姜黃素抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究

趙軼峰，魏玉磊，王　萍，王敏敏，王金科

(1. 河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075061；2. 河北省張家口市優(yōu)撫醫(yī)院，河北 張家口 075000)

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姜黃素抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究

趙軼峰1，魏玉磊1，王萍2，王敏敏2，王金科1

(1. 河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075061；2. 河北省張家口市優(yōu)撫醫(yī)院，河北 張家口 075000)

目的研究姜黃素對人乳腺癌細胞株BT549細胞凋亡的誘導作用及其機制。方法取對數(shù)生長期BT549細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)并接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5 000個細胞，24 h后加濃度分別為 0，10，20，40，80 μmol/L的姜黃素，培養(yǎng)12，24，48 h后采用MTT實驗檢測BT549細胞增殖抑制率；分別用0，10，20，40，80 μmol/L姜黃素處理細胞，48h后采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡指數(shù)；分別用0，10，20，40，80 μmol/L姜黃素處理細胞，48 h后采用Western blot實驗檢測細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達量。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長，姜黃素0，20，40，60，80 μmol/L組BT549細胞增殖抑制率逐漸增高(P均<0.05)，且同時間點內(nèi)姜黃素0，20，40，60，80 μmol/L組細胞增殖抑制率隨劑量增加逐漸增高(P均<0.05)。TUNEL染色結(jié)果顯示，姜黃素0，20，40，60，80 μmol/L組BT549細胞凋亡指數(shù)隨劑量增加逐漸增加(P均<0.05)。Western blot實驗結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加,總蛋白中β-catenin的表達不受影響(P>0.05), 而細胞核中β-catenin的表達逐漸減少(P<0.05)。結(jié)論姜黃素通過Wnt/β-catenin信號傳導通路抑制乳腺癌細胞株BT549細胞的增殖和誘導其凋亡，并呈現(xiàn)時間、劑量依賴性。

姜黃素；Wnt/β-catenin；乳腺癌細胞；凋亡

乳腺癌是女性常見的腫瘤，嚴重威脅著婦女的健康。Wnt基因是從小鼠乳腺癌中克隆出的原癌基因，可調(diào)節(jié)乳腺細胞的生長和分化，Wnt信號通路參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，而Wnt/β-catenin是目前研究最多的與乳腺癌有關(guān)的Wnt通路[1]。研究顯示，抑癌基因失活和癌基因的激活可異常激活Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin降解障礙，可導致CyclinD1、C-myc等靶基因激活，細胞周期調(diào)控異常，從而引起乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[2]。Jang等[3]研究顯示抑制Wnt/β-catenin信號通路可阻滯乳腺癌腫瘤干細胞和腫瘤細胞的生長，抑制乳腺癌生長；Zhao等[4]研究顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路可阻滯細胞周期于G2/M期，促進癌細胞凋亡。姜黃素為姜科植物提取的有效成分，具有明顯的抗腫瘤效果，對肺癌[5]、肝癌[6]等多種腫瘤的Wnt/β-catenin信號通路有調(diào)節(jié)作用，但姜黃素對乳腺癌Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用尚少見報道。因此，筆者研究了姜黃素抑制人乳腺癌細胞株BT549細胞Wnt/β-catenin信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡的作用機制，以期能為乳腺癌的臨床治療開辟新的途徑?，F(xiàn)報道如下。

1　實驗資料

1.1材料人乳腺癌細胞株BT549細胞購自上海細胞生物研究所。1640培養(yǎng)基和無支原體胎牛血清購自Gibco，胰酶購自美國Invitrogen公司，青鏈霉素購自Biowest公司，姜黃素購自Sigma公司。MTT試劑盒購自Sigma公司，TUNEL試劑盒購自Roche公司，兔抗β-catenin、Histone H3購自Santa Cruz公司，鼠抗β-actin抗體購自中山金橋。

1.2細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株BT549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3MTT實驗檢測BT549細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期BT549細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)并接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5 000個細胞，24 h后換新鮮1640培養(yǎng)基并分別加入濃度為 0，10，20，40，60，80 μmol/L姜黃素。培養(yǎng)12，24，48 h后，PBS沖洗2遍，加入含10 μL MTT的1640培養(yǎng)基100 μL，4 h后每孔加200 μL DMSO,振蕩10 min用酶標儀檢測吸光度(OD) 值。增殖抑制率=(1-加藥組平均OD值/對照組平均OD 值)×100%。

1.4TUNEL染色法檢測細胞凋亡情況分別用0，10，20，40，60，80 μmol /L姜黃素處理細胞，48 h后用4%多聚甲醛固定，按照試劑盒要求操作，DAB顯色后封片，在微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)凋亡細胞個數(shù)，算出凋亡指數(shù)。

1.5Western blot實驗檢測細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達量分別用0，10，20，40，60，80 μmol/L姜黃素處理細胞，48 h后裂解細胞提取蛋白，配膠，處理蛋白后煮沸樣品，以80 μg /30 μL每孔上樣，電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉4 h。一抗4 ℃冰箱平放過夜；次日用辣根過氧化物酶標記的二抗于室溫下孵育2 h。用Odyssey掃描條帶，并用Image J灰度分析軟件分析各樣品目的蛋白與β-actin的比值，求出相對灰度值。

2　結(jié)　　果

2.1姜黃素對BT549細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)時間延長，姜黃素0，20，40，60，80 μmol/L組BT549細胞增殖抑制率逐漸增高(P<0.05)，且同時間點內(nèi)姜黃素0，20，40，60，80 μmol/L組細胞增殖抑制率逐漸增高(P<0.05)。見表1。

表1　不同濃度姜黃素作用BT549細胞不同時間 對細胞增殖的抑制情況±s，%)

2.2姜黃素對BT549細胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，姜黃素0，20，40，60，80μmol/L組BT549細胞凋亡指數(shù)分別為(8.1±3.3)%，(19.4±2.7)%，(32.5±4.3)%，(57.2±4.1)%，(76.3±1.8)%。隨著姜黃素濃度的增加，BT549細胞凋亡指數(shù)明顯增高(F=31.667，P<0.05)。

2.3姜黃素對細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Western blot實驗結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加，總蛋白中β-catenin的表達不受影響(P>0.05), 而細胞核中β-catenin的表達逐漸減少(P<0.05)。見圖1及表2。

圖1　不同濃度姜黃素處理BT549細胞后總蛋白、 核蛋白中β-catenin蛋白表達情況表2　不同濃度姜黃素處理BT549細胞對β-catenin 蛋白表達的影響

姜黃素濃度β-catenin總蛋白β-catenin核蛋白0μmol/L68.15±2.3358.82±2.1520μmol/L74.41±2.6948.71±2.3140μmol/L65.02±2.1431.69±2.0260μmol/L68.74±2.5516.98±1.7680μmol/L58.64±2.129.98±1.03F2.06628.611P0.140<0.001

3　討　　論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前臨床上常用的治療手段能明顯提高患者的生存時間和生活質(zhì)量，但是腫瘤耐藥和復發(fā)依然嚴重威脅著患者的健康。因此研究新藥物并探究其機制在乳腺癌的治療中具有重要的臨床意義。姜黃素是中藥姜黃的主要成分，是天然存在的多酚類化合物，毒性很低，曾被用作食品添加劑，并且在抗炎、降血脂、保護神經(jīng)等方面有重要作用[7-8]。近年來大量實驗表明姜黃素可以抑制腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等，能減慢荷瘤小鼠腫瘤的生長速度[9-12]。韋達等[13]研究顯示，姜黃素可上調(diào)乳腺癌MCF-7細胞bax基因表達，下調(diào)bcl-2基因表達，阻滯細胞于G1/S，誘導腫瘤細胞凋亡。但姜黃素誘導乳腺癌細胞凋亡的詳細機制尚有待進一步研究。

細胞凋亡是由基因調(diào)控的細胞主動死亡過程，與細胞增殖失控兩者一起在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin 信號通路參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，β-catenin是Wnt信號通路中最關(guān)鍵的通道傳遞分子，β-catenin轉(zhuǎn)移到核內(nèi)是該通路被激活的標志[14]。正常情況下Wnt通路處于關(guān)閉狀態(tài)，β-catenin與Ecadherin、APC、Axin、GS-3β等結(jié)合，介導黏附和磷酸化降解功能，細胞質(zhì)β-catenin水平維持在較低水平[15]。在腫瘤細胞中，Wnt通路異常激活，β-catenin的降解受到抑制，游離的β-catenin可與Tcf/lef結(jié)合進入細胞核，啟動CyclinD1、C-myc等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，CyclinD1和C-myc是細胞周期和生成調(diào)控基因，過度表達可導致細胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常，引起腫瘤的發(fā)生，DKK家族是Wnt信號抑制通路，上調(diào)DKK表達可抑制乳腺癌的形成[16]。曾令瑞等[17]應(yīng)用免疫組化EnVision兩步法對乳腺癌中β-catenin和CyclinD1的表達進行檢測，結(jié)果顯示乳腺癌原發(fā)癌灶中β-catenin異位表達率和CyclinD1的陽性表達率分別為54.3%和63.0%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌灶中β-catenin異位表達率和Cyclin D1陽性表達率分別為76.1%和82.6%。結(jié)果提示W(wǎng)nt/β-catenin通路異常激活可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要機制，抑制Wnt信號通路的激活可作為乳腺癌臨床治療的新靶點。

姜黃素對多種腫瘤的Wnt通路均有抑制作用。賈佳等[18]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制人結(jié)腸癌細胞HT-29增殖，且存在量效關(guān)系，HT-29細胞的β-catenin表達隨著干預(yù)時間的延長逐漸降低，認為抑制Wnt通路的激活可能是姜黃素抑制結(jié)腸癌增殖的作用機制之一。趙琳琳等[6]研究則顯示，姜黃素可下調(diào)肝癌細胞Bel7402、QGY7703細胞Wnt/β-catenin信號通路，降低β-catenin表達，誘導Bel7402和QGY7703凋亡。本研究結(jié)果顯示，姜黃素能誘導乳腺癌BT549細胞的凋亡，抑制其增殖，并呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性，而這種作用是通過β-catenin的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運激活實現(xiàn)的，與趙琳琳等[6]研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可與Dvl2特點區(qū)域結(jié)合，增加β-catenin復合體形成，降低游離β-catenin水平；姜黃素還可與Hsp90蛋白結(jié)合，去磷酸化AKT，激活GSK-3β，促進β-catenin復合體形成[19]。本研究結(jié)果顯示，隨著姜素濃度增加，β-catenin總蛋白量無顯著變化，而β-catenin核蛋白量逐漸降低，進一步提示姜黃素可能通過促進β-catenin復合物形成、減少β-catenin在細胞核積聚發(fā)揮對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用。

綜上所述，姜黃素通過Wnt/β-catenin信號傳導通路抑制乳腺癌細胞株BT549細胞的增殖和誘導其凋亡，并呈現(xiàn)時間、劑量依賴性，為乳腺癌的臨床治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。但姜黃素激活Wnt /β-catenin信號傳導通路的具體機制及下游原癌基因啟動的調(diào)控還有待進一步研究。

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Study on the mechanism of curcumin inhibiting the apoptosis of breast cancer cells induced by Wnt/β-catenin signaling pathway

ZHAO Yifeng1, WEI Yulei1, WANG Ping2, WANG Minmin1, WANG Jinke1

(1.The First Affiliated Hospital of Hebei North College, Zhangjiakou 075061, Hebei, China; 2.Zhangjiakou Special Care Hospital, Zhangjiakou 075000, Hebei, China)

Objective It is to study the inducing effect of curcumin on apoptosis of human breast cancer cell line BT549 and its mechanism. Methods Logarithmic growth phase bt549 cells were counted and seeded on 96 hole culture plate with about 5 000 cells in each hole. After 24 h, 0,10,20,40,80 μmol/L curcumin were added to culture cells, and the proliferation inhibition rate of BT549 cells was detected by MTT assay after 12, 24 and 48 h culture. The cells were treated with 0,10,20,40,80 μmol/L curcumin respectively, and the apoptosis index was detected by TUNEL staining after 48 hours. The cells were treated with 0,10,20,40,80 μmol/L curcumin respectively, and the expression of cell proliferation and apoptosis related protein was detected by Western blot assay after 48 h. Results The MTT colorimetric assay results showed that at 12 h, 24 h, 48 h, the BT549 cells proliferation inhibition rate gradually increased in 0 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L,80 μmol/L curcumin group(P<0.05).The results of TUNEL staining showed that the apoptotic index of BT549 cells increased gradually in the 0 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L,80 μmol/L curcumin group(P<0.05).Blot Western showed that with the increase of the concentration of curcumin, the expression of β-catenin in the total protein was not affected (P>0.05), while the expression of β-catenin in the nucleus gradually decreased (P<0.05). Conclusion Curcumin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of breast cancer cell line BT549 cells by β-catenin beta Wnt/signaling pathway, and present time and dose dependence.

curcumin; Wnt/β-catenin; breast cancer cell; apoptosis

趙軼峰，男，主治醫(yī)師，研究方向為胃腸腫瘤。

張家口市科技攻關(guān)計劃項目(15211080)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.29.004

R-33

A

1008-8849(2016)29-3202-04

2016-02-28