• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    番茄獨腳金內(nèi)酯合成關(guān)鍵基因CCD7、CCD8 RNA沉默載體的構(gòu)建

    2017-03-18 15:05:37田芳姚兆群陳美秀徐瑛趙思
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年21期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)酯串聯(lián)克隆

    田芳++姚兆群++陳美秀++徐瑛++趙思峰

    摘要:根據(jù)已知的番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)CCD7和CCD8基因的序列設(shè)計特異性引物,采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段,通過特定酶切將2個基因進行拼接,再將串聯(lián)基因以反向重復(fù)的方式連入pUCCRNAi載體,并定向插入到p35植物表達載體上。結(jié)果表明,克隆獲得了大小約為400 bp的CCD7和CCD8基因片段,基因片段拼接后獲得800 bp左右的串聯(lián)片段CCD7-8;將該基因片段插入pUCCRNAi載體后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重復(fù)序列In-7-8,并成功插入到植物表達載體p35中,通過酶切分析,RNAi載體構(gòu)建正確。最終成功構(gòu)建了番茄CCD7和CCD8 2個串聯(lián)基因的RNA沉默表達載體p35-In-7-8。

    關(guān)鍵詞:番茄(Lycopersicon esculentum Mill.);獨腳金內(nèi)酯;列當(dāng);類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)和8(CCD8);RNA沉默載體

    中圖分類號:Q78 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)21-5668-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.058

    Construction of Strigolactones Key Genes CCD7、CCD8 of

    Tomato RNA Silencing Expression Vector

    TIAN Fang, YAO Zhao-qun, CHEN Mei-xiu, XU Ying, ZHAO Si-feng

    (Key Laboratory of Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricul-tural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization /College of Agriculture, Shihezi Uni-versity, Shihezi 832003, Xinjiang, China)

    Abstract: In order to construct tomato(Lycopersicon esculentum Mill.) carotenoid cleavage dioxygense 7(CCD7) and 8 (CCD8) RNA silencing expression vector, the specific primers were designed according to the published sequence of tomato CCD7 and CCD8. The CCD7 and CCD8 fragments were obtained by RT-PCR amplification,then they were concatenated through specific enzyme digestion,and cloned into pUCCRNAi vector in a inverted repeat manner,finally inserted into p35 plant expression vector. Results show that we cloned about 400 bp CCD7 and CCD8 gene fragment,respectively. The concatenation gene CCD7-8 of 800 bp was constructed by gene fragment splicing. Two copies of CCD7-8 gene was inserted into pUCCRNAi vector and got 1 700 bp contain Introns inverted repeat sequence In-7-8. Then they were inserted into p35 vector successfully and the RNAi vector was constructed correctly by enzyme digestion analysis. Finally successful constructed tomato CCD7 and CCD8 two concatenation genes RNA silencing expression vector p35-In-7-8.

    Key words: tomato(Lycopersicon esculentum Mill.); strigolactones; orobanche; carotenoid cleavage dioxygense 7(CCD7) and 8(CCD8);RNA silencing vector

    列當(dāng)(Orobanche coerulescens Steph.)是一類無葉綠素并以全寄生方式寄生于其他植物根部獲取所需養(yǎng)分的植物,其可寄生在茄科、豆科、菊科、傘形科、葫蘆科等多種重要經(jīng)濟作物上,造成寄主植物減產(chǎn)5%~100%,已在亞洲、歐洲、非洲、南美洲和北美洲的較多國家和地區(qū)發(fā)生,每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失達數(shù)十億美元[1-3]。人們采用農(nóng)業(yè)、物理、化學(xué)、生物等各項措施防治列當(dāng),均無法完全防治,在列當(dāng)嚴重發(fā)生地區(qū)的農(nóng)民會因為防效和防治成本等問題直接放棄所種作物甚至棄耕土地[4,5]。列當(dāng)靠種子進行繁殖,且種子產(chǎn)生量大,1株成熟植株可產(chǎn)生5萬~50萬粒種子,種子可隨風(fēng)、流水、人為活動等因素快速傳播,可在土壤中存活數(shù)十年,這是列當(dāng)難以防治的重要原因[1,3]。列當(dāng)種子內(nèi)的KAI2蛋白是一個受體蛋白,可感受到寄主植物根系分泌的獨腳金內(nèi)酯類似物的刺激然后誘導(dǎo)列當(dāng)種子萌發(fā)[6],若能減少寄主植物分泌的獨腳金內(nèi)酯或使其不分泌,則有望培育出抗列當(dāng)?shù)募闹髌贩N[7]。Dor等[8]發(fā)現(xiàn)番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)突變株SL-ORT1因不能產(chǎn)生獨腳金內(nèi)酯從而對埃及(瓜)列當(dāng)表現(xiàn)出高抗特性;用類胡蘿卜素生物合成途徑抑制劑氟啶草酮處理番茄后,與對照相比,處理番茄植株根系幾乎檢測不到獨腳金內(nèi)酯,同時根際大麻列當(dāng)種子萌發(fā)率減少98%以上[9]。在植物體內(nèi),類胡蘿卜素裂解雙加氧酶7(CCD7)和8(CCD8)是獨腳金內(nèi)酯合成途經(jīng)中最為關(guān)鍵的2個功能基因,可共同作用將β-類胡蘿卜素裂解成獨腳金內(nèi)酯,這2個基因缺失或者沉默,均會導(dǎo)致獨腳金內(nèi)酯合成量下降或不能合成[7,10]。列當(dāng)目前在新疆主要農(nóng)業(yè)區(qū)均有分布,已在加工番茄、甜瓜、向日葵等重要經(jīng)濟作物上造成嚴重損失[3,11]。本研究從番茄上克隆CCD7和CCD8基因,并利用獲得的基因,構(gòu)建RNA沉默載體,為獲得抗列當(dāng)?shù)莫毮_金內(nèi)酯合成量減少的植株提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    材料:所用番茄品種為改良毛粉802,將番茄種子用2%的次氯酸鈉消毒后種植于營養(yǎng)土∶蛭石為 1∶1的花盆內(nèi)并置于溫室培養(yǎng),2 d澆1次水,待長到7~8片真葉后將其從花盆中取出,切取根系并用水沖洗干凈,晾干。根據(jù)TRIzol法提取根部RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

    載體:中間載體pUCCRNAi和植物表達載體p35由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠老師贈送。

    菌株:大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

    主要試劑:pMD18-T Vector、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;引物合成和基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

    1.2 目的基因片段的獲得及驗證

    根據(jù)NCBI上已知番茄CCD7和CCD8基因的序列信息,分別設(shè)計了兩個基因部分片段引物(表1)。為了便于載體的構(gòu)建,在擴增CCD7目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入XbaⅠ和StuⅠ酶切位點,在擴增CCD8目標(biāo)片段的上下游引物上分別引入StuⅠ和SalⅠ酶切位點。

    以提取的番茄根部cDNA為共同模板,7-F和7-R為引物,擴增CCD7基因片段;再以8-F和8-R為引物,擴增CCD8基因片段。利用瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR擴增產(chǎn)物,割膠回收目的基因片段并連接于pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化培養(yǎng),PCR鑒定為陽性的克隆進行測序驗證。

    1.3 目的片段的串聯(lián)

    將片段CCD7和CCD8分別克隆到pMD18-T載體上,通過PCR篩選目標(biāo)基因片段,分別記作pMD18-T-7和pMD18-T-8。

    用限制性內(nèi)切酶StuⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-7;再用StuⅠ和SalⅠ切取CCD8片段,用T4連接酶將片段CCD8連入pMD18-T-7中,并將新得到的克隆命名為pMD18-T-7-8。

    1.4 反向重復(fù)序列在中間載體pUCCRNAi上的構(gòu)建

    1)串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。以pMD18-T-7-8為模板,7-F和8-R為引物,PCR擴增串聯(lián)片段CCD7-8。載體pUCCRNAi和pMD18-T-7-8分別用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切后,將串聯(lián)片段正向插入到pUCCRNAi中,記作+pRNAi-7-8。

    2)串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒。因為pUCCRNAi質(zhì)粒上XbaⅠ、SalⅠ與SpeⅠ、XhoⅠ分別為同尾酶,所以載體+pRNAi-7-8用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶切后,直接將串聯(lián)片段CCD7-8連入+pRNAi-7-8中,新得到的載體記作pRNAi-In-7-8。

    1.5 沉默表達載體的構(gòu)建

    用PstⅠ將pRNAi-In-7-8上包含Intron在內(nèi)的反向重復(fù)序列切下,插入用同樣酶切且已去磷酸化的p35植物表達載體上,篩選轉(zhuǎn)化重組體得到CCD7-8基因的反向重復(fù)植物表達載體p35-In-7-8。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因片段的獲得及驗證

    以7-F和7-R為引物,獲得的番茄cDNA為模板進行PCR擴增,得到約400 bp大小的目標(biāo)條帶(圖1A);以8-F和8-R為引物、番茄cDNA為模板進行PCR擴增,獲得約400 bp大小的目標(biāo)條帶(圖1B),均與預(yù)計結(jié)果接近。PCR產(chǎn)物與pMD-18-T載體連接后,挑選單克隆進行測序。將測得的序列登陸NCBI進行Blast比對。通過MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。CCD7的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2 A)顯示CCD7與Solanum lycopersicum CCD7 NM_001247504.1在同一個分支上聚為一組,同源性達到97%;CCD8的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2B)顯示,CCD8與Solanum lycopersicum CCD8 JF831532.1、Solanum lycopersicum CCD8 NM_001279347.2在同一個分支上聚為一組,同源性較高。結(jié)果表明,克隆的CCD7和CCD8序列正確。

    2.2 目標(biāo)片段的串聯(lián)

    將片段CCD7與T載體連接,轉(zhuǎn)化、挑克隆并搖菌,以7-F和7-R為引物進行菌液PCR,得到約400 bp大小的片段,說明片段CCD7已連上T載體,記作pMD18-T-7(圖3A)。

    用StuⅠ和SalⅠ雙酶切片段CCD8后,與同樣酶切的pMD18-T-7載體相連,以7-F和8-R為引物,PCR擴增串聯(lián)片段CCD7-8,電泳檢測,得到800 bp左右的條帶,記作pMD18-T-7-8(圖3B)。獲得含有CCD7和CCD8 2個基因片段的串聯(lián)基因。

    2.3 干涉中間載體的構(gòu)建

    2.3.1 串聯(lián)片段正向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ對pMD18-T-7-8質(zhì)粒進行酶切,獲得大小為800 bp的串聯(lián)基因片段CCD7-8。酶切片段經(jīng)割膠回收后連入同樣酶切開的pUCCRNAi載體,獲得+pRNAi-7-8重組載體。以7-F和8-R為引物,PCR擴增,得到約800 bp的目標(biāo)條帶(圖4),表明CCD7-8已連入pUCCRNAi載體。

    2.3.2 串聯(lián)片段反向插入pUCCRNAi質(zhì)粒 采用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和XhoⅠ酶切+pRNAi-7-8質(zhì)粒,將串聯(lián)基因CCD7-8連入其中,獲得pRNAi-In-7-8重組載體。采用PstⅠ對重組載體進行酶切鑒定,結(jié)果顯示,重組載體能切下1 700 bp左右的目的基因條帶(圖5)。表明串聯(lián)基因CCD7-8已反向連入+pRNAi-7-8載體,pRNAi-In-7-8中間載體構(gòu)建成功。

    2.4 沉默表達載體的構(gòu)建

    用限制性內(nèi)切酶PstⅠ雙酶切pRNAi-In-7-8質(zhì)粒,獲取了包含Intron的In-7-8片段。將酶切后的In-7-8片段回收后定向插入以相同限制性內(nèi)切酶酶切且去磷酸化的植物表達載體p35上。重組載體用限制性內(nèi)切酶PstⅠ進行酶切,可切下大小約1 700 bp的條帶(圖6),表明包含Intron在內(nèi)的串聯(lián)基因CCD7-8已成功連入p35,從而得到具有反向重復(fù)序列的植物表達載體p35-In-7-8。

    3 小結(jié)與討論

    獨腳金內(nèi)酯(Strigolactones,SLs)是一類新發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素衍生型植物激素,其在抑制植物分枝、調(diào)節(jié)根生長、葉老化和花的形成方面有重要作用,在刺激列當(dāng)種子萌發(fā)并與寄主植物建立寄生關(guān)系過程中也至關(guān)重要[6,7]。目前已知有多個酶參與獨腳金內(nèi)酯的合成,其中胡蘿卜素裂解雙加氧7(CCD7)和胡蘿卜素裂解雙加氧酶8(CCD8)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究中克隆獲得的番茄CCD7和CCD8基因經(jīng)BLAST分析后與Solanum lycopersicum的CCD7和CCD8都有很高的同源性。Vogel等[10]將番茄中的CCD7沉默后,番茄上Orobanche ramosa的寄生量減少了90%,但同時番茄分枝量有了明顯的增加;Pasare等[12]將馬鈴薯的CCD8沉默后馬鈴薯表現(xiàn)出側(cè)枝增加,匍匐莖減少。Gomez-Roldan等[13]將豌豆體內(nèi)與獨腳金內(nèi)酯合成密切相關(guān)的CCD8基因被缺失突變后突變體無法有效合成獨腳金內(nèi)酯,列當(dāng)?shù)募纳鷶?shù)量也顯著減少。單個基因的沉默已經(jīng)取得了良好的抗列當(dāng)效果。

    反向重復(fù)序列導(dǎo)入植物體是一種高效誘導(dǎo)RNA沉默的方法,其優(yōu)點是在任何遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟的植株中都可進行,且產(chǎn)生的RNA沉默高效持久并能在后代穩(wěn)定遺傳[14]。本研究先在一個小型中間載體中構(gòu)建好反向重復(fù)序列后再轉(zhuǎn)入植物表達載體,并且兩個反向重復(fù)片斷之間有Intron隔開,選用小型中間載體pUCCRNAi構(gòu)建反向重復(fù)拷貝數(shù)高,操作容易。本研究在構(gòu)建RNA沉默載體時所用的pUCCRNAi中間載體中已經(jīng)插入了一段Intron序列,使用十分方便。同時把CCD7和CCD8進行串聯(lián),同時插入到一個載體中,減少了多余的試驗操作,省時省力。

    本研究以番茄根部提取的cDAN為模板,克隆CCD7和CCD8基因片段并使其串聯(lián),插入到中間載體pUCCRNAi中構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu),最后插入到植物表達載體p35上,成功構(gòu)建含2個基因片段的RNA沉默載體p35-In-7-8,為研究抗列當(dāng)?shù)姆研缕贩N培育提供了技術(shù)支撐。

    參考文獻:

    [1] HABIMANA S,NDUWUMUREMYI A,CHINAMA R J D.Management of Orobanche in field crops——A review[J].Journal of Soil Science and Plant Nutrition,2014,14(1):43-62.

    [2] ALY R.Advanced technologies for parasitic weed control[J]. Weed Science,2012,60(2):290-294.

    [3] PARKER C. Observations on the current status of Orobanche and Striga problems worldwide[J].Pest Management Science, 2009,65(5):453-459.

    [4] RUBIALES D,F(xiàn)ERN?NDEZ-APARICIO M.Innovations in parasitic weeds management in legume crops. A review[J].Agronomy for Sustainable Development,2012,32(2):433-449.

    [5] WESTWOOD J H,YODER J I,TIMKO M P,et al. The evolution of parasitism in plants[J].Trends Plant Science,2010,15(4):227-235.

    [6] CONN C E,BYTHELL-DOUGLAS R, NEUMANN D,et al. Convergent evolution of strigolactone perception enabled host detection in parasitic plants[J].Science,2015,349(6247):540-543.

    [7] CARDOSO C1,RUYTER-SPIRA C,BOUWMEESTER H J.Strigolactones and root infestation by plant-parasitic Striga, Orobanche and Phelipanche spp[J].Plant Science,2011,180(3):414-420.

    [8] DOR E,YONEYAMA K,WININGER S,et al. Strigolactone deficiency confers resistance in tomato Line SL-ORF1 to the parasitic weeds Phelipanche and Orobanche spp[J].Phytopathology,2011,101(2):213-222.

    [9] L?PEZ-R?EZ J A,CHARNIKHOVA T,G?MEZ-ROLD?N V,et al.Tomato strigolactones are derived from carotenoids and their biosynthesis is promoted by phosphate starvation[J].New Phytologist,2008,178(4):863-874.

    [10] VOGEL J T,WALTER M H,GIAVALISCO P,et al. SlCCD7 controls strigolactone biosynthesis, shoot branching and mycorrhiza-induced apocarotenoid formation in tomato[J].The Plant Journal,2010,61(2):300-311.

    [11] 張學(xué)坤,姚兆群,趙思峰,等.分枝(瓜)列當(dāng)在新疆的分布、危害及其風(fēng)險評估[J].植物檢疫,2012,26(6):31-33.

    [12] PASARE S A,DUCREUX L J,MORRIS W L,et al. The role of the potato (Solanum tuberosum) CCD8 gene in stolon and tuber development[J].New Phytol,2013,198(4):1108-1120.

    [13] GOMEZ-ROLDAN V,F(xiàn)ERMAS S,BREWER P B,et al.Strigolactone inhibition of shoot branching[J].Nature,2008,455:189-194.

    [14] WATERHOUSE P M,HELLIWELL C A.Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing[J].Nature Reviews Genetics,2003,4(1):29-38.

    猜你喜歡
    內(nèi)酯串聯(lián)克隆
    用提問來串聯(lián)吧
    用提問來串聯(lián)吧
    克隆狼
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    穿心蓮內(nèi)酯滴丸
    穿心蓮內(nèi)酯固體分散體的制備
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:27
    審批由“串聯(lián)”改“并聯(lián)”好在哪里?
    我曾經(jīng)去北京串聯(lián)
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    蒙藥如達七味散中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測定
    黄频高清免费视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产成人精品在线电影| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久狼人影院| 桃花免费在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩有码中文字幕| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 婷婷丁香在线五月| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久久久精品吃奶| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 国产视频一区二区在线看| 日韩大码丰满熟妇| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产视频一区二区在线看| 妹子高潮喷水视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品在线美女| 成人手机av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费不卡黄色视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品免费大片| 亚洲精品一二三| av国产精品久久久久影院| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲 国产 在线| 天天操日日干夜夜撸| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 午夜福利,免费看| 99精品在免费线老司机午夜| 香蕉久久夜色| 51午夜福利影视在线观看| 精品福利观看| 日本av免费视频播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 狂野欧美激情性xxxx| 精品人妻在线不人妻| 国产一区二区 视频在线| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产亚洲精品第一综合不卡| av网站在线播放免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 窝窝影院91人妻| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 多毛熟女@视频| 亚洲精品美女久久av网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级黄色大片毛片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲少妇的诱惑av| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 色综合婷婷激情| 老鸭窝网址在线观看| 飞空精品影院首页| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 日韩欧美免费精品| 午夜两性在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 国产亚洲欧美在线一区二区| 岛国在线观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 在线观看一区二区三区激情| 精品第一国产精品| 99国产综合亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 女人精品久久久久毛片| 国产不卡av网站在线观看| 精品高清国产在线一区| cao死你这个sao货| 久久久久久久大尺度免费视频| 少妇的丰满在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费不卡黄色视频| 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 999精品在线视频| 成年版毛片免费区| 国产精品久久久久久精品古装| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产成人影院久久av| tube8黄色片| 99精品在免费线老司机午夜| 电影成人av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 中文字幕av电影在线播放| 色综合婷婷激情| 少妇精品久久久久久久| 国产日韩欧美视频二区| 国产亚洲精品一区二区www | 人妻久久中文字幕网| 高清在线国产一区| 男女下面插进去视频免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜免费鲁丝| 国产成人影院久久av| av欧美777| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av在线播放免费不卡| 一本综合久久免费| 99久久国产精品久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美黄色淫秽网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美成人午夜精品| 老司机福利观看| 国产精品av久久久久免费| 12—13女人毛片做爰片一| www.熟女人妻精品国产| 国产成人精品久久二区二区91| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品电影一区二区三区 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 新久久久久国产一级毛片| 黄色怎么调成土黄色| 十八禁人妻一区二区| 国产淫语在线视频| 超碰成人久久| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品.久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 我的亚洲天堂| 亚洲人成电影观看| 国产av一区二区精品久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲中文av在线| 中文字幕制服av| 99精品在免费线老司机午夜| 日本av免费视频播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 一二三四在线观看免费中文在| 大片电影免费在线观看免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 丁香欧美五月| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产免费现黄频在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女福利国产在线| 99久久国产精品久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久久精品免费免费高清| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人三级做爰电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产在线观看jvid| 五月天丁香电影| 亚洲欧洲日产国产| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一区福利在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲成国产人片在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 成人国产av品久久久| 在线观看免费午夜福利视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲av第一区精品v没综合| 男女无遮挡免费网站观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 正在播放国产对白刺激| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av美国av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 又黄又粗又硬又大视频| 12—13女人毛片做爰片一| 乱人伦中国视频| 国产男靠女视频免费网站| 丁香欧美五月| av欧美777| 久久中文看片网| 亚洲少妇的诱惑av| 9热在线视频观看99| 青青草视频在线视频观看| 热99re8久久精品国产| 黄频高清免费视频| 另类亚洲欧美激情| 999久久久精品免费观看国产| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品国产乱码久久久久久男人| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久免费观看电影| 久久热在线av| 在线观看www视频免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | av网站免费在线观看视频| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美激情在线| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av日韩在线播放| 久久久精品94久久精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成年人黄色毛片网站| av国产精品久久久久影院| 久久国产精品影院| 99re在线观看精品视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av国产av综合av卡| av一本久久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人系列免费观看| 亚洲黑人精品在线| 精品欧美一区二区三区在线| av免费在线观看网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品久久午夜乱码| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 在线天堂中文资源库| 视频区图区小说| 一区二区三区乱码不卡18| 少妇精品久久久久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 五月开心婷婷网| 99热网站在线观看| 一本综合久久免费| 人妻 亚洲 视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久狼人影院| 亚洲av日韩在线播放| 人妻久久中文字幕网| 亚洲成人免费电影在线观看| 天堂动漫精品| 极品人妻少妇av视频| 无限看片的www在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品电影一区二区三区 | 蜜桃国产av成人99| 一二三四社区在线视频社区8| 女人精品久久久久毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人澡人人看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 在线永久观看黄色视频| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国精品久久久久久国模美| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品自拍成人| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久久人人人人人| 黑丝袜美女国产一区| 免费不卡黄色视频| 欧美日韩精品网址| 国产免费av片在线观看野外av| 天天操日日干夜夜撸| av一本久久久久| 少妇粗大呻吟视频| 日本黄色日本黄色录像| 美女主播在线视频| xxxhd国产人妻xxx| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久视频综合| 超碰成人久久| 久久久欧美国产精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 五月天丁香电影| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品 欧美亚洲| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品一区二区三卡| 久久人妻熟女aⅴ| 正在播放国产对白刺激| 中文字幕制服av| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品 国内视频| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品久久久久久电影网| 五月天丁香电影| 亚洲熟妇熟女久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 免费在线观看日本一区| 涩涩av久久男人的天堂| 夜夜爽天天搞| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲伊人色综图| 夜夜爽天天搞| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 丁香六月天网| 欧美人与性动交α欧美软件| 99re在线观看精品视频| 宅男免费午夜| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 十八禁网站网址无遮挡| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产不卡av网站在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 午夜福利乱码中文字幕| 成人18禁在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 操美女的视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 三级毛片av免费| 美女视频免费永久观看网站| 久久香蕉激情| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精品成人在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 两性夫妻黄色片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久性视频一级片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中国美女看黄片| 水蜜桃什么品种好| 在线看a的网站| 国产精品久久久久成人av| 国产有黄有色有爽视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 无限看片的www在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一本综合久久免费| 亚洲七黄色美女视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产单亲对白刺激| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲视频免费观看视频| 欧美中文综合在线视频| 考比视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品.久久久| 99国产精品99久久久久| 久久中文字幕人妻熟女| www日本在线高清视频| 久久中文字幕一级| 丝袜美足系列| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲专区字幕在线| 狠狠狠狠99中文字幕| av不卡在线播放| 满18在线观看网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美日韩另类电影网站| a在线观看视频网站| 国产日韩欧美视频二区| 免费观看a级毛片全部| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女主播在线视频| 老熟女久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 一个人免费看片子| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品乱码久久久久久99久播| 99精品在免费线老司机午夜| 久久国产精品大桥未久av| 精品少妇内射三级| 丝袜美腿诱惑在线| 五月天丁香电影| 电影成人av| 麻豆成人av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲久久久国产精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 成年人免费黄色播放视频| 窝窝影院91人妻| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产欧美网| 99国产综合亚洲精品| 99国产精品一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 水蜜桃什么品种好| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 91麻豆av在线| 宅男免费午夜| 国产1区2区3区精品| 国产av精品麻豆| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久午夜综合久久蜜桃| 大香蕉久久网| 一本大道久久a久久精品| 又大又爽又粗| 午夜视频精品福利| 日韩大片免费观看网站| 午夜福利乱码中文字幕| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩三级视频一区二区三区| 一本久久精品| 一级片免费观看大全| 女同久久另类99精品国产91| netflix在线观看网站| 国产精品二区激情视频| 午夜福利视频精品| 91av网站免费观看| 麻豆成人av在线观看| 免费观看a级毛片全部| 国产精品影院久久| 亚洲avbb在线观看| 99国产精品免费福利视频| 亚洲成人手机| cao死你这个sao货| 丰满饥渴人妻一区二区三| 99热国产这里只有精品6| 91成人精品电影| 老司机福利观看| kizo精华| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲,欧美精品.| 中文字幕高清在线视频| 欧美在线一区亚洲| 在线观看www视频免费| 一区二区av电影网| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美久久黑人一区二区| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲伊人色综图| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 人妻一区二区av| 亚洲国产欧美网| 欧美在线一区亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费看十八禁软件| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产成人欧美在线观看 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | videos熟女内射| 可以免费在线观看a视频的电影网站| av视频免费观看在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 51午夜福利影视在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 久久这里只有精品19| avwww免费| 色视频在线一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 久热爱精品视频在线9| 一区在线观看完整版| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产一区二区 视频在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 9热在线视频观看99| 久9热在线精品视频| 国产成人系列免费观看| 欧美久久黑人一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜老司机福利片| avwww免费| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日本a在线网址| 丰满饥渴人妻一区二区三| 99热网站在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久国产一区二区| 日韩欧美三级三区| 一本综合久久免费| 久久久久国内视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 免费av中文字幕在线| 女性生殖器流出的白浆| 水蜜桃什么品种好| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 考比视频在线观看| 亚洲国产欧美网| 中国美女看黄片| av线在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 麻豆成人av在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 1024香蕉在线观看| 精品国产国语对白av| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲 国产 在线| 国产精品免费大片| videosex国产| 水蜜桃什么品种好| 精品一区二区三区四区五区乱码| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 制服人妻中文乱码| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜激情av网站| 99久久国产精品久久久| 在线永久观看黄色视频| 丰满少妇做爰视频| 国产精品偷伦视频观看了| 新久久久久国产一级毛片| 久久热在线av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲精品国产区一区二| 精品久久蜜臀av无| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 免费在线观看黄色视频的| 国产主播在线观看一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产成人影院久久av| 色在线成人网| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕制服av| 国产男女内射视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩精品网址| 精品久久久久久电影网| 欧美黄色片欧美黄色片| 老司机深夜福利视频在线观看| 久9热在线精品视频| 午夜福利乱码中文字幕| 黑人操中国人逼视频| 超色免费av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99精品在免费线老司机午夜| 最近最新中文字幕大全免费视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 真人做人爱边吃奶动态| 天天操日日干夜夜撸| 国产在线一区二区三区精| 精品第一国产精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 自线自在国产av| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美乱妇无乱码| 999久久久国产精品视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 麻豆乱淫一区二区| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品二区激情视频| 精品福利观看| 亚洲免费av在线视频| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产成人影院久久av| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日韩视频在线欧美| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 新久久久久国产一级毛片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中国美女看黄片| 精品人妻1区二区| 夫妻午夜视频| 亚洲精品粉嫩美女一区|