)胞中具有較高的表達(dá)豐度，表明在水牛卵母細(xì)胞成熟過程中的抗氧化應(yīng)激作用可能主要由這些蛋白來承擔(dān)。

4　結(jié)　論

本研究應(yīng)用一維SDS-PAGE結(jié)合LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選到在GV期和MII期水牛卵母細(xì)胞中高豐度表達(dá)的蛋白，這些蛋白主要參與抗氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，提示這些蛋白在水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中可能起關(guān)鍵作用。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水牛卵母細(xì)胞從GV～MII期過程中有很多蛋白參與能量代謝的過程，表明維持高的能量代謝水平是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟完成的保證。能量代謝可能在水牛卵母細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。GV期水牛卵母細(xì)胞可能具有高的氧化磷酸化和蛋白合成水平，蛋白酶體在推動水牛卵母細(xì)胞生長進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。MII期水牛卵母細(xì)胞可能具有高的DNA復(fù)制水平，提示卵母細(xì)胞可能在為隨后的受精過程和早期卵裂進(jìn)行遺傳物質(zhì)準(zhǔn)備。

[1]KRISHER R L.The effect of oocyte quality on development[J].JAnimSci，2004，82：E14-E23.

[2]DOMINKO T，F(xiàn)IRST N L.Timing of meiotic progression in bovine oocytes and its effect on early embryo development[J].MolReprodDev，1997，47(4)：456-467.

[3]PAN H，O'BRIEN M J，WIGGLESWORTH K，et al.Transcript profiling during mouse oocyte development and the effect of gonadotropin priming and developmentinvitro[J].DevBiol，2005，286(2)：493-506.

[4]HAMATANI T，CARTER M G，SHAROV A A，et al.Dynamics of global gene expression changes during mouse preimplantation development[J].DevCell，2004，6(1)：117-131.

[5]PACZKOWSKI M，YUAN Y，F(xiàn)LEMING-WADDELL J，et al.Alterations in the transcriptome of porcine oocytes derived from prepubertal and cyclic females is associated with developmental potential[J].JAnimSci，2011，89(11)：3561-3571.

[6]DALBI S-TRAN R，MERMILLOD P.Use of heterologous complementary DNA array screening to analyze bovine oocyte transcriptome and its evolution duringinvitromaturation[J].BiolReprod，2003，68(1)：252-261.

[7]KATZ-JAFFE M，MCCALLIE B，PREIS K，et al.Transcriptome analysis ofinvivoandinvitromatured bovine MII oocytes[J].Theriogenology，2009，71(6)：939-946.

[8]RICHTER J D.Translational control during early development[J].Bioessays，1991，13(4)：179-183.

[9]陳凌聲，徐平，石德順，等.哺乳動物卵母細(xì)胞及早期胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2014，30(7)：1018-1025.

CHEN L S，XU P，SHI D S，et al.Progress in porteomics of mammalian oocyte and early embryo[J].ChineseJournalofBiotechnology，2014，30(7)：1018-1025.(in Chinese)

[10]VITALE A M，CALVERT M E，MALLAVARAPU M，et al.Proteomic profiling of murine oocyte maturation[J].MolReprodDev，2007，74(5)：608-616.

[11]MA M，GUO X，WANG F，et al.Protein expression profile of the mouse metaphase-II oocyte[J].JProteomeRes，2008，7(11)：4821-4830.

[12]ELLEDEROVA Z，HALADA P，MAN P，et al.Protein patterns of pig oocytes duringinvitromaturation[J].BiolReprod，2004，71(5)：1533-1539.

[13]DEUTSCH D R，F(xiàn)RO?HLICH T，OTTE K A，et al.Stage-specific proteome signatures in early bovine embryo development[J].JProteomeRes，2014，13(10)：4363-4376.

[14]劉振方.水牛卵母細(xì)胞及卵泡液蛋白質(zhì)組的初步研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2012.

LIU Z F.Preliminary studies on the proteomics of buffalo oocytes and follicular fluid[D].Nanning：Guangxi University，2012.(in Chinese)

[15]陳富美，付強(qiáng)，王煥景，等.利用TMT標(biāo)記結(jié)合2DLC-MS/MS技術(shù)對水牛卵母細(xì)胞體外成熟前后差異蛋白質(zhì)組的分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，4(9)：1880-1886.

CHEN F M，F(xiàn)U Q，WANG H J，et al.Comparative analysis of proteomics by TMT-coupled 2D LC-MS/MS at buffalo oocytes before and after maturationinvitro[J].GenomicsandAppliedBiology，2015，4(9)：1880-1886.(in Chinese)

[16]常乘，朱云平.基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略和方法研究進(jìn)展[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2015，45(5)：425-438.

CHANG C，ZHU Y P.Strategies and algorithmas for quantitative proteomics based on mass spectrometry[J].ScienceinChina(SeriesC)，2015，45(5)：425-438.(in Chinese)

[17]孫洪亮，Scriptaid對水牛體細(xì)胞克隆效率的影響及其相關(guān)分子機(jī)理的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2014.

SUN H L.Studies related to effects of scriptaid on buffalo somiatic cell cloning efficiency and its molucular mechanisms[D].Nanning：Guangxi University，2014.(in Chinese)

[18]ZHANG J，DAI J，ZHAO E，et al.cDNA cloning，gene organization and expression analysis of human peptidylarginine deiminase type VI[J].ActaBiochimPol，2004，51(4)：1051-1058.

[19]CAO S，GUO X，ZHOU Z，et al.Comparative proteomic analysis of proteins involved in oocyte meiotic maturation in mice[J].MolReprodDev，2012，79(6)：413-422.

[20]YURTTAS P，VITALE A M，F(xiàn)ITZHENRY R J，et al.Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo[J].Development，2008，135(15)：2627-2636.

[21]YURTTAS P，MORENCY E，COONROD S A.Use of proteomics to identify highly abundant maternal factors that drive the egg-to-embryo transition[J].Reproduction，2010，139(5)：809-823.

[22]WANG S F，KOU Z H，JING Z Y，et al.Proteome of mouse oocytes at different developmental stages[J].PNatlAcadSciUSA，2010，107(41)：17639-17644.

[23]KING S M.The dynein microtubule motor[J].BBA-MolCellRes，2000，1496(1)：60-75.

[24]RACEDO S E，WRENZYCKI C，HERRMANN D，et al.Effects of follicle size and stages of maturation on mRNA expression in bovineinvitromatured oocytes[J].MolReprodDev，2008，75(1)：17-25.

[25]GHANEM OSMAN MOHAMED N.Molecular genetic analysis of bovine oocytes with different developmental potentials[D].Bonn: University of Bonn，2009.

[26]NECKERS L，IVY S P.Heat shock protein 90[J].CurrOpinOncol，2003，15(6)：419-424.

[27]METCHAT A，?KERFELT M，BIERKAMP C，et al.Mammalian heat shock factor 1 is essential for oocyte meiosis and directly regulates Hsp90α expression[J].JBiolChem，2009，284(14)：9521-9528.

[28]林雍峰.綿羊卵母細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

LIN Y F.Comparative proteomics analysis of mature and immatrue ovine oocyts[D].Lanzhou：Gansu Agriculture University，2011.(in Chinese)

[29]KIM J，KIM J S，JEON Y J，et al.Identification of maturation and protein synthesis related proteins from porcine oocytes duringinvitromaturation[J].ProteomeSci，2011，9(1)：1-12.

[30]LEYENS G，KNOOPS B，DONNAY I.Expression of peroxiredoxins in bovine oocytes and embryos producedinvitro[J].MolReprodDev，2004，69(3)：243-251.

[31]YANG S，LUO A，HAO X，et al.Peroxiredoxin 2 inhibits granulosa cell apoptosis during follicle atresia through the NFKB pathway in mice[J].BiolReprod，2011，84(6)：1182-1189.

(編輯程金華)

Proteomics Analysis of Immature and Mature Buffalo Oocytes

CHEN Ling-sheng1，2，DAI Xiao-li1，XU Yong-ru1，2，LUO Chan1，LU Feng-hua1，JIANG Jian-rong1，SHI De-shun1，XU Ping2，LI Xiang-ping1*

(1.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-Bioresources，GuangxiUniversity，Nanning530005，China；2.BeijingInstituteofRadiationMedicine，AcademyofMilitaryMedicalSciences，NationalCenterforProteinSciences(Beijing)，BeijingProteomeResearchCenter，StateKeyLaboratoryofProteomics，Beijing102206，China)

To reveal the molecular mechanism underlyinginvitromaturation of the buffalo oocyte and select the proteins associated with the oocyte maturation quality，sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis coupled to reverse-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry (RP-LC-MS/MS) proteomics technology were applied to identify the buffalo oocyte proteome at germinal vesicle (GV) stage and metaphase II (MII) stages.In total，647 and 570 proteins (FDR<1%) were identified from GV and MII stage buffalo oocytes，respectively.Among them，414 proteins were common identified，233 and 156 proteins were uniquely identified，respectively.The semi-quantitative information of the identified proteins was obtained using spectral counting method.Nine high abundance proteins were identified from GV and MII stage buffalo oocytes，eight of which were common proteins，including MVP，GATM3，PADI6，PRDX2，NE2，DYNLL1，AKR1B1 and LOC786101.HSP90α and GSTP1 were unique high abundance proteins identified in GV and MII stage buffalo oocytes，respectively.It indicated that they might be closely related to buffalo oocyte maturation.Results of GO (Gene Ontology) and KEGG analysis showed that these common identified proteins involved in metabolism pathways，such as pyruvate metabolism，glycolysis，tricarboxylic acid cycle (TCA)，and pentose phosphate pathway，etc，which suggested that high metabolism level was needed to complete meiotic maturation in buffalo oocytes.Proteins involved in oxidative phosphorylation，ribosome，and proteasome pathway were uniquely identified in GV stage oocytes，indicating that high level of oxidative phosphorylation and protein synthesis might exist in GV stage oocyte，and the proteasome pathway might be essential for the maturation progression of buffalo oocytes.Proteins involved in DNA replication，amino sugar and nucleotide sugar metabolism pathway were uniquely identified in MII stage oocytes，demonstrating that the oocytes might need to prepare genetic material for the fertilization and early cleavage divisions.Overall，above results revealed the protein expression profile of buffalo oocytes before and after maturation，they are useful to understand the molecular mechanisms underlying buffalo oocyte maturation.

buffalo；invitromaturation；oocyte；proteome

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.008

2016-04-07

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFCB053002；2014GXNSFAA118099；2014GXNSFAA118084)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560632)

陳凌聲(1983-)，女，廣西北海人，博士，主要從事哺乳動物卵母細(xì)胞/胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)研究，E-mail：chenlingsheng2016@163.com，Tel：0771-3239202

李湘萍，研究員，E-mail：xiangpingli@163.com

S823.8+3.3

A

0366-6964(2016)10-2003-09