侵襲性肺曲霉病的研究進(jìn)展

陳先華　郝　飛

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·綜述·

侵襲性肺曲霉病的研究進(jìn)展

陳先華郝飛

曲霉菌；侵襲性肺曲霉病；實(shí)驗(yàn)室診斷

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是指曲霉菌菌絲生長(zhǎng)侵入肺實(shí)質(zhì)而引起的感染性疾病；其最常見的感染患者為惡性血液病以及實(shí)體器官和造血干細(xì)胞移植的患者[1]。由于煙曲霉菌的血培養(yǎng)通常顯陰性，并且通過支氣管肺泡灌洗從下呼吸道取樣來進(jìn)行曲霉菌的培養(yǎng)通常不夠靈敏，所以IPA的診斷比較復(fù)雜。近年來，非培養(yǎng)的診斷方法不斷發(fā)展起來，包括成像檢查，PCR技術(shù)，抗原檢測(cè)等[2]。雖然歐洲癌癥治療與研究組織(European Organisation for the Research Treatment of Cancer )及美國(guó)真菌病研究工作組(US Mycoses Study Group)均制定了侵襲性真菌感染和診斷的標(biāo)準(zhǔn)[3]；我國(guó)2006 年中華內(nèi)科雜志編輯委員會(huì)也制訂了《侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則( 草案) 》，但臨床檢驗(yàn)并沒有完全按照這些標(biāo)準(zhǔn)來執(zhí)行[4]。為提高IPA的早期診斷水平，現(xiàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料復(fù)習(xí)并討論近年來IPA早期診斷的研究熱點(diǎn)，旨在確定一個(gè)有利于對(duì)于肺部IPA疾病的針對(duì)性治療以及改善治療效果的診斷策略，而不是一味地進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)治療。

一、概述

1. 病因?qū)W：IPA最常見的病原體為煙曲霉菌(A. fumigatus)，為環(huán)境中常見的霉菌，由于其孢子較小，較易侵犯肺實(shí)質(zhì)，亦會(huì)累及胸膜、氣管以及細(xì)支氣管；此外，機(jī)體37 ℃的體溫也為其生長(zhǎng)提供了良好的條件[5]。

2. 流行病學(xué)：侵襲性曲霉病可以引起免疫功能低下患者的嚴(yán)重機(jī)會(huì)感染，尤其是發(fā)生在中性粒細(xì)胞水平降低的患者中，體外研究顯示中性粒細(xì)胞具有殺死曲霉菌的作用，中性粒細(xì)胞減少的患者肺部具有較高的侵襲性曲霉病感染的風(fēng)險(xiǎn)，包括慢性阻塞性肺病的患者、嚴(yán)重肝病患者及重癥監(jiān)護(hù)的患者，以及感染H1N1病毒的患者和手術(shù)患者[6]。HIV感染患者感染曲霉病的風(fēng)險(xiǎn)較低，由于其免疫缺陷表現(xiàn)在CD4細(xì)胞，其基本不參與曲霉菌的發(fā)病過程，但是也有艾滋病患者發(fā)生侵襲性曲霉病的報(bào)道。慢性肉芽腫的患者具有發(fā)生一種特異性的IPA的風(fēng)險(xiǎn)，主要表現(xiàn)為爆發(fā)性的肺炎。近年來，也有對(duì)IPA的易感性進(jìn)行的研究。缺乏甘露糖結(jié)合凝集素的人群，或者該凝集素突變的人群可能有更高的IPA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7]。

3. 預(yù)后：近20年來，IPA患者的治療效果有了較大的進(jìn)展。在1990年，異體造血干細(xì)胞移植患者由于IPA的病死率高達(dá)94%，但在2009年的統(tǒng)計(jì)顯示，造血干細(xì)胞移植的患者12周的病死率約為35%。歐洲的一個(gè)關(guān)于惡性血液病患者的臨床試驗(yàn)顯示，患者12周的病死率為42%，并且在2004年至2009年間有較大幅度的降低[8]。一項(xiàng)關(guān)于兒童的IPA患者的研究顯示，3年的生存率為55%[9]。但是，IPA所致的死亡仍舊是影響患者短期以及長(zhǎng)期生存率的重要因素。在患有急性骨髓性白血病的患者中進(jìn)行的研究顯示，曲霉菌感染患者的2年生存率為14%，而未感染的患者2年生存率為32%[10]。美國(guó)的一項(xiàng)研究顯示，曲霉菌感染的患者與未感染的患者相比，具有明顯更高的病死率，花費(fèi)更多的治療費(fèi)用，同時(shí)治療時(shí)間明顯延長(zhǎng)[11]。

4. 診斷：IPA患者的癥狀和體征表現(xiàn)均非特異性，并且通常在臨床治療中，由于患者發(fā)熱可能會(huì)經(jīng)驗(yàn)性地給予抗菌藥物治療，治療效果不明顯。炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物如C-反應(yīng)蛋白或降鈣素的表現(xiàn)也非特異性，但可用于檢測(cè)確診的IPA患者的治療效果。對(duì)于IPA的比較具有特異性的診斷方式包括：成像、直接顯微鏡檢、組織病理學(xué)檢查、病原培養(yǎng)、抗原檢測(cè)以及DNA檢測(cè)。常見的診斷方式及其優(yōu)劣，見表1。

表1　常見的侵襲性曲霉病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法

有研究評(píng)價(jià)了采用胸部高分辨率CT斷層掃描的診斷方法具有較好的特異性，目前，該方法已經(jīng)成為疑似IPA患者的重要檢測(cè)手段。更重要的是，該方法中暈輪信號(hào)對(duì)于識(shí)別侵入血管壁的曲霉菌具有較好的特異性，其他的信號(hào)如樹芽狀、節(jié)段組合結(jié)構(gòu)顯示可能與呼吸道疾病有關(guān)[12]。但是，有研究對(duì)患有侵襲性曲霉病患者或者非淋巴瘤的70例患者進(jìn)行了研究，顯示單純依靠CT成像進(jìn)行IPA的診斷是很困難的，因其不具有足夠的敏感性和特異性[13]。

每一種疾病的診斷都會(huì)遇到一個(gè)問題，那就是新的標(biāo)記物出現(xiàn)以后，怎么與舊的標(biāo)記物進(jìn)行比較。對(duì)于IPA的診斷，仍然存在這樣的問題，并且限制了半乳甘露聚糖檢測(cè)這一以往常用于診斷IPA的方法在血清樣本檢測(cè)中的應(yīng)用。目前，該方法可能只能用于檢測(cè)少數(shù)患者的支氣管肺泡灌洗液，并且該疾病的診斷還必須有活組織培養(yǎng)或者活檢的陽性結(jié)果。

二、IPA診斷方法

1. 直接顯微鏡檢查：診斷IPA最簡(jiǎn)單的方法之一為采用適當(dāng)?shù)臉?biāo)本進(jìn)行直接顯微鏡檢查。但是這種方法缺乏特異性，由于曲霉屬真菌很少在體內(nèi)產(chǎn)生孢子，并且采用這種方法看到的菌絲不能反映真菌的數(shù)量。文獻(xiàn)報(bào)道此方法的靈敏度在0%～90%[14]，差異之大可能與試驗(yàn)方法不同有關(guān)，特別是有的方法可能用到了熒光增白劑。

2. 組織病理學(xué)檢查：采用活檢或者尸檢材料進(jìn)行組織病理學(xué)檢查可為是否存在侵襲性的真菌感染提供診斷證據(jù)。由于從組織切片中根據(jù)菌絲鑒別真菌的種類是很困難的，因此還需要通過曲霉菌的培養(yǎng)，獲得陽性的結(jié)果，才能進(jìn)行侵襲性曲霉病的診斷。組織病理學(xué)檢查對(duì)于診斷侵襲性真菌病是很有價(jià)值的，但是在大多數(shù)情況下，特別是在肺部發(fā)生侵襲性真菌感染的時(shí)候，可能由于患者血小板計(jì)數(shù)太低或者一些其他的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，通過胸廓穿刺活檢是屬于禁忌的。在一項(xiàng)病例系列研究中，只有40%的患者采用了支氣管肺活組織檢查，在其組織中檢測(cè)到了真菌菌絲，其他的患者均由于血清培養(yǎng)陽性或者半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)陽性而診斷為侵襲性曲霉病。通過組織切片檢查，曲霉屬真菌的菌絲是非常窄的，直徑一般在1～3 μm，很難和其他的一些真菌進(jìn)行區(qū)別。有研究采用免疫組化標(biāo)記的方法來對(duì)固定組織切片中的真菌細(xì)胞進(jìn)行鑒別，但是鑒于其技術(shù)上的要求，并且很少有臨床的樣本材料采用這樣的方法進(jìn)行分析，因此很難對(duì)這種方法在臨床檢驗(yàn)過程中進(jìn)行普及。在還沒有對(duì)組織樣本進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，采用PCR的方法來進(jìn)行固定組織樣本中菌絲的鑒別還是很有用的[15]。

3. 培養(yǎng)：在采用半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)以及PCR等特異性較好的實(shí)驗(yàn)室檢查之前，通過臨床樣本的培養(yǎng)獲得陽性的結(jié)果是傳統(tǒng)進(jìn)行侵襲性曲霉病的診斷方法。樣本的陽性培養(yǎng)產(chǎn)物也可以用于一些其他的檢測(cè)，比如藥敏試驗(yàn)。從技術(shù)層面上來看，大多數(shù)的曲霉菌的生長(zhǎng)都比較快，在多數(shù)的微生物培養(yǎng)介質(zhì)及血瓊脂中都能很好的生長(zhǎng)。有研究顯示把孵育的時(shí)間從2d延長(zhǎng)至5d可以增加17%的培養(yǎng)數(shù)量[16]。由于進(jìn)行病原的培養(yǎng)比較簡(jiǎn)單并且花費(fèi)很低，有研究報(bào)道了一種可以增強(qiáng)該方法的靈敏度，并可以快速并且特異性地檢測(cè)洋地黃固定的曲霉菌菌落的方法。通常通過對(duì)菌落以及其顯微形態(tài)學(xué)的檢查，來對(duì)培養(yǎng)的曲霉屬真菌進(jìn)行鑒別是比較容易的。近年來，一些新的非典型的曲霉屬真菌得到確定，并且對(duì)其DNA序列也進(jìn)行了測(cè)定。

4. 半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)：半乳甘露聚糖是一種碳水化合物分子，具有一個(gè)由甘露糖殘基組成的骨架，該殘基具有β1-5連接的呋喃半乳糖殘基。在1992年，就有研究報(bào)道了對(duì)該分子進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法采用了一種單克隆抗體EB-A2，它可以與4個(gè)呋喃半乳糖殘基特異性的結(jié)合，從而進(jìn)行半乳甘露聚糖的檢測(cè)[17]。通常在中性粒細(xì)胞減少的血液病或者造血干細(xì)胞移植的患者中都可以從血清中檢測(cè)到半乳甘露聚糖，通過高分辨的CT可以檢測(cè)到曲霉菌侵入了血管，也進(jìn)一步證明了只有侵入血管后才會(huì)有半乳甘露聚糖的釋放。相反，在慢性肉芽腫患者中，侵襲性曲霉病的特征主要表現(xiàn)在肺膿腫，通常會(huì)限制霉菌侵入血管，因此血清半乳甘露聚糖檢測(cè)的結(jié)果一般是陰性。對(duì)動(dòng)物模型以及侵襲性曲霉病患者的研究均顯示，葡聚糖在血清中有較高水平的分布，血清葡聚糖檢測(cè)是侵襲性曲霉病診斷的一個(gè)較好的標(biāo)記物。有研究采用本法檢測(cè)了30個(gè)懷疑患有侵襲性曲霉病的患者，63%的患者檢測(cè)結(jié)果均為陽性，而對(duì)照組73%的患者為陰性[18]。但是患有其他真菌感染的患者采用本法檢測(cè)也可能為陽性，包括假絲酵母菌、鐮刀菌屬、枝頂孢屬、肺囊蟲病以及莢膜組織胞漿菌等[19]。因此，葡聚糖是IPA檢測(cè)的一個(gè)不具有較好特異性的標(biāo)記物。

5. 曲霉菌DNA檢測(cè)：在1988年聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)發(fā)明后不久，已有研究報(bào)道如何從樣本中進(jìn)行DNA的提取，并且通過PCR的方法進(jìn)行曲霉菌DNA的檢測(cè)，從而對(duì)動(dòng)物模型或者患者進(jìn)行疾病的診斷[20]。但是，對(duì)于定植和感染的區(qū)別限制了該方法的使用。1997年，有人從中性粒細(xì)胞減少的血液病患者血液中進(jìn)行了DNA的提取，并且對(duì)13例患有侵襲性曲霉病的患者，采用斑點(diǎn)印跡法進(jìn)行全真菌引物探測(cè)曲霉菌DNA，并對(duì)大亞基rRNA進(jìn)行了擴(kuò)增[21]，其后該技術(shù)得到了廣泛的關(guān)注和發(fā)展。但是，由于目前不同的研究文獻(xiàn)中采用的DNA的提取方法，PCR方法，以及產(chǎn)物的檢測(cè)方法各有不同，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化以及各種不同方法的比較，因此還沒有商業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)化的PCR檢測(cè)試劑盒，導(dǎo)致DNA檢測(cè)方法還沒能列入歐洲癌癥治療研究組織(EORTC)對(duì)IPA感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)中[22]。

6. 其他侵襲性曲霉病的生物標(biāo)記物：近年來，見有一些新的檢測(cè)方法報(bào)道。新近一種測(cè)定只有在霉菌生長(zhǎng)的時(shí)候才會(huì)產(chǎn)生的細(xì)胞外的糖蛋白抗原檢測(cè)方法，被稱之為測(cè)流裝置，該方法對(duì)采用半乳甘露聚糖和葡聚糖檢測(cè)診斷為侵襲性曲霉病的患者進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，顯示出較好的特異性。另外采用侵襲性曲霉病的豚鼠模型進(jìn)行研究，顯示胞外糖蛋白抗原作為標(biāo)記物要早于半乳甘露聚糖和葡聚糖出現(xiàn)[23]。其他建議作為標(biāo)記物的煙曲霉抗原包括存在于生長(zhǎng)的霉菌表面的Cf2和細(xì)胞壁相關(guān)抗原，膠毒素及其衍生物[24]。

曲霉菌的血清抗體可作為侵襲性曲霉病的一種診斷方法，但是，在免疫功能低下的患者中，對(duì)曲霉菌感染的抗體應(yīng)答一般比較差。但對(duì)于非中性粒細(xì)胞減少患者的診斷，以及患者在清髓性化療以及干細(xì)胞移植之前，對(duì)于抗體的檢查是非常有用的[25]。在非免疫功能低下的患者，如COPD患者，對(duì)曲霉菌的抗體應(yīng)答可能是比較有意義的。

對(duì)IPA患者進(jìn)行呼吸測(cè)試臨床已有使用。最近的一項(xiàng)研究顯示，在2例患者的測(cè)試中成功檢測(cè)到2-正戊基呋喃，推測(cè)這種新的方法可能為診斷IPA提供新的證據(jù)并且有關(guān)這種超低介入的研究方法值得進(jìn)一步試驗(yàn)研究[26]。

近年來，多種研究措施和方法都在努力地想要實(shí)現(xiàn)肺部IPA的準(zhǔn)確鑒別和診斷，以此在患者治療方案中獲益。在曲霉病診斷和治療中也有了較大的進(jìn)步，但是其與疾病相關(guān)的病死率并沒有成比例的減少[27]。在免疫功能低下的高風(fēng)險(xiǎn)患者中，特別是那些中性粒細(xì)胞減少的患者，雖然目前對(duì)其疾病特點(diǎn)有了一定的了解，并對(duì)慢性肺病患者的IPA的診斷和治療也采用了特殊的方法[28]。但并不能減少中性粒細(xì)胞低于正常水平患者的死亡率。對(duì)于IPA診斷方法的研究仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，但有理由相信隨著對(duì)曲霉菌菌體抗原成分和結(jié)構(gòu)特性研究的發(fā)展，其臨床的診斷和治療將得到不斷的改進(jìn)。

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(本文編輯：張大春)

陳先華，郝飛. 侵襲性肺曲霉病的研究進(jìn)展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(2)： 201-203.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.022

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271753)

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2016-01-09)