3-BrPA對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用研究

唐　青　胡義德

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·論著·

3-BrPA對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用研究

唐青胡義德

目的探究3-BrPA對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。方法①細(xì)胞培養(yǎng): RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞及人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞；②采用CCK8及Western blot法觀察3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用和P-糖蛋白(P-glycoprote, P-gp)的表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度3-BrPA作用A549 /DDP細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)羅丹明-123(Rhodamine-123，Rh123) 的蓄積情況。結(jié)果順鉑對(duì)A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞及3-BrPA作用后的A549/DDP細(xì)胞的IC50分別為6.714 μg/ml、38.99 μg/ml及12.86 μg/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.03，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為81%。3-BrPA可使A549/DDP細(xì)胞的P-gp表達(dá)下調(diào)。3-BrPA可使A549/DDP細(xì)胞內(nèi)的Rh123蓄積增多并呈劑量依賴性。結(jié)論3-BrPA可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，作用機(jī)制可能與其抑制P-gp的功能和表達(dá)有關(guān)。

支氣管肺癌；3-BrPA；A549/DDP細(xì)胞；耐藥逆轉(zhuǎn)

肺癌是全球范圍內(nèi)病死率居于首位的惡性腫瘤，順鉑(DDP)是治療肺癌較為有效的化療藥物之一[1]。但臨床上許多肺癌患者在經(jīng)歷了最初的化療之后，仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移, 其失敗的主要原因是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了多藥耐藥(multiple drug resistance, MDR)[2]。經(jīng)大量研究證實(shí): P-糖蛋白(P-gp) 過度表達(dá)是產(chǎn)生MDR 的主要原因[3-4]。自從維拉帕米等第一代MDR逆轉(zhuǎn)劑問世以來，已有一批針對(duì)各種MDR相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[4-6]。其中糖酵解己糖激酶抑制劑3-BrPA給MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究帶來了一個(gè)新的熱潮。近幾年國(guó)外研究表明，3-BrPA是一種強(qiáng)烷化劑，其能通過抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解過程中的己糖激酶，減少腫瘤細(xì)胞ATP的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]。已有文獻(xiàn)報(bào)道3-BrPA可增敏鉑類藥物對(duì)耐藥細(xì)胞株的殺傷作用[9-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)將3-BrPA作為研究對(duì)象，探討其對(duì)A549/DDP細(xì)胞是否具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用，并觀察對(duì)P-gp蛋白功能和表達(dá)的影響。

材料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞株： 人肺腺癌耐順鉑A549/DDP細(xì)胞(購(gòu)于上海義森生物科技有限公司)、人肺腺癌A549細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室前期保存)。

2. 主要試劑： RPMI1640、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶(購(gòu)于Hycoly公司)；胎牛血清(購(gòu)于Gibco公司)；5 mg/ml順鉑注射液 (購(gòu)于Sigma公司)；3-BrPA (購(gòu)于Alfa Aesar 公司)；CCK8試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(購(gòu)于碧云天公司)；硝酸纖維素膜(購(gòu)于Millipore公司)；PGP兔單克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑盒(advansta公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 將A549細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，將A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)在含15%胎牛血清、0.5 μg/ml順鉑(維持濃度)的RPMI1640培養(yǎng)液中，兩種細(xì)胞置于37 ℃、 5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)。

2. CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè): 3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制作用：用胰蛋白酶將鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底的A549/DDP細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,使每孔含A549/DDP細(xì)胞約5 000個(gè)，加入培養(yǎng)液使得每孔終體積為200 μl。將96孔板置于37 ℃、 5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h后吸除孔內(nèi)廢棄培養(yǎng)液，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/ml濃度梯度的3-BrPA，空白對(duì)照組僅加入200 μl培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組僅含A549/DDP細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μl。每組設(shè)三個(gè)平行復(fù)孔，再放入孵箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入200 μl培養(yǎng)液和10 μl CCK8，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處OD值，試驗(yàn)重復(fù)三次以上。增殖抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。規(guī)定生長(zhǎng)率>90%的藥物濃度為該藥的非細(xì)胞毒性劑量，并作為最佳逆轉(zhuǎn)耐藥濃度。

3. CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用：將A549細(xì)胞及A549/DDP 細(xì)胞消化、離心后用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104/ml。取100 μlA549/DDP細(xì)胞懸液(約5 000個(gè)細(xì)胞)加入96 孔板，每組設(shè)置三個(gè)平行復(fù)孔。將96孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h后吸除孔內(nèi)廢棄培養(yǎng)液，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分別先加入無毒劑量的3-BrPA后，依次加入濃度梯度為2.5，5，10，20，40 μg/ml的順鉑，同時(shí)設(shè)只加入順鉑 (濃度梯度同上)的陽性對(duì)照組；再取100 μl A549細(xì)胞懸液(約5 000個(gè)細(xì)胞)加入96孔板，加入順鉑(濃度梯度同上)和培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。按CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定450 nm處各孔吸光度OD值，取三孔平均值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。通過Graphpad.prism.v5.01軟件分別計(jì)算A549細(xì)胞、A549/DDP 細(xì)胞及A549/DDP 細(xì)胞加入3-BrPA后抑制率為50%時(shí)的順鉑濃度即IC50，再按照以下公式計(jì)算耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率。

耐藥倍數(shù)RF= A549/DDP 細(xì)胞IC50/A549細(xì)胞IC50

逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RI= A549/DDP 細(xì)胞IC50/A549/DDP 細(xì)胞加入逆轉(zhuǎn)劑IC50

相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率= (A549/DDP 細(xì)胞IC50-A549/DDP 細(xì)胞加入逆轉(zhuǎn)劑IC50) /(A549/DDP 細(xì)胞IC50-A549細(xì)胞IC50)

4. Western blot 法檢測(cè)P-gp的表達(dá)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞、A549/DDP細(xì)胞以及3-BrPA作用48 h后的A549/DDP細(xì)胞消化離心、冰上裂解后移入EP管中用BCA法測(cè)定蛋白濃度。上樣時(shí)每組取40 μg 的蛋白樣品，用5% SDS-PAGE膠垂直電泳分離(濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，100 min)，轉(zhuǎn)至PVDF膜上后，室溫下封閉1 h，孵一抗(PGP、GAPDH 均1︰1 000) 4 ℃過夜; TBST洗膜每次10 min，共4次，再加入二抗(山羊抗兔IgG1︰3 000)，37 ℃孵育1 h ，TBST洗膜5 min，共3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。

5. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp 的功能：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞經(jīng)消化、離心后用1 640培養(yǎng)液制成1×106/ml 細(xì)胞懸液，取100 μlA549/DDP細(xì)胞懸液加入6孔板中，設(shè)置陰性對(duì)照組(PBS)、實(shí)驗(yàn)組1、2、3(3-BrPA濃度分別為6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml)每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。放進(jìn)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后胰酶消化，將培養(yǎng)細(xì)胞用PBS漂洗1次，制成單細(xì)胞懸液，37 ℃孵育30 min，每管加入終濃度達(dá)5 μg/ml的Rh123，再在37 ℃孵育40 min，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心2 min，棄上清，用冷凍PBS重新懸浮，轉(zhuǎn)移0.5 ml入流式上樣管。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)　　果

一、3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制作用

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)3-BrPA濃度從3.125 μg/ml增加到100 μg/ml時(shí)，對(duì)A549/DDP細(xì)胞的24 h抑制率也從(1.95±2.24)%上升至(49.45 ±2.95)%，100 μg/ml的3-BrPA分別作用24 h、48 h、72 h后的抑制率為(49.45 ±2.95)%、(56.16±2.56)%、(64.05±3.06)%，說明3-BrPA能不同程度的抑制A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)，并且具有時(shí)間-劑量依賴性，即隨著3-BrPA濃度和作用時(shí)間的遞增，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越來越明顯，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(結(jié)果見表1，圖1)。按上述規(guī)定6.25 μg/ml及以下濃度的3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，即將濃度5 μg/ml作為3-BrPA后續(xù)工作濃度。

表1　3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖抑制的量效時(shí)效關(guān)系

圖13-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制作用

二、3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞的抑制率隨順鉑濃度的增加而呈遞增趨勢(shì)相同濃度的順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率在加入5 μg/ml 3-BrPA干預(yù)后較干預(yù)前顯著增高(P<0.05)，說明3-BrPA與順鉑聯(lián)用可增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用(見表2、圖2、3)。通過Graphpad.prism.5.0軟件計(jì)算得到A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞的IC50分別為6.714 μg/ml、38.99 μg/ml，耐藥倍數(shù)為5.81,3-BrPA作用后的A549/DDP細(xì)胞的IC50為12.86 μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.03，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為81%。

表2　3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

圖2順鉑對(duì)A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線

圖35 μg/ml 3-BrPA對(duì)不同濃度順鉑作用下的A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制作用

三、3-BrPA對(duì)P-gp表達(dá)的影響

P-gp是存在于腫瘤細(xì)胞膜上的一種能量依賴性藥物外排泵，與抗腫瘤藥物結(jié)合后通過ATP水解提供能量, 將化療藥物逆濃度梯度從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,降低細(xì)胞內(nèi)藥物積聚, 從而導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與親本A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞存在P-gp過表達(dá)現(xiàn)象，而在加入5 μg/ml的3-BrPA作用48 h后，P-gp表達(dá)明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。

圖43-BrPA對(duì)P-gp表達(dá)的影響;注：1：A549細(xì)胞 2：A549/DDP細(xì)胞 3：加入5 μg/ml 3-BrPA處理48 h后的A549/DDP細(xì)胞

四、3-BrPA對(duì)P-gp功能的影響

Rhodamine -123是一種陽離子熒光染料，也是P-gp的特異底物，P-gp能夠利用水解ATP的能量，將細(xì)胞內(nèi)的Rh123泵出細(xì)胞外，降低Rh123的胞內(nèi)蓄積，因此可通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Rh123 熒光強(qiáng)度的變化來反應(yīng)細(xì)胞表面P-gp的功能[11]。流式結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比，加入3-BrPA作用后的三個(gè)組平均熒光強(qiáng)度(MFI)均有所增強(qiáng)，并且具有劑量依賴性(見圖5)。說明3-BrPA可降低P-gp功能，減少Rh123外排，增加Rh123胞內(nèi)蓄積。

圖5不同濃度3-BrPA對(duì)A549/DDP細(xì)胞內(nèi)Rh123蓄積的影響

討　　論

肺癌是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，目前最主要的治療方式仍是以化療為主，但影響化療療效并導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵在于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性。1976年Juliano首先發(fā)現(xiàn)P-gp與腫瘤細(xì)胞MDR有關(guān)。P-gp是依賴ATP的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，P-gp與藥物結(jié)合，ATP水解后所釋放的能量使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，同時(shí)可通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)將細(xì)胞內(nèi)的毒性藥物移到胞外，細(xì)胞由此產(chǎn)生耐藥性[12-15]。維拉帕米是目前公認(rèn)的耐藥逆轉(zhuǎn)劑，其通過影響P-gp功能，抑制細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外而達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用[16-17]，但因其有效劑量下的毒副作用嚴(yán)重而在臨床運(yùn)用中受到了限制。因此尋找到一種高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為腫瘤化療領(lǐng)域的新思路。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-BrPA能明顯抑制A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)，并且隨著3-BrPA濃度的逐漸增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A549/DDP細(xì)胞的存活率也逐漸降低，說明3-BrPA是一種有效的腫瘤抑制藥物。與對(duì)照組相比，順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制作用在加入逆轉(zhuǎn)濃度的3-BrPA后明顯增強(qiáng)，IC50由38.99 μg/ml降到12.86 μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.03。由此可見，3-BrPA在自身發(fā)揮抗腫瘤作用抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，還能作為一種有效的化療增敏藥物，逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的耐藥性。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，加入3-BrPA后的A549/DDP細(xì)胞的P-gp表達(dá)明顯降低，說明3-BrPA可下調(diào)P-gp表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。同時(shí)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，3-BrPA可增強(qiáng)Rh123在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，并且3-BrPA濃度越大，Rh123在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量越大。由此提示，3-BrPA逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞耐藥性的機(jī)制可能與抑制P-gp表達(dá)、降低P-gp功能有關(guān)。

綜上所述, 本研究證實(shí)了3-BrPA在低毒劑量下確實(shí)具有抑制肺癌細(xì)胞增殖并部分逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥的作用，并初步闡明了3-BrPA逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制是通過抑制P-gp表達(dá)和降低P-gp功能而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用。這為今后3-BrPA作為一種新型的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑提供了理論依據(jù)。不過因3-BrPA自身存在的安全性、穩(wěn)定性、靶向性等問題決定了其克服腫瘤MDR真正進(jìn)入臨床應(yīng)用所需的時(shí)間。但相信隨著以上問題的逐一解決，3-BrPA可能會(huì)成為一個(gè)具有巨大應(yīng)用價(jià)值的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

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(本文編輯：王亞南)

唐青，胡義德. 3-BrPA對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(2)： 145-149.

Experimental study of 3-BrPA on reversing multidrug resistance of human lung cancer cell line A549/DDP

TangQing,HuYide.

DepartmentofOncology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,ChinaCorrespondingauthor：HuYide,Email:huyide_mit@aliyun.com

ObjectiveTo preliminarily explore the reversal effect of 3-BrPA on multidrug resistance of lung cancer cell line A549/DDP and to study its potential mechanism. Methods①Cell culture: The human lung adenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells were grown in RPMI1640 medium; ②CCK8 and Western blot were used to observe the reversal effect of 3-BrPA on cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells and the expression of P-gp. Flow cytometric technology was used to detect different concentrations of 3-BrPA on A549/DDP cells by measuring Rh123 mean fluorescence intensity (MFI). Results The IC50 of cisplatin to A549 cells, A549/DDP cells and A549/DDP cells after 3-BrPA added were 6.714 μg/ml, 38.99 μg/ml and 20.2 μg/ml, respectively. The reversal ratio was 3.03 and the relative reversal efficiency was 81% as compared to A549 cells; The 3-BrPA can make the expression of P-gp on A549/DDP cells dropped. The result of FCM shows that 3-BrPA can increase the accumulation of Rh123 on A549/DDP cells in a dose-dependent manner. Conclusions3-BrPA can reverse the drug resistance on A549/DDP cell line to cis-platinum in a certain extent, which may be attributed to down regulating of P-gp expression.

Bronchus lung cancer;3-BrPA;Cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells;Resistance reversal

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372340)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腫瘤研究所

胡義德，Email: huyide_mit@aliyun.com

R734.2

A

2015-09-10)