殺松材線蟲(chóng)海洋細(xì)菌HT11的鑒定及培養(yǎng)條件研究

陳聰聰 郭群群 王超等

摘要[目的] 從海洋中分離并篩選具有殺松材線蟲(chóng)活性的細(xì)菌。[方法] 采用稀釋涂布平板法對(duì)采自青島近海海域的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，采用浸漬法測(cè)定菌株的殺線蟲(chóng)活性，并對(duì)篩選菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的最適培養(yǎng)條件。[結(jié)果] 共分離到36株海洋細(xì)菌，根據(jù)殺線蟲(chóng)活性篩選出1株具有高殺線蟲(chóng)活性的細(xì)菌HT11。該菌株分離自牡蠣，其培養(yǎng)濾液處理松材線蟲(chóng)24 h的校正死亡率高達(dá)92.41%。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株HT11鑒定為考克氏菌屬（Kocuria）。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基中產(chǎn)生殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的最適培養(yǎng)條件為：海水濃度100%，初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間3 d。[結(jié)論] 該研究可為海洋微生物資源的開(kāi)發(fā)及其殺松材線蟲(chóng)天然活性物質(zhì)的利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞海洋細(xì)菌；殺線蟲(chóng)活性；松材線蟲(chóng)；鑒定；培養(yǎng)條件

中圖分類(lèi)號(hào)S767.3+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-024-05

Identification and Culture Conditions of Marine Bacterium HT11 with Nematicidal Activity against Bursaphelenchus xylophilus

CHEN Congcong，GUO Qunqun，WANG Chao，GUO Daosen* et al （College of Life Sciences，Qingdao University，Qingdao，Shandong 266071）

Abstract [Objective] To isolate and screen the marine bacteria with nematicidal activity against Bursaphelenchus xylophilus from the sea.[Method] The marine bacterial strains were isolated from the samples collected from the subtidal zones near Qingdao coast using the dilution and streak plate method； nematicidal activity of strains were detected by immersion method.The morphology，physiological and biochemical characters，and 16S rDNA sequence of the screened strains were also detected.The optimal cultivation conditions to produce nematicidal activity substances were detected by single factor test.[Result] A total of 36 marine bacterial strains were isolated from the samples.One of these strains HT11 had high nematicidal activity，which was isolated from oyster.Its corrected mortality reached as high as 92.41% after treated with the culture filtrate for 24 h .According to the results of morphology，physiological and biochemical characters，16S rDNA sequence and phylogenetic analysis，strain HT11 was classified into the genus of Kocuria.Results of single factor experiment indicated that the optimal cultivation conditions of HT11 for the production of nematicidal substances were 100% seawater concentration，initial pH 7， 25 ℃ cultivation temperature，and 3 d cultivation time.[Conclusion] This research provides theoretical foundation for the development of marine microorganism resources and the utilization of natural nematicidal substances.

Key wordsMarine bacteria； Nematicidal activity； Bursaphelenchus xylophilus； Identification； Culture conditions

松樹(shù)萎蔫?。≒ine wilt disease，PWD）是松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus）入侵松屬植物后引起寄主萎蔫并快速枯死的一種毀滅性疾病[1]，傳播媒介為松墨天牛（Monochamus alternatus）。該病在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)環(huán)境的破壞，在東亞尤其是日本、中國(guó)、韓國(guó)[2]以及西歐的葡萄牙[3]和西班牙[4]損失較為嚴(yán)重。我國(guó)于1982年首次在江蘇省南京市發(fā)現(xiàn)該病，截至2011年已擴(kuò)散至全國(guó)14個(gè)?。ㄊ校?，且呈擴(kuò)大趨勢(shì)，隨著國(guó)際貿(mào)易的往來(lái)，該病傳播擴(kuò)散的速度也在不斷加快，因此松樹(shù)萎蔫病已經(jīng)引起許多國(guó)家的高度重視[5]。在控制該疾病方面，一般采用物理方法和化學(xué)方法，例如對(duì)患有松樹(shù)萎蔫病的松樹(shù)進(jìn)行砍伐和用煙熏蒸來(lái)控制昆蟲(chóng)媒介[6]，向染病區(qū)域噴施噻蟲(chóng)啉等殺蟲(chóng)藥劑[7]，對(duì)樹(shù)干注射合成農(nóng)藥（阿維菌素或甲維鹽）[7]或者在疫區(qū)周?chē)鷾p少松林的種植等，而這些方法中最有效的是化學(xué)農(nóng)藥防治方法。然而，化學(xué)農(nóng)藥具有高毒、高殘留的特點(diǎn)，可對(duì)空氣、水體和土壤環(huán)境造成污染，間接對(duì)人類(lèi)造成危害[8]，因此化學(xué)藥劑的應(yīng)用正在逐步受到限制。目前，從自然界中尋找對(duì)松材線蟲(chóng)具有高致死性的微生物及其代謝產(chǎn)物已成為研發(fā)新型殺線蟲(chóng)劑的研究熱點(diǎn)之一。這些微生物大多數(shù)是來(lái)自陸生環(huán)境的捕食性真菌、內(nèi)寄生真菌、產(chǎn)毒真菌、殺線蟲(chóng)細(xì)菌和殺線蟲(chóng)放線菌等[9-10]。由于海洋存有高壓、高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)、低溫等特殊生境，促使海洋微生物在進(jìn)化過(guò)程中具備與陸地微生物不同的特殊代謝途徑，從而可能會(huì)出現(xiàn)種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)新穎、生物活性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物。近年來(lái)，具有殺線蟲(chóng)活性的海洋微生物已有報(bào)道。鄭海營(yíng)等[10]從沙蟹體內(nèi)分離出2株具有高殺松材線蟲(chóng)活性的巨大芽孢桿菌（Bacillius megaterium）。于潔等[11]從菲律賓蛤仔消化道內(nèi)分離出1株產(chǎn)黑假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens），其培養(yǎng)濾液處理松材線蟲(chóng)24 h校正死亡率為82%。Yu等[12]研究了1株分離自海水的海假交替單胞菌（Pseudoalteromonas marina）和1株分離自海灣扇貝的Vibrio atlanticus的殺線蟲(chóng)活性，發(fā)現(xiàn)這2株細(xì)菌培養(yǎng)液中的揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)松材線蟲(chóng)有很強(qiáng)的殺滅作用。徐中強(qiáng)等[13]從青島附近海域中分離到1株具有強(qiáng)殺線蟲(chóng)活性的輪枝孢屬（Verticillium）真菌，該菌菌絲的破碎濾液處理松材線蟲(chóng)28 h校正殺死率為84.1%。李子等[14]從青島附近海域分離的35株真菌中篩選到1株青霉屬（Penicillium）菌株ML5，用其發(fā)酵液處理松材線蟲(chóng)72 h的校正死亡率為86.51%。筆者對(duì)分離自青島近海海域樣品中的海洋細(xì)菌進(jìn)行了殺松材線蟲(chóng)活性菌株的篩選和鑒定，并對(duì)高殺線蟲(chóng)活性菌株產(chǎn)殺線活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件也進(jìn)行了探索，旨在為海洋微生物資源的開(kāi)發(fā)和殺松材線蟲(chóng)天然活性產(chǎn)物的利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品的來(lái)源與供試線蟲(chóng)的培養(yǎng)海泥、海沙、海洋動(dòng)物等樣品在海水落潮時(shí)從第一海水浴場(chǎng)、麥島、薛家島、石老人、流清河灣等青島近海海域采集。供試線蟲(chóng)為無(wú)菌松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus xylophilus），由青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，無(wú)菌線蟲(chóng)的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[15]的方法。

1.2海洋細(xì)菌的分離培養(yǎng)基選用全海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）（蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂粉15.0 g、陳海水1 000 mL，pH（7.3±0.1），121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min）培養(yǎng)基。海泥、海沙樣品細(xì)菌的分離采用稀釋平板涂布法[16]。首先取10 g樣品置于90 mL無(wú)菌海水在振蕩器中振蕩25 min，靜置后對(duì)懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)蝗缓?，取各梯度稀釋?00 μL涂布于培養(yǎng)基上。海洋動(dòng)物樣品先用無(wú)菌海水沖洗體表，然后用酒精棉球擦拭消毒，用解剖工具取出消化道內(nèi)容物約1 g，置于9 mL無(wú)菌海水中充分混勻，進(jìn)行稀釋平板涂布法分離。將涂布的平板于28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)樣品和菌落形態(tài)的不同，挑取具有代表性的菌落進(jìn)行純化，將純化好的菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3殺線蟲(chóng)活性菌株的篩選將純化好的待測(cè)菌株進(jìn)行活化，接種于裝有25 mL全海水營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）液體培養(yǎng)基的100 mL三角燒瓶中，于25 ℃、185 r/min振蕩培養(yǎng)3 d；然后，取1 mL培養(yǎng)液于EP管中，12 000 r/min離心10 min；最后，取上清液，用0.45 μm孔徑的微孔濾膜對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾，即得到菌株的培養(yǎng)濾液。采用浸漬法[17]對(duì)菌株的培養(yǎng)濾液進(jìn)行殺線蟲(chóng)活性的測(cè)定。取約2 mL無(wú)菌水將三角燒瓶瓶壁上的線蟲(chóng)沖洗下來(lái)，用無(wú)菌水配制成2 000條/mL的線蟲(chóng)懸液。分別取培養(yǎng)濾液450 μL和線蟲(chóng)懸液50 μL，加至已殺菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中混勻，以無(wú)菌水和不接菌的培養(yǎng)基濾液分別作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每6 h在體視顯微鏡下觀察線蟲(chóng)的存活情況，線蟲(chóng)的死亡標(biāo)準(zhǔn)為蟲(chóng)體僵直，當(dāng)重新轉(zhuǎn)移到無(wú)菌水中時(shí)用解剖針刺激無(wú)反應(yīng)[18]。處理24 h后，按照以下公式計(jì)算線蟲(chóng)校正死亡率：CM（%）=（d-c）/（1-c）×100。式中，CM為校正死亡率（%）；c為對(duì)照組死亡率（%）；d為處理組死亡率（%）。

1.4菌株HT11的鑒定

1.4.1形態(tài)特征及生理生化特性測(cè)定。將菌株接種于全海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基平板上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、顏色等培養(yǎng)特征，對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察，并對(duì)菌體的大小進(jìn)行測(cè)量。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]的方法對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定。

1.4.216S rDNA序列分析。從菌體中提取基因組DNA，以提取的DNA為模板，采用通用引物（上游引物：5′GCGCAAGCTTAGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；下游引物：5′GCGCTCTAGATACGGTYACCTTGTTACGACTT3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。純化后的16S rDNA片段克隆于pClone EZ cloning vector載體，由上海生工公司完成測(cè)序。經(jīng)測(cè)序后，利用NCBI網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，篩選出同源性較高的16S rDNA的基因序列作為參比對(duì)象，對(duì)克隆片段進(jìn)行序列分析，使用Clustal X 1.83軟件和MEGA 5.1軟件對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)和編輯后，采用Neighbor-joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20]。

1.5不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株HT11殺線蟲(chóng)活性的影響將菌株活化24 h，接種于裝有30 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）液體培養(yǎng)基的100 mL三角燒瓶中。采用單因素試驗(yàn)研究培養(yǎng)基中海水濃度（0、200、400、600、800、1 000 mL/L）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培養(yǎng)溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）和培養(yǎng)時(shí)間（1、3、5、7、9、11 d）對(duì)菌株HT11的培養(yǎng)濾液殺線蟲(chóng)活性的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1殺線蟲(chóng)海洋細(xì)菌的分離和篩選對(duì)采集的樣品中進(jìn)行細(xì)菌分離后，共得到36株海洋細(xì)菌，經(jīng)過(guò)殺線蟲(chóng)活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其中線蟲(chóng)的校正死亡率大于50%的菌株有7株（表1），占總數(shù)的19.44%。其中，從麥島附近海域采集到的牡蠣消化道中分離到的菌株HT11的培養(yǎng)濾液殺線蟲(chóng)活性最強(qiáng)，處理松材線蟲(chóng)24 h后線蟲(chóng)的校正死亡率達(dá)到92.41%，松材線蟲(chóng)的死亡狀態(tài)如圖1所示。因此，選擇菌株HT11進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2菌株HT11的鑒定

2.2.1形態(tài)特征及生理生化特性。從圖2可以看出，菌株HT11的菌落為圓形，表面黏稠，光滑，隆起，淺黃色，不透明，邊緣整齊。從圖3可以看出，細(xì)胞呈球形，直徑為0.5～1.0 μm，不運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色為陽(yáng)性。對(duì)菌株HT11進(jìn)行了15項(xiàng)生理生化測(cè)定，結(jié)果表明該菌株具有耐鹽性，能夠在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～14%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，接觸酶、氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，能還原硝酸鹽和利用檸檬酸鹽，不能水解明膠，V.P.試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、精氨酸利用試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，在糖發(fā)酵試驗(yàn)中能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖和半乳糖，不能利用麥芽糖和木糖（表2）。

2.2.216S rDNA的序列及系統(tǒng)發(fā)育分析。對(duì)菌株HT11的16S rDNA片段進(jìn)行PCR，擴(kuò)增到1條1 441 bp大小的電泳目的條帶，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對(duì)，其同源性較高的菌株均屬于考克氏菌屬（Kocuria）。選取同源性高的菌株的序列，使用Clustal X 1.83軟件和MEGA 5.1軟件，采用Neighbor-joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖4可以看出，菌株HT11與Kocuria carniphila （NR_027193）在進(jìn)化中有較高的同源性，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征和生理生化特點(diǎn)，將菌株HT11歸為考克氏菌屬（Kocuria）。

2.3培養(yǎng)條件對(duì)菌株HT11殺線蟲(chóng)活性的影響從圖5可以看出，培養(yǎng)濾液的殺線蟲(chóng)活性隨著培養(yǎng)基中海水濃度的不斷增加而增高，當(dāng)培養(yǎng)基中海水濃度為100%時(shí)校正死亡率90.93%，殺線蟲(chóng)活性最強(qiáng)。

從圖6可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.5～8.0時(shí)，線蟲(chóng)的校正死亡率均較高（70.00%以上）；當(dāng)pH為7.0時(shí)，線蟲(chóng)死亡率最高（90.50%），表明該起始pH最適合產(chǎn)生殺線活性物質(zhì)。

從圖7可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，線蟲(chóng)校正死亡率為0，表明菌株HT11在此溫度下并未生長(zhǎng)；在15～35 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，殺線蟲(chóng)活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)校正死亡率最高，為89.59%。因此，培養(yǎng)溫度25 ℃為最適宜產(chǎn)生殺線活性物質(zhì)的溫度。

從圖8可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)濾液殺線蟲(chóng)活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，3 d殺線蟲(chóng)的校正死亡率最高，達(dá)到91.37%。

3討論

自1982年在南京發(fā)現(xiàn)松樹(shù)萎蔫病以來(lái)，我國(guó)已經(jīng)有超過(guò)40萬(wàn)hm2的松林感染該病和造成5億多株松樹(shù)的死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[11]。目前，針對(duì)松樹(shù)萎蔫病主要采用化學(xué)防治的方法來(lái)治理，但是大量使用化學(xué)藥劑后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面作用。因此，研究人員逐漸將目光投向于從自然界中尋找殺線蟲(chóng)活性的天然產(chǎn)物。受制于各種條件，人們目前只能在有限的范圍內(nèi)尋找殺線蟲(chóng)活性的天然產(chǎn)物，更多地傾向于在陸地上尋找生防植物或生防微生物。Zheng等[21]從206株植物內(nèi)生細(xì)菌中篩選出1株具有較強(qiáng)殺線蟲(chóng)活性的菌株LCB-3，經(jīng)鑒定該菌株為缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta），并從該菌株的發(fā)酵濾液中分離到殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)（R）-（-）-2-ethylhexan-1-ol。Sung等[22]從韓國(guó)土壤中發(fā)現(xiàn)了松材線蟲(chóng)內(nèi)寄生真菌（Esteya vermicola）的1個(gè)新菌株，通過(guò)對(duì)松樹(shù)進(jìn)行接種發(fā)現(xiàn)該菌株生長(zhǎng)在松樹(shù)的幼樹(shù)中，隨后侵染存在于松樹(shù)中的松材線蟲(chóng)，使其能夠在4～5 d內(nèi)死亡。與陸地環(huán)境相比，海洋環(huán)境更為復(fù)雜，蘊(yùn)含著更為豐富的微生物資源。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們也更多著眼于在海洋環(huán)境下去尋找殺線蟲(chóng)活性的天然產(chǎn)物，目前從海洋中分離出產(chǎn)殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)的微生物有巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[10]、弧菌（Vibrio atlanticus）[11]、產(chǎn)黑假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）[11]、青霉菌（Penicillium sp.）[12]、輪枝孢屬菌（Verticillium sp.）[13]等，并且部分海洋微生物產(chǎn)生的殺線蟲(chóng)劑活性物質(zhì)與陸地上微生物產(chǎn)生的殺線蟲(chóng)劑活性物質(zhì)相比在結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定，在效用上更高效。筆者從采自青島沿海海域的樣品牡蠣中分離到1株具有較高殺線蟲(chóng)活性的海洋細(xì)菌HT11，其培養(yǎng)濾液處理松材線蟲(chóng)24 h后校正死亡率達(dá)92.41%，經(jīng)過(guò)對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，將該菌株歸為考克氏菌屬（Kocuria）。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中海水濃度100%、初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間3 d時(shí)，菌株HT11的殺線蟲(chóng)活性最強(qiáng)。

考克氏菌（Kocuria spp.）是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，適應(yīng)環(huán)境能力很強(qiáng)，可以從海洋沉積物、土壤、沼澤、發(fā)酵食品等多種環(huán)境中分離到。1995年該菌屬（Kocuria）以斯洛伐克微生物學(xué)家Miroslav Kocur的姓氏來(lái)命名。迄今為止，從考克氏菌屬中已經(jīng)鑒定了12個(gè)種，模式菌株為Kocuria rosea[23]。張文俊等[24] 從東海深處分離到1株產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的海洋細(xì)菌，經(jīng)過(guò)鑒定，命名為Kocuria sp.CAR-red。徐姮等[25]從深海多種微生物中篩選到1株產(chǎn)木聚糖酶的考克氏菌Kocuria sp.Mn22。Jiang等[26]從印度洋沉積物中分離出1株考克氏菌，經(jīng)鑒定為一個(gè)新種Kocuria subflava sp.nov.。由此可見(jiàn)，海洋中存在考克氏菌種類(lèi)，并且有望發(fā)現(xiàn)更多新種和新的活性天然產(chǎn)物。筆者從采自青島近海海域的牡蠣體中分離到1株考克氏菌，經(jīng)測(cè)定該菌株具有很強(qiáng)的殺松材線蟲(chóng)活性，這是有關(guān)考克氏菌具有殺松材線蟲(chóng)活性的首次報(bào)道。該試驗(yàn)結(jié)果可為發(fā)現(xiàn)新的殺線蟲(chóng)天然產(chǎn)物提供研究材料，并為海洋微生物活性物質(zhì)在殺線蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)和利用方面提供重要參考。此外，對(duì)菌株HT11殺線活性化合物的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其殺線蟲(chóng)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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