響應(yīng)面法對(duì)羅漢果花總黃酮超聲波提取工藝的優(yōu)化

張卓睿　孫廣仁　段秀巖　姜貴全

摘要：以羅漢果（Siraitia grosvenorii）花為原料，采用超聲波技術(shù)從羅漢果花中提取總黃酮，并利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化了工藝參數(shù)。通過(guò)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲波功率、超聲時(shí)間等因素進(jìn)行試驗(yàn)分析，考查了各提取參數(shù)對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了羅漢果花中總黃酮的最佳提取工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為67.55%，超聲時(shí)間43.62 min，超聲波功率208.48 W，液料比15∶1 （mL∶g），此條件下總黃酮提取率可達(dá)到6.537%。

關(guān)鍵詞：羅漢果（Siraitia grosvenorii）花；超聲波；總黃酮；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：TS209；S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1518-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.039

羅漢果花來(lái)源于葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenorii）的干燥雄花，有清熱解毒、化痰止咳、養(yǎng)聲潤(rùn)肺的功效，常用于治療口臭、口腔炎、咽炎、扁桃體炎、色斑、肝斑、暗瘡等疾病[1]。羅漢果花雖然在民間是一種常見(jiàn)的花草茶，但對(duì)于其功效成分的深入研究，直到近幾年才開始逐漸展開。研究人員發(fā)現(xiàn)，羅漢果花中的精油具有抗菌活性，尤其是對(duì)枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用[2]。另外，羅漢果花中還含大量的黃酮類化合物，經(jīng)分析主要為山奈酚[3]。黃酮類化合物是一大類天然多酚化合物，其以游離態(tài)或糖苷形式廣泛存在于植物中，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，能防治心腦血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫能力等生理活性[4，5]。黃酮的提取方法主要有超臨界萃取、熱回流提取、酶提取、微波輔助提取和超聲波輔助提取等[6，7]。其中超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的“空穴作用”破碎植物細(xì)胞，使提取液不斷振蕩，有利于黃酮類化合物的溶出和擴(kuò)散，大大提高了植物有效成分的提取率，該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需加熱，對(duì)黃酮的活性破壞少，且提取率高，是現(xiàn)在應(yīng)用非常廣泛的一種黃酮提取法。因此本研究采用超聲波輔助提取羅漢果花中總黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果得出最佳提取條件，以期為羅漢果花的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

羅漢果花，2013年7月購(gòu)于廣西桂林永?？h，烘箱中55 ℃烘4 h，粉碎機(jī)粉碎后置于試劑瓶中，室溫貯藏于干燥器中備用。無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑（均為分析純）購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司；蘆?。ㄉ噭┵?gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；WK-1000A高速藥物粉碎機(jī)，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器，上海青浦瀘西儀器廠；QUANTA200環(huán)境掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8] 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，置水浴鍋中微熱使之溶解，放冷后用60%乙醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只10 mL比色管中，各加30%乙醇溶液至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再各加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加1 mol/L的NaOH溶液4 mL，然后分別加水定容至10 mL，搖勻，放置15 min。以空白試劑為參比液，在510 nm下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行回歸，得吸光度A與總黃酮濃度x（mg/mL）的線性方程為：A=11.675x+0.033 5，R2=0.997 8，表明總黃酮濃度在0.02～0.1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈線性關(guān)系。

1.3.2 羅漢果花中總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取2.0 g羅漢果花粉置于150 mL錐形瓶中，按設(shè)定液料比加入某體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定功率條件下超聲波破碎提取一段時(shí)間，提取液以8 000 r/min離心分離10 min，上清液于100 mL容量瓶中定容。

1.3.3 樣品中總黃酮含量的測(cè)定 取1 mL定容后的提取液，按“1.3.1”的方法測(cè)定樣品的吸光度A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度，再計(jì)算出樣品中總黃酮的提取率。計(jì)算公式為：

總黃酮提取率（以蘆丁計(jì)）=■×100%

式中，D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；C為樣品溶液中總黃酮濃度，mg/mL；V1為測(cè)定時(shí)比色管中溶液體積，mL；V2為樣品溶液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 以總黃酮提取率為檢測(cè)指標(biāo)，分別考察提取方法、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、液料比（mL∶g，下同）、超聲時(shí)間5個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲波功率為試驗(yàn)因素，利用Design-expert軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9]，優(yōu)化羅漢果花中總黃酮的提取工藝。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)均做3次平行，取平均值，利用Excel程序或Design-expert軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方法對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響 分別考察了回流提取法、酶提取法、超聲波提取法3種方法對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，并將提取后的物料在室溫條件下風(fēng)干，置于載物臺(tái)上用離子濺射儀噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察其形貌變化，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。由表1可知，超聲波提取法的總黃酮提取率最高，酶提取法次之，而回流提取法的提取率最低。從圖1（a）也可以看出，經(jīng)回流提取后的物料其內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整密實(shí)，說(shuō)明大部分植物細(xì)胞未受到破壞，因而細(xì)胞內(nèi)組分亦不能充分浸出，提取率最低；而圖1（c）中超聲波提取后的物料面變得平滑松散，說(shuō)明提取過(guò)程中物料在超聲波的空化作用下，引起體系的宏觀湍動(dòng)和固體顆粒的高速碰撞，傳質(zhì)邊界層變薄，植物組織細(xì)胞發(fā)生了破壁或變形，使得細(xì)胞內(nèi)組分更易浸出，提取率最高。因此選擇超聲波提取法從羅漢果花中提取總黃酮。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響 按液料比10∶1，超聲波功率150 W，超聲時(shí)間30 min，分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2（a）所示。黃酮是一大類極性范圍很廣的化合物，既包括水溶性的，又包括醇溶性的。而不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，極性不同，對(duì)目標(biāo)組分的溶解能力亦不相同。從圖2（a）可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，羅漢果花中總黃酮的提取率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值。這說(shuō)明70%乙醇的極性與羅漢果花中黃酮類化合物的極性相似，醇溶性和水溶性的黃酮類物質(zhì)都能最大程度的溶出，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%時(shí)，水溶性黃酮溶出量減少，同時(shí)一些脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)的大量析出，又會(huì)影響醇溶性黃酮的溶出，故總黃酮提取率迅速降低。因此，確定羅漢果花中總黃酮提取較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.3 超聲波功率對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響 用70%乙醇為提取溶劑，按液料比10∶1，超聲時(shí)間30 min，分別考察不同超聲波功率對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2（b）所示。超聲波的空化現(xiàn)象可以強(qiáng)化溶質(zhì)擴(kuò)散，且對(duì)原料具有破碎作用，使得原料組織內(nèi)的化學(xué)成分能與溶劑充分接觸，進(jìn)而提高化學(xué)成分的提取效率。由圖2（b）可知，當(dāng)超聲波功率小于200 W時(shí)，總黃酮提取率隨著功率的增加而增大，且在超聲波功率為200 W時(shí)達(dá)到峰值，但200 W以后，由超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)使得一些黃酮發(fā)生了氧化，氧化損失超過(guò)了提取效應(yīng)帶來(lái)的增加，而且功率過(guò)高，雜質(zhì)溶出增加，也會(huì)阻礙黃酮類化合物的溶出，從而導(dǎo)致總黃酮提取率隨著功率的增加開始下降。因此，確定羅漢果花中總黃酮提取較佳的超聲波功率為200 W。

2.1.4 液料比對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響 用70%乙醇為提取溶劑，按超聲波功率200 W，超聲時(shí)間30 min，分別考察不同液料比對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2（c）所示。隨著提取溶劑的增加，原料與溶劑的接觸面積增大，而且原料與溶劑間的濃度梯度也會(huì)增大，從而有利于黃酮類物質(zhì)的浸出。由圖2（c）可以看出，隨著液料比的增加，總黃酮的提取率逐漸增大。當(dāng)液料比從10∶1升高至15∶1時(shí)，總黃酮提取率急劇增加，但當(dāng)液料比超過(guò)15∶1后，提取率的增加趨勢(shì)趨于緩和，這主要是因?yàn)楫?dāng)溶劑量達(dá)到一定程度后，溶劑將原料充分包裹，此時(shí)再繼續(xù)增加溶劑量對(duì)提高總黃酮提取率已沒(méi)有顯著的影響。因此，從節(jié)約溶劑和減少后期濃縮工作量角度考慮，確定溶劑與羅漢果花的比例為15∶1比較適宜。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響 用70%乙醇為提取溶劑，按液料比15∶1，超聲波功率200 W，分別考察不同超聲時(shí)間對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2（d）所示。由圖2（d）可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)通過(guò)超聲波的空化效應(yīng)從羅漢果花中大量溶出，提取率急劇增加，并在40 min時(shí)達(dá)到最大值，而40 min之后隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)溶出量開始減少，但超聲波空化作用帶來(lái)的高溫?zé)嵝?yīng)卻逐漸增強(qiáng)，使得一部分溶出的黃酮類物質(zhì)氧化分解，造成總黃酮提取率迅速下降。因此，確定羅漢果花中總黃酮提取適宜的超聲時(shí)間為40 min。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)編排方案及結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（表4）。以總黃酮提取率為響應(yīng)值，各因素經(jīng)二次回歸擬合后，得到羅漢果花中總黃酮提取率（Y）對(duì)液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲波功率（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=6.57+0.060A-0.30B+0.32C+0.18D-0.065AB-0.20AC+0.13AD+0.060BC+0.30BD+0.29CD-0.45A2-0.46B2-0.48C2-0.62D2，由表4可知，回歸模型檢驗(yàn)的P<0.000 1，表明試驗(yàn)所采用的二次模型是極顯著的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的，而失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.374 0>0.05，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明方程模擬的比較好；該模型的R2=0.945 8，說(shuō)明該模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)誤差小，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度相關(guān)性。離散系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，其值越低，試驗(yàn)結(jié)果的可靠性越高[10]。本試驗(yàn)離散系數(shù)為3.15%，在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。信噪比為14.28，遠(yuǎn)大于4，說(shuō)明該模型擬合度和可信度均較高。綜上所述，該方程是羅漢果花中總黃酮提取率與提取工藝各參數(shù)間合適的數(shù)學(xué)模型，利用此回歸方程可確定羅漢果花中總黃酮的最佳提取工藝。

回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[11]。由回歸方程可知，影響羅漢果花中總黃酮提取率的主次因素為：超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲波功率>液料比，其中提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率的作用達(dá)到極顯著，在二次項(xiàng)中，4個(gè)因素都表現(xiàn)為極顯著，在交互相中，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲波功率的交互作用和超聲時(shí)間與超聲波功率的交互作用表現(xiàn)為極顯著水平，其三維響應(yīng)曲面及等高線見(jiàn)圖3和圖4。等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用強(qiáng)，而圓形則與之相反[12]。由圖3、圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲波功率、超聲時(shí)間與超聲波功率的交互作用對(duì)羅漢果花中總黃酮的提取率影響皆顯著，且在所選范圍內(nèi)兩組圖都存在極值點(diǎn)，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)，極值點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的條件位于等高線中心點(diǎn)處。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從圖上可形象地看出各因素交互作用對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，若曲線越陡峭，則表明該因素對(duì)總黃酮提取率的影響越大[12]。圖3表示液料比15∶1，超聲時(shí)間40 min時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲波功率對(duì)總黃酮提取的影響。從圖3可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和超波聲功率的增加，總黃酮提取率先升高后降低，且乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面斜率大于超聲波功率曲面斜率，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響大于超聲波功率；圖4表示液料比15∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，超聲時(shí)間和超聲波功率對(duì)總黃酮提取的影響。從圖4可以看出，隨著超聲時(shí)間與超聲波功率的增加，總黃酮提取率先升高后降低，超聲時(shí)間和超聲波功率的曲面變化都很陡峭，但沿提取時(shí)間軸向等高線變化密集，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響大于超聲波功率。

通過(guò)響應(yīng)面得出的最佳提取工藝條件為液料比15∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)67.55%，超聲時(shí)間43.62 min，超聲波功率208.48 W。按此最佳工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得總黃酮平均提取率為6.537%，與回歸方程得到的預(yù)測(cè)值6.683%相差0.146%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)基本吻合。

3 結(jié)論

采用超聲波提取法從羅漢果花中提取總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)分析，考察了不同因素對(duì)羅漢果花中總黃酮提取率的影響，確定總黃酮提取時(shí)較適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲波功率為200 W，最適液料比為15∶1，提取時(shí)間為40 min；通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，確定了羅漢果花中總黃酮超聲波提取的最佳工藝條件為：液料比15∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)67.55%，超聲時(shí)間43.62 min，超聲波功率208.48 W，在此條件下，測(cè)得羅漢果花中總黃酮的提取率可達(dá)到6.537%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳全斌，朱 靜，譚洪盛.羅漢果花中黃酮苷元鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（2）：792-794.

[2] 鄧 雙，梁志遠(yuǎn)，張麗麗，等.三種花精油抗菌活性初探[J].貴州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28（12）：30-33.

[3] 譚洪盛，馬俊飛，陳全斌.羅漢果花中槲皮素和山奈酚含量的測(cè)定[J].廣西科學(xué)，2012，19（1）：69-70，73.

[4] BUBOLS G B，VIANNA D R，ALEXANDER M R，et al. The antioxidant activity of coumarins and flavonoids[J]. Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2013，13（3）：318-334.

[5] SIASOS G， TOUSOULIS D， TSIGKOU V，et al. Flavonoids in atherosclerosis： An overview of their mechanisms of action[J].Current Medicinal Chemistry，2013，20（21）：2641-2660.

[6] LU J，ZHOU C，RONG O，et al.Optimization of microwave-assisted extraction of flavonoids from cryptotaenia japonica kassk using response surface methodology[J].Advance Journal of Food Science and Technology，2013，5（3）：310-317.

[7] SHAN B，XIE J H，ZHU J H，et al. Ethanol modified supercritical carbon dioxide extraction of flavonoids from Momordica charantia L. and its antioxidant activity[J]. Food and Bioproducts Processing，2012，90（3）：579-587.

[8] 姜貴全. 地榆中藥用活性成分提取工藝及穩(wěn)定性研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2005.

[9] WEI L Y，WANG J H，ZHENG X D，et al. Studies on the extracting technical conditions of inulin from Jerusalem artichoke tubers[J]. Journal of Food Engineering，2007，79（3）：1087-1093.

[10] HE J，ZHEN Q W，QIU N，et al. Medium optimization for the production of a novel bioflocculant from Halomonas sp. V3a'using response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2009，100（23）：5922-5927.

[11] 吳 暉，賴富饒，胡筱波.響應(yīng)面分析法優(yōu)化油菜花粉多糖提取工藝的研究[J].食品與機(jī)械，2007，23（5）：66-70.

[12] 紀(jì)學(xué)芳，徐懷德，張淑娟，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取光皮木瓜黃酮和多糖復(fù)合物[J].食品科學(xué)，2013，34（6）：47-51.