耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子標(biāo)志物研究

宋敏艷，韋藝媛，2，Muhammad Zahoor Khan，王　新，俞　英*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

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耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子標(biāo)志物研究

宋敏艷1，韋藝媛1，2，Muhammad Zahoor Khan1，王新3，俞英1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.重慶市畜牧技術(shù)推廣總站，重慶 401121； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，楊凌 712100)

旨在獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子標(biāo)志物。本研究以牛乳腺上皮細(xì)胞系Mac-T為試驗(yàn)材料，利用MRSA進(jìn)行體外感染，通過(guò)與普通金葡菌感染組及未感染組進(jìn)行比較，檢測(cè)隱性乳房炎候選基因TRAPPC9、JAK2及炎癥指示因子IL-6基因在MRSA感染不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量。結(jié)果顯示，與未感染的對(duì)照組相比，MRSA 菌株體外感染Mac-T細(xì)胞6 h時(shí)，TRAPPC9基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；感染8 h時(shí)，JAK2基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；金葡菌菌株感染Mac-T細(xì)胞6 h時(shí)，TRAPPC9與JAK2基因表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。與普通金葡菌相比，經(jīng)MRSA處理6和10 h時(shí)，Mac-T細(xì)胞的TRAPPC9、JAK2及IL-6基因表達(dá)量均較高，且感染6 h時(shí)，MRSA處理組TRAPPC9基因表達(dá)量顯著高于金葡菌處理組(P<0.05)。結(jié)果表明，MRSA及金葡菌感染Mac-T細(xì)胞后，3個(gè)基因表達(dá)變化規(guī)律基本相似，MRSA菌株感染更不易引起宿主細(xì)胞JAK2基因表達(dá)量的變化，而TRAPPC9基因則可作為MRSA金葡菌及普通金葡菌感染的首選分子標(biāo)志物。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；奶牛隱性乳房炎；乳腺上皮細(xì)胞；TRAPPC9；JAK2

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)亦稱“超級(jí)細(xì)菌”，于1961年首次報(bào)道，是一種重要的醫(yī)院及社區(qū)感染病原菌，也是家畜臨床病例經(jīng)常分離到的致病菌。由于其具有多重耐藥性和極易造成暴發(fā)流行病等特征，已成為目前人類臨床抗感染治療的一大難題，也是危害最嚴(yán)重的一類人畜共患菌[1-3]。

奶牛乳房炎是奶牛乳腺在受到蚊蟲叮咬、物理刺激、病原微生物等環(huán)境刺激時(shí)，產(chǎn)生的一系列不同程度的炎癥反應(yīng)[4]。根據(jù)臨床癥狀明顯與否，將其分為臨床乳房炎和隱性乳房炎，其中隱性乳房炎發(fā)病率最高(約占牛群的25%～68%)，造成奶牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重[5]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡(jiǎn)稱金葡菌)是引起奶牛隱性乳房炎最主要的病原微生物之一，它不僅能逃逸宿主牛的天然防御系統(tǒng)，還能摧毀宿主的免疫系統(tǒng)[3，5-6]。由金葡菌尤其是MRSA金葡菌引起的奶牛乳房炎具有極強(qiáng)耐藥性，難以診治，一旦發(fā)現(xiàn)只能淘汰[3]。

奶牛群生產(chǎn)管理常用乳汁體細(xì)胞數(shù)(Somatic cell count，SCC)作為判斷隱性乳房炎的間接指標(biāo)，每毫升乳汁SCC小于10萬(wàn)為乳房健康牛，大于50萬(wàn)為乳房炎陽(yáng)性牛，20萬(wàn)～50萬(wàn)為隱性乳房炎牛[7]。本課題組X.Wang[8]，董易春[9]和T.Usman[10]等利用全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因分析等方法發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9基因(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)和JAK-STAT(Janus kinase and signal transducer and activator of transcription)信號(hào)通路上的酪氨酸蛋白激酶2基因(Janus Kinase 2，JAK2)的單核苷酸突變(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與中國(guó)荷斯坦牛的乳汁SCC及血清細(xì)胞因子顯著關(guān)聯(lián)，提示兩個(gè)基因可作為抗奶牛隱性乳房炎的關(guān)鍵候選基因。TRAPPC9基因位于奶牛14號(hào)染色體上，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，對(duì)炎癥信號(hào)通路NF-κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)的激活具有調(diào)控作用[11-12]。JAK2基因編碼胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶，通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑提高機(jī)體對(duì)細(xì)胞因子的敏感度，在炎性疾病治療中具有重要作用[13]。此外，白介素6(Interleukin-6，IL-6)在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)，與許多慢性炎癥性疾病密切相關(guān)。研究表明，IL-6濃度與炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，可作為判斷炎癥反應(yīng)的靈敏指標(biāo)[14-15]。

為確定MRSA體外感染牛乳腺上皮細(xì)胞的最佳感染時(shí)間及關(guān)鍵分子標(biāo)志物，本研究利用從新鮮牛奶中分離純化的MRSA菌株體外感染牛乳腺上皮細(xì)胞系(Mac-T細(xì)胞)，并與普通金葡菌感染及無(wú)感染的Mac-T細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)并比較了隱性乳房炎關(guān)鍵候選基因TRAPPC9、JAK2及促炎因子基因IL-6在Mac-T細(xì)胞不同處理組及不同作用時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)一步為奶牛MRSA金葡菌乳房炎的及早診斷及分子抗病育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞系與菌株

所用細(xì)胞為牛乳腺上皮細(xì)胞系(Mac-T)，由浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所惠贈(zèng)。該細(xì)胞系是一種具有正常乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)與特征的永生化細(xì)胞系，可穩(wěn)定傳代、無(wú)外源微生物污染、貼壁生長(zhǎng)。

所用菌株為本課題組前期從荷斯坦牛新鮮乳汁中分離、純化所得。其中一株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，含特異性耐藥基因MecA；另一株為普通金葡菌，含金葡菌特異基因Nuc。

1.2Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的Mac-T細(xì)胞，于37 ℃，5% CO2條件下用完全培養(yǎng)液(DMEM+10% FBS+1%雙抗)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞兩次；加入0.25% Trypsin-EDTA消化液，37 ℃，5% CO2條件下消化3～5 min，普通光學(xué)倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓脫落時(shí)加入培養(yǎng)液終止消化，收集的細(xì)胞于1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入PBS進(jìn)行清洗，反復(fù)吹打混勻細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，將收集的細(xì)胞按1∶2的比例接種于新培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯集時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.3菌株鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒(Promega，Cat.A1120)提取菌株DNA，作為PCR反應(yīng)模板。分別根據(jù)MRSA及金葡菌的特異基因MecA、Nuc序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增(引物信息見表1)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增條帶，進(jìn)而用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法鑒定菌株類型。

細(xì)菌特異性PCR反應(yīng)體系：模板3 μL，Premix 12.5 μL，正向引物(10 μmol)1 μL，反向引物(10 μmol)1 μL，ddH2O 7.5 μL，采用熱蓋反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體條件：MRSA特異基因MecA：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s；72 ℃延伸7 mim；4 ℃保存，變性到第一次延伸循環(huán)35次。金葡菌特異基因Nuc：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸7 mim；4 ℃保存，變性到第一次延伸循環(huán)35次。

1.4細(xì)菌懸液制備

將凍存的菌株從-80 ℃冰柜取出，室溫溶解，接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)18～24 h。使用稀釋平板計(jì)數(shù)法，取100 μL稀釋后的菌液均勻涂布于新鮮的PCA固體培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后計(jì)數(shù)平板上的菌落。將收集到的細(xì)菌沉淀重懸于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)整菌株濃度為1×108cfu·mL-1，4 ℃短暫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5菌株感染試驗(yàn)

傳代培養(yǎng)3代的Mac-T細(xì)胞于37 ℃，5% CO2條件下細(xì)胞生長(zhǎng)到80%匯合時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS洗2遍，添加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，然后用濃度為1×108cfu·mL-1的MRSA菌株和金葡菌菌株懸液，以MOI=10∶1的比例分別侵染細(xì)胞3、6、8、10 h；陰性對(duì)照組細(xì)胞用無(wú)菌DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)；每組3個(gè)重復(fù)。感染之后的細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗3遍，加入1 mL Trizol將細(xì)胞從瓶壁上裂解下來(lái)，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6細(xì)胞總RNA提取及基因表達(dá)量檢測(cè)

使用Trizol法抽提處理后細(xì)胞的總RNA，利用NANODROP2000紫外分光光度計(jì)與凝膠電泳檢測(cè)總RNA濃度及提取質(zhì)量，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，再通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)菌株不同處理時(shí)間后TRAPPC9、JAK2及IL6基因的mRNA表達(dá)量，各基因引物見表1。以內(nèi)參基因GAPDH對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并利用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，用t-檢驗(yàn)比較感染組與對(duì)照組間的基因表達(dá)差異。

2　結(jié)　果

2.1普通金葡菌菌株與MRSA菌株特異性分子鑒定

Nuc基因與MecA基因分別是金葡菌菌株和MRSA菌株的特異性基因。特異性PCR鑒定結(jié)果顯示，從荷斯坦牛乳汁中分離純化的菌株，分別擴(kuò)增到特定片段大小的單一目的條帶(Nuc及MecA基因擴(kuò)增片段分別為279和310 bp，圖1)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果也表明，兩條擴(kuò)增產(chǎn)物分別為Nuc與MecA基因，確定了本研究使用的兩株菌株分別為金葡菌菌株(圖1A)及MRSA菌株(圖1B)。2.2Mac-T細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)

復(fù)蘇后培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞(Mac-T)呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)：培養(yǎng)至24 h，可見許多分散生長(zhǎng)的鵝卵石樣的單個(gè)細(xì)胞(圖2A)；培養(yǎng)至36 h時(shí)，這些鵝卵石樣細(xì)胞開始聚集生長(zhǎng)(圖2B)；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時(shí)，細(xì)胞在瓶底已達(dá)80%匯集，細(xì)胞呈均勻的多角形和鵝卵石樣混合生長(zhǎng)(圖2C)；此時(shí)的Mac-T細(xì)胞再培養(yǎng)兩代即可用于后續(xù)感染試驗(yàn)。

表1PCR擴(kuò)增基因引物信息

Table 1The information of gene primer by PCR

基因Gene序列(5'-3')Sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProduct退火溫度/℃Tm文獻(xiàn)ReferenceNucF:GCGATTGATGGTGATACGGTTR:AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC27959[16]MecAF:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAR:CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA31058[16]TRAPPC9F:CTGCTCCGCTCGGTGAATGACR:GCTTTACCGCCAGTTCCACCA10460[9]JAK2F:TGAAGACCGAGACCCTACACR:CTGCAAGGATTTAAGGATTTC21260[10]IL-6F:GAACGAGTATGAGGGAAATCR:TCTCAAGGTTTCTCAGGATG13860GAPDHF:GGCGTGAACCACGAGAAGTATAAR:CCCTCCACGATGCCAAAGT11960[10]

A：1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.Nuc基因特異PCR產(chǎn)物；B：1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.MecA基因特異PCR產(chǎn)物A：1.DL600 DNA marker；2.The specific PCR product of Nuc gene；B：1.DL600 DNA marker；2.The specific PCR product of MecA gene圖1　特異性PCR鑒定Nuc與MecA基因Fig.1　The identification of Nuc and MecA genes by specific PCR

2.3菌株感染不同時(shí)間點(diǎn)牛TRAPPC9、JAK2及IL-6基因表達(dá)變化規(guī)律

為確定MRSA感染牛乳腺上皮細(xì)胞Mac-T后候選基因的表達(dá)變化規(guī)律，針對(duì)感染時(shí)間為3、6、8 以及10 h的MRSA處理組和金葡菌處理組Mac-T細(xì)胞，與無(wú)感染的對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行隱性乳房炎抗性候選基因TRAPPC9、JAK2及促炎因子基因IL-6的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(圖3)。

針對(duì)TRAPPC9基因，比較MRSA菌株感染組與陰性對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量在感染組細(xì)胞中隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MRSA感染6 與10 h時(shí)TRAPPC9表達(dá)量顯著下降(P<0.05，圖3A)。對(duì)于JAK2基因，也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量隨MRSA感染時(shí)間而下降，其中感染8與10 h時(shí)基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05，圖3B)。

金葡菌菌株感染與MRSA菌株感染結(jié)果相似，感染組Mac-T細(xì)胞的TRAPPC9、JAK2基因表達(dá)量均低于對(duì)照組，且當(dāng)感染6、8 和10 h時(shí)，TRAP-PC9基因表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01，圖3A)；當(dāng)感染6 和10 h時(shí)，JAK2基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05，圖3B)。與對(duì)照組相比，無(wú)論MRSA菌株感染組還是金葡菌菌株感染組，IL-6基因表達(dá)量均差異不顯著，但可看出感染6 h時(shí)表達(dá)量較大(圖3C)。

結(jié)果表明，MRSA菌株感染Mac-T細(xì)胞后，TRAPPC9與JAK2基因表達(dá)量均低于對(duì)照組，僅發(fā)現(xiàn)IL-6基因表達(dá)量略高于對(duì)照組，但差異不顯著。金葡菌菌株感染后基因表達(dá)變化規(guī)律與MRSA相似。

2.4MRSA與普通金葡菌菌株感染Mac-T細(xì)胞的基因表達(dá)差異

為進(jìn)一步確定MRSA菌株與金葡菌菌株感染細(xì)胞后的差異，將MRSA菌株與金葡菌菌株在6、8和10 h 3個(gè)具有顯著性差異時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量進(jìn)行比較(圖4)。從圖中可以看出，除了8 h時(shí)JAK2基因表達(dá)量在金葡菌處理組高于MRSA處理組，其余情況下3個(gè)基因的表達(dá)量均是MRSA處理組高于金葡菌處理組，且感染6 h時(shí)TRAPPC9基因表達(dá)量在兩組間存在顯著差異(P<0.05，圖4A)。結(jié)合基因表達(dá)變化規(guī)律，即兩株菌感染后TRAPPC9與JAK2基因表達(dá)量均低于未感染的對(duì)照組，提示MRSA感染后可能更不易被宿主細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。

A.分散生長(zhǎng)的鵝卵石狀Mac-T細(xì)胞；B.聚集生長(zhǎng)的鵝卵石狀Mac-T細(xì)胞；C.多角形和鵝卵石狀混合生長(zhǎng)的Mac-T細(xì)胞A.The scattering growth of paving stone like Mac-T cells；B.The congregating growth of paving stone like Mac-T cells；C.The mixing growth of paving stone like and polygonous Mac-T cells圖2　牛乳腺上皮細(xì)胞系Mac-T細(xì)胞形態(tài) 100×Fig.2　The morphology of bovine mammary epithelial cell lines (Mac-T cell) 100×

*.P<0.05；**.P<0.01圖3　TRAPPC9、JAK2及IL-6基因在MRSA感染與金葡菌Mac-T細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量Fig.3　The expression levels of TRAPPC9，JAK2 and IL-6 genes at different time points in Mac-T cells post-infected by MRSA and S.aureus

*.P<0.05圖4　TRAPPC9、JAK2及IL-6基因在MRSA與金葡菌感染Mac-T細(xì)胞6(A)、8(B)和10 h(C)的表達(dá)量Fig.4　The expressions of TRAPPC9，JAK2 and IL-6 genes at 6 (A)，8 (B) and 10 h(C) in Mac-T cells post-infected by MRSA and S.aureus

3　討　論

奶牛乳腺上皮細(xì)胞既是泌乳細(xì)胞，又是重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫效應(yīng)細(xì)胞，在乳腺防御病原微生物感染中發(fā)揮重要作用[17]。本研究針對(duì)“超級(jí)菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染引起的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Mac-T)炎癥反應(yīng)，通過(guò)與普通金葡菌感染的Mac-T細(xì)胞進(jìn)行平行對(duì)比，檢測(cè)并分析了課題組前期在中國(guó)荷斯坦牛群發(fā)現(xiàn)的奶牛隱性乳房炎抗性候選基因TRAPPC9[8]、JAK2[10]以及炎癥指示因子IL-6[13]基因的表達(dá)情況，獲得了MRSA菌株體外感染牛乳腺上皮細(xì)胞的關(guān)鍵分子標(biāo)志物。

MRSA及普通金葡菌引起的奶牛乳房炎通常為不易發(fā)現(xiàn)、不易診治的隱性乳房炎，尤其是MRSA菌因其較強(qiáng)耐藥性，即使在人類醫(yī)學(xué)中也難以攻克其引起的院內(nèi)及社區(qū)感染[18]。據(jù)人們對(duì)中國(guó)北方地區(qū)6個(gè)省市9個(gè)奶牛場(chǎng)1 000余頭中國(guó)荷斯坦牛乳汁中的細(xì)菌分離、純化及分子鑒定發(fā)現(xiàn)，MRSA菌在其中一個(gè)牛場(chǎng)乳房炎牛中的檢出率達(dá)7.2%[19]，必須嚴(yán)加重視以防止其成為人畜交叉?zhèn)魅驹?。本研究利用其中一株MRSA 菌株體外感染Mac-T細(xì)胞，當(dāng)感染6 h時(shí)，隱性乳房炎候選基因TRAPPC9表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；感染8 h時(shí)，JAK2基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明MRSA感染Mac-T細(xì)胞所引起的基因表達(dá)差異存在感染時(shí)間點(diǎn)的不同。此外，本研究用一株普通金葡菌感染Mac-T細(xì)胞，與MRSA感染不同的是，感染6 h時(shí)即引起JAK2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，提示MRSA菌感染更不易引起宿主細(xì)胞JAK2基因表達(dá)量的變化。

值得注意的是，TRAPPC9基因表達(dá)量在MRSA及金葡菌菌株感染6 h均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，提示該基因針對(duì)兩種菌株感染的反應(yīng)均較為及時(shí)且明顯。TRAPPC9基因位于奶牛14號(hào)染色體上，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9蛋白(NIBP)，即NIK及IKKβ結(jié)合蛋白，NIBP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活具有調(diào)控作用[20]。NF-κB信號(hào)通路最早于1986年提出，其在乳房炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[21]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，TRAPPC9基因不僅是荷斯坦牛隱性乳房炎的重要候選基因[8]，且在金葡菌陽(yáng)性牛外周血中的表達(dá)量也顯著低于健康牛[22]。中國(guó)北方地區(qū)荷斯坦牛金葡菌感染率較高，所檢測(cè)牛群金葡菌感染率達(dá)11.7%，其中臨床乳房炎牛為10.8%，生產(chǎn)群泌乳牛更高為12.4%，須嚴(yán)加防范[19]。本研究檢測(cè)到的TRAPPC9基因無(wú)論在奶牛乳腺上皮細(xì)胞，還是外周血中均呈現(xiàn)顯著的基因表達(dá)量變化[22]，可作為MRSA及金葡菌感染奶牛的關(guān)鍵分子標(biāo)志物加以推廣應(yīng)用。

MRSA金葡菌及普通金葡菌具有免疫抑制及逃逸宿主免疫的特性，即抑制宿主免疫相關(guān)基因的表達(dá)或逃逸免疫細(xì)胞的識(shí)別，使宿主不能及時(shí)應(yīng)對(duì)和抵抗菌體的感染[6，23]。研究發(fā)現(xiàn)，約40%的金葡菌感染隱性乳房炎奶牛其乳汁體細(xì)胞數(shù)低于20 萬(wàn)·mL-1[24]，而小于20萬(wàn)·mL-1的體細(xì)胞數(shù)是目前廣泛采用的健康牛標(biāo)準(zhǔn)[7]。本研究結(jié)果顯示，MRSA菌株與普通金葡菌菌株感染Mac-T細(xì)胞6、8 及10 h后，TRAPPC9與JAK2基因表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，提示TRAPPC9和JAK2可能與兩株菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。但牛乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)受到MRSA菌株與普通金葡菌感染抑制的分子機(jī)理，除本研究的TRAPPC9、JAK2、IL-6基因外，還需對(duì)更多炎癥相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行研究。

IL-6在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，其中血液中IL-6濃度與患者炎癥反應(yīng)的程度呈正相關(guān)，可作為判斷病情嚴(yán)重程度的靈敏指標(biāo)[14-15]。然而在本研究中，未發(fā)現(xiàn)IL-6基因表達(dá)量與金葡菌感染有直接聯(lián)系(圖3C)。盡管當(dāng)MRSA及普通金葡菌感染Mac-T細(xì)胞6 h時(shí)，IL-6基因表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，P>0.05)，但當(dāng)感染8 h后，其表達(dá)量降低并與未感染細(xì)胞相近。究其原因，可能是IL-6主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的IL-6針對(duì)MRSA及金葡菌感染反應(yīng)不敏感，不宜作為兩種菌感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物。

綜上，本研究利用體外MRSA型金葡菌與普通金葡菌感染的牛乳腺上皮細(xì)胞模型，通過(guò)比較不同感染時(shí)間，獲得TRAPPC9、JAK2和IL-6基因的表達(dá)變化規(guī)律，并從基因表達(dá)水平確定了MRSA菌感染牛乳腺上皮細(xì)胞的首選分子標(biāo)志物是TRAPPC9基因，其次是JAK2基因。有關(guān)奶牛乳腺上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞先天性抵抗MRSA菌感染的分子機(jī)制，還有待針對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行深入的功能驗(yàn)證。

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(編輯郭云雁)

Molecular Marker Study of Inflammatory Reaction in Bovine Mammary Epithelium Cell Line Induced by Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus

SONG Min-yan1，WEI Yi-yuan1，2，Muhammad Zahoor Khan1，WANG Xin3，YU Ying1*

(1.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，MinistryofAgriculture&NationalEngineeringLaboratoryforAnimalBreeding，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.ChongqingAnimalHusbandryTechniquesExtensionCenter，Chongqing401121，China；3.CollegeofFoodScienceandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to acquire key molecular marker related to inflammatory reaction of bovine mammary epithelium cells induced by Methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA).In this study，bovine mammary epithelium cell line (Mac-T) was infected with MRSAinvitroby compared with the cells treated byS.aureusas well the untreated cells.The expression levels of two candidate genes associated with subclinical mastitis ((trafficking protein particle complex 9(TRAPPC9)，Janus Kinase 2(JAK2)) and one pro-inflammatory gene (interleukin 6，IL-6) were detected and compared among infected groups and non-infected group at different time points.Comparing with the untreated cells，the results showed that the mRNA expression level ofTRAPPC9 significantly decreased (P<0.05) in the Mac-T cells at 6 h post stimulation by MRSA，while that ofJAK2 significantly decreased (P<0.05) at 8 h；And the expression levels ofTRAPPC9 andJAK2 in the cells significantly decreased (P<0.05) at 6 h post infection byS.aureus.Compared withS.aureusstimuli，the expression levels ofTRAPPC9，JAK2 andIL-6 in the Mac-T cells were moderately higher at 6 and 10 h post infection by MRSA.Especially，the expression level ofTRAPPC9 was significantly higher in MRSA treated cells (P<0.05) compared toS.aureustreated cells at 6 h post infection.These results suggest that the genes expression changes in the Mac-T cells were similar after the infection of MRSA andS.aureus，while the gene expression changes ofJAK2 in the cells was delayed from MRSA infection compared toS.aureus.TRAPPC9 can be used as the preferred molecular marker for detecting MRSA andS.aureusinfection in bovine mammary epithelium cells.

Methicillin-resistantStaphylococcusaureus；bovine subclinical mastitis；mammary epithelium cell lines；TRAPPC9；JAK2

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.007

2016-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272420)；國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-37-04B)；“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2011BAD28B02)；教育部基本科研項(xiàng)目(2011JS006；Z109021306)；長(zhǎng)江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1191)

宋敏艷(1986-)，女，陜西咸陽(yáng)人，博士生，主要從事奶牛表觀遺傳調(diào)控與抗病機(jī)理研究，E-mail：songminyanjiandan@163.com

俞英，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物健康性狀改良及表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

S823;S813.3

A

0366-6964(2016)10-1995-08