巴西橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的克隆和表達(dá)分析

肖小虎 隋金蕾 戚繼艷 陽江華 秦云霞 唐朝榮

摘 要 以擬南芥和楊樹的鈣調(diào)蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到7個(gè)橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的cDNA序列，命名為HbCaM1-7。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbCaM1-7的CDS序列均為450 bp，編碼149個(gè)氨基酸，分子量為16.8 ku，等電點(diǎn)為3.95。其中，HbCaM1-6間氨基酸同源性為100%，HbCaM7與其他成員之間的氨基酸同源性為98%。在基因結(jié)構(gòu)組織方面，HbCaM1-7均為一個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子的插入位置相同，但內(nèi)含子的長度明顯不同。從氨基酸序列同源性和進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果可看出，鈣調(diào)蛋白基因家族在進(jìn)化上非常保守。在表達(dá)方面，HbCaM1-6在各組織中均有表達(dá)，除了HbCaM3在根中表達(dá)豐度相對較高，其他成員均在膠乳中表達(dá)豐度相對較高，而HbCaM7在各組織中的表達(dá)均比較低；乙烯利處理后，HbCaM2-7的表達(dá)均有一定的上升趨勢，而在葉片發(fā)育過程中HbCaM1-5圴呈明顯下調(diào)表達(dá)。由此可見，橡膠樹鈣調(diào)蛋白與橡膠樹葉片發(fā)育、膠乳乙烯信號(hào)通路具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；鈣調(diào)蛋白 ；基因克隆 ；基因家族 ；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.009

在植物生長發(fā)育的過程中，鈣離子作為第二信使扮演著至關(guān)重要的角色。鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）是一類存在于動(dòng)植物真核細(xì)胞內(nèi)和鈣離子相結(jié)合的小分子蛋白[1]，也是生物細(xì)胞內(nèi)功能和分布最廣泛的高度保守的蛋白之一[2]。鈣調(diào)蛋白有4個(gè)Ca+結(jié)合域，多數(shù)CaM氨基酸序列的長度為148個(gè)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，使鈣調(diào)蛋白的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，因而改變了其構(gòu)象，并促進(jìn)其與細(xì)胞內(nèi)靶酶的結(jié)合，由此改變細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)。由于鈣調(diào)蛋白重要的調(diào)控功能引起了人們的重視，鈣調(diào)蛋白基因在動(dòng)物[3-4]、真菌[5]和原生動(dòng)物[6]中都已被分離和克隆。在植物界，迄今為止已成功克隆了擬南芥[7]、水稻[8]、大麥[9]、苜蓿[10]、香蕉[11]等物種的鈣調(diào)蛋白基因，并對其進(jìn)化和表達(dá)進(jìn)行了分析。在橡膠樹中，僅有陳鑫等[12]利用RACE克隆了一個(gè)鈣調(diào)蛋白基因HbCAM1，并利用RT-PCR技術(shù)對該基因在不同組織和乙烯利處理膠乳中的表達(dá)進(jìn)行了初步分析。隨著橡膠樹基因組測序的完成，使人們能夠?qū)φ麄€(gè)橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因家族進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。本研究從橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫中搜索并克隆得到7個(gè)鈣調(diào)蛋白基因，并從基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式幾方面對這些家族成員進(jìn)行了全面系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果將有助于深入了解鈣調(diào)蛋白基因家族成員在橡膠樹生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答調(diào)控方面的重要功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)室Solexa測序所用的材料是巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）熱研7-33-97，其中膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花均來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)的正常割膠橡膠樹（開割2 a以上），根來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華于偉老師贈(zèng)送的熱研7-33-9 組培苗；不同發(fā)育時(shí)期的橡膠樹葉片來自于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃，為一年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料來自于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場三隊(duì)，品系為熱研7-33-97，正常開割樹（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時(shí)間處理橡膠樹，相應(yīng)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理為0、3、12和24 h。

1.1.2 菌株與試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fementas公司；pMD18-T載體和Taq DNA聚合酶均購自Takara公司；引物合成和測序由華大生物技術(shù)有限公司完成；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；其它生化試劑和常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 不同組織RNA的提取與cDNA合成

橡膠樹膠乳RNA的提取參照Tang等[13]的方法；除膠乳以外其他組織的RNA提取方法參照Kiefer等[14]的方法；cDNA第一條鏈的合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，操作步驟按照Fementas公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.2.2 cDNA全長和基因組序列的克隆

利用擬南芥和楊樹的鈣調(diào)蛋白氨基酸序列，通過本地BLAST搜索本實(shí)驗(yàn)室EST數(shù)據(jù)庫，得到7個(gè)鈣調(diào)蛋白基因的cDNA片段。然后設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），具體反應(yīng)體系如下：模板（膠乳cDNA）0.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、Taq plus DNA Polymerase（5 U/L） 0.3 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1.6 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 13.6 μL，共20 μL體系。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，并連接到pMD18-T載體上，最后送公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線軟件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進(jìn)行ORF閱讀框預(yù)測，利用生物軟件DNAMAN對橡膠樹和擬南芥的CaM氨基酸序列進(jìn)行多序列比對。利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析鈣調(diào)蛋白基因的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，并進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.4 基因的表達(dá)模式分析

利用高通量測序數(shù)據(jù)[15]（Solexa轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)）對橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。具體分析流程包括：對原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進(jìn)行表達(dá)分析[16]和數(shù)據(jù)處理作圖3個(gè)部分，其中前2步在本地服務(wù)器完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的克隆與序列分析

本研究以擬南芥和楊樹鈣調(diào)蛋白氨基酸序列為探針，利用tblastn搜索本實(shí)驗(yàn)室的EST數(shù)據(jù)庫，分離并克隆得到了7個(gè)橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的cDNA序列，命名為HbCaM1-7（對應(yīng)序列的NCBI登陸號(hào)為：HbCaM1，AJJZ010938311.1；HbCaM2，AJJZ010269732.1；HbCaM3，AJJZ010929368.1；HbCaM4，AJJZ010665409.1；HbCaM5，AJJZ010127638.1；HbCaM6，AJJZ010231096.1；HbCaM7，AJJZ010372997.1）。通過NCBI在線軟件CDD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7個(gè)基因均具有鈣調(diào)蛋白基因所特有的保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。經(jīng)序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbCaM1-7的CDS序列均為450 bp，編碼149個(gè)氨基酸，分子量為16.8 ku，等電點(diǎn)為3.95。其中，HbCaM1-6之間氨基酸同源性為100%，HbCaM7與其他成員之間的氨基酸同源性為98%，各成員之間CDS序列同源性為80.4%～96.4%。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

利用在線軟件GSDS 2.0，對橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各家族成員在內(nèi)含子數(shù)目和相對位置都非常一致，而內(nèi)含子的長度卻存在一定的差異。為了比較橡膠樹和其他植物鈣調(diào)蛋白在進(jìn)化上的相互關(guān)系，選取了楊樹（Populus trichocarpa， Pt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、水稻（Oryza sativa，Os）、蓖麻（Ricicus communis，Rc）及7條橡膠樹（Hevea brasiliensis，Hb）鈣調(diào)蛋白氨基酸序列，利用軟件MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)（圖3）。從圖3中可看出，很多家族成員聚在一條直線上，說明這些成員之間的親緣關(guān)系比較近，這和植物鈣調(diào)蛋白氨基酸序列的高度保守性是一致的，例如橡膠樹中HbCaM1-6雖然核苷酸序列存在差異，但氨基酸序列卻是完全一致的，類似的還有擬南芥中AtCaM2-5、楊樹中的PtCaM2-4等。植物鈣調(diào)蛋白在進(jìn)化上的保守性也說明其在功能上的重要性。

2.3 橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因家族成員的表達(dá)分析

利用本實(shí)驗(yàn)室Solexa高通量測序數(shù)據(jù)對7個(gè)橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況進(jìn)行分析。其中不同組織包括膠乳、樹皮、樹葉、根、種子、雌花和雄花。結(jié)果表明，雖然7個(gè)家族成員在序列上具有較高的同源性，但在表達(dá)方面卻存在著一定的差異（圖4）。各家族成員在所檢測的各組織中普遍表達(dá)，除了HbCaM3在種子中表達(dá)豐度最高，其他成員均是在膠乳中表達(dá)豐度最高，而HbCaM7在各組織中的表達(dá)豐度都很低，這說明橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因在膠乳信號(hào)傳導(dǎo)方面可能發(fā)揮著重要作用。

乙烯刺激對橡膠樹膠乳中基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，乙烯利刺激3 h后，橡膠樹鈣調(diào)蛋白各家族成員的表達(dá)均有一定的上升趨勢，其中HbCaM4和HbCaM6的變化趨勢相對更加明顯。據(jù)此推測，橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因參與了橡膠樹膠乳乙烯信號(hào)應(yīng)答相關(guān)通路。橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因家族成員在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)情況見圖 6，除了HbCaM7基因外，其他各成員在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)均呈下降趨勢，在穩(wěn)定期的表達(dá)明顯低于其他各時(shí)期。這說明橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因可能參與了橡膠樹葉片生長發(fā)育相關(guān)的調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

鈣調(diào)蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育和參與植物逆境脅迫應(yīng)答等方面具有重要作用。通過對擬南芥鈣調(diào)蛋白基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，不同家族成員在擬南芥生長發(fā)育的不同階段具有不同的表達(dá)豐度，一葉期AtCAM4表達(dá)豐度最高，二葉期AtCAM2表達(dá)豐度最高，而到四葉期AtCAM1、AtCAM4、AtCAM5和AtCAM7具有較高的表達(dá)豐度[17]。在脅迫應(yīng)答方面，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥大部分鈣調(diào)蛋白基因家族成員都參與了脅迫和激素刺激相關(guān)應(yīng)答反應(yīng)[18]。程曉培等[19]對逆境脅迫下MaCAM的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaCAM明顯鹽脅迫、干旱和低溫誘導(dǎo)。在水稻中，通過分析基因家族成員在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各家族成員在葉片和花中的表達(dá)明顯高于根和種子等其他組織[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了HbCaM3在種子中表達(dá)豐度最高，其他各成員均在膠乳中表達(dá)豐度最高，并且在乙烯利刺激后大部分成員的表達(dá)都有一定的上升趨勢，這說明橡膠樹鈣調(diào)蛋白參與了橡膠樹乳管逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)信號(hào)通路。另外，通過研究橡膠樹鈣調(diào)蛋白各家族成員在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有成員在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)均呈下降趨勢，在穩(wěn)定期葉片中的表達(dá)最低，這說明鈣調(diào)蛋白參與橡膠樹葉片生長發(fā)育相關(guān)的信號(hào)調(diào)控，并且更多在代謝較活躍的組織中表達(dá)。本研究從基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式幾方面對橡膠樹鈣調(diào)蛋白各家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果將有助于深入了解鈣調(diào)蛋白基因家族成員在橡膠樹生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答等方面的重要功能。

參考文獻(xiàn)

[1] Cheung W Y. Cyclic 3′，5′-nucleotide phosphodiesterase： Pronounced stimulation by snake venom[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，1967， 29（4）： 478-482.

[2] Defalco T A， David C， Kim M， et al. Characterization of GmCaMK1， a member of a soybean calmodulin-binding receptor-like kinase family[J]. Febs Letters， 2010， 584（23）： 4 717-4 724.

[3] Watterson D M， Sharief F， Vanaman T C. The complete amino acid sequence of the Ca2+-dependent modulator protein（calmodulin）of bovine brain[J]. Journal of Biological Chemistry， 1980， 255（3）：962-975.

[4] Floyd E E， Gong Z Y， Brandhorst B P， et al. Calmodulin gene expression during sea urchin development：persistence of a prevalent maternal protein[J]. Developmental Biology， 1986， 113（2）： 501-511.

[5] Davis T N， Urdea M S， Masiarz F R， et al. Isolation of the yeast calmodulin gene： Calmodulin is an essential protein[J]. Cell， 1986， 47（3）： 423-431.

[6] Tschudi C， Young A S， Ruben L， et al. Calmodulin genes in trypanosomes are tandemly repeated and produce multiple mRNAs with a common 5'leader sequence[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1985， 82（12）： 3 998-4 002.

[7] Mccormack E， Braam J. Calmodulins and related potential calcium sensors of Arabidopsis[J]. New Phytologist， 2003， 159（3）： 585-598.

[8] Boonburapong B， Buaboocha T. Genome-wide identification and analyses of the rice calmodulin and related potential calcium sensor proteins[J]. Bmc Plant Biology， 2007， 7（1）： 1-17.

[9] Ling V， Zielinski R E. Cloning of cDNA sequences encoding the calcium-binding protein， calmodulin， from barley（Hordeum vulgare L.）[J]. Plant Physiology， 1989， 90（2）： 714-719.

[10] Barnett M J， Long S R. Nucleotide sequence of an alfalfa calmodulin cDNA[J]. Nucleic Acids Research， 1990， 18（18）： 3 395.

[11] 龔潔敏，金志強(qiáng)，孔德騫，等. 香蕉鈣調(diào)蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1994，15（1）：65-71.

[12] 陳 鑫，朱家紅，張治禮. 巴西橡膠樹鈣調(diào)蛋白基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（22）：46-50.

[13] Tang C R， Qi J Y ， Li H P， et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. J Biochem Biophys Methods， 2007， 70（5）： 749-754.

[14] Kiefer E， Heller W， Ernst D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J]. Plant Mol Biol Rep， 2000， 18（1）： 33-39.

[15] 肖小虎. 巴西橡膠樹蔗糖代謝相關(guān)基因家族的克隆、結(jié)構(gòu)進(jìn)化和表達(dá)分析[D]. 海口：海南大學(xué)， 2013.

[16] Li B， Dewey C N， Li B， Dewey C N. RSEM：accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome [J]. BMC Bioinformatics， 2011， 12（1）：93-99.

[17] McCormack E， Tsai Y C， Braam J. Handling calcium signaling：Arabidopsis CaMs and CMLs[J]. Trends inPlant Science， 2005， 10（8）： 383-389.

[18] McCormack E， Braam J. Calmodulins and related potential calcium sensors of Arabidopsis[J]. New Phytologist， 2003， 159（3）： 585-598.

[19] 程曉培，徐碧玉，劉菊華，等. 香蕉鈣調(diào)蛋白基因MaCAM在非生物脅迫下的表達(dá)分析[J]. 生命科學(xué)研究，2013，17（1）：20-23.

[20] Boonburapong B， Buaboocha T. Genome-wide identification and analyses of the rice calmodulin and related potential calcium sensor proteins[J]. BMC Plant Biology， 2007， 7（1）： 1-17.