四種轉(zhuǎn)基因玉米多重PCR檢測(cè)方法的建立

尹全　李憶　宋君　王東　張富麗　劉文娟　常麗娟　雷紹榮　劉勇

摘要：為建立能同時(shí)檢測(cè)4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR方法，選擇進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米最為常見的4種轉(zhuǎn)化體Bt11、Bt176、MON810和MON863，利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中現(xiàn)行有效的轉(zhuǎn)化體檢測(cè)引物作為多重PCR檢測(cè)體系引物，對(duì)多重PCR退火溫度和引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，多重PCR方法的適宜退火溫度為58 ℃，適宜引物終濃度（μmol/L）配比為0.4∶0.4∶0.4∶0.4，通過(guò)建立快速、準(zhǔn)確、高效的多重PCR為進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)提供有價(jià)值的參考。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米；多重PCR；篩查；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1540-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.045

轉(zhuǎn)基因玉米就是利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將種屬關(guān)系十分遙遠(yuǎn)且有用的基因?qū)胄枰牧嫉挠衩走z傳物質(zhì)中，并使其后代表現(xiàn)出人們所追求的具有穩(wěn)定遺傳性狀的玉米[1]。轉(zhuǎn)基因玉米是目前全世界種植最多的4種轉(zhuǎn)基因作物之一[2]。2011年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積僅次于轉(zhuǎn)基因大豆，達(dá)到5 100萬(wàn)hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的32%[3]。目前，中國(guó)批準(zhǔn)Bt11、Bt176、MON810、MON863等15種轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)口用作加工原料[4]。本研究選擇最為常見的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863 4種轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)基因玉米Bt11是由先正達(dá)公司研發(fā)的，為兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因?yàn)锽t系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因，轉(zhuǎn)入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因[5]。轉(zhuǎn)基因玉米Bt176是由先正達(dá)公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因?yàn)锽t系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因[6]。轉(zhuǎn)基因玉米MON810是由孟山都公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因?yàn)锽t系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因，可抗歐洲玉米螟[7]。轉(zhuǎn)基因玉米MON863是由孟山都公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因?yàn)锽t系列毒蛋白基因的cry3Bb1抗蟲基因。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因商業(yè)化產(chǎn)品不斷增多，其安全性問(wèn)題也越來(lái)越受到社會(huì)各界甚至普通大眾的廣泛關(guān)注，包括中國(guó)在內(nèi)的越來(lái)越多國(guó)家制定并實(shí)施了相關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度[8]，而轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度如何科學(xué)執(zhí)行就必須依托快速、有效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)主要有蛋白質(zhì)和核酸兩大類，PCR技術(shù)是核酸檢測(cè)技術(shù)的一種，其具有敏感、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，主要用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中的外源基因[9，10]，轉(zhuǎn)化體特異也能利用該技術(shù)檢測(cè)。然而在檢測(cè)作物及其產(chǎn)品時(shí)，往往需要檢測(cè)多個(gè)外源基因來(lái)確認(rèn)其是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及含哪些轉(zhuǎn)基因成分或者需要檢測(cè)包含多種轉(zhuǎn)化體的樣品，普通PCR（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)分別檢測(cè)外源基因或轉(zhuǎn)化體時(shí)，存在操作繁瑣、時(shí)間和試劑耗費(fèi)大等缺點(diǎn)[11]。因此，為了解決普通PCR技術(shù)在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時(shí)存在的缺點(diǎn)，多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR）技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中得到了應(yīng)用[12-14]。本試驗(yàn)旨在提高轉(zhuǎn)化體檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本，根據(jù)單個(gè)轉(zhuǎn)化體檢測(cè)方法，建立轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863 4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR檢測(cè)技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863來(lái)源于IRRM[Institute for Reference Materials and Measurements]。

1.1.2 主要試劑 植物基因組提取試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量（M）購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購(gòu)于日本東洋紡（TOYOBO）株式會(huì)社；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 引物序列設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863轉(zhuǎn)化體特異引物序列參照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（表1），將各檢測(cè)基因上、下游引物濃度稀釋為10 μmol/L。

1.3 樣品DNA提取

樣品DNA提取按照天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，測(cè)定樣品DNA濃度。

1.4 多重PCR方法的建立

1.4.1 單個(gè)轉(zhuǎn)化體特異性驗(yàn)證 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)配制反應(yīng)，采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4.2 多重PCR條件優(yōu)化 利用以下體系和程序?qū)Χ嘀豍CR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系為：2×Master Mix 12.5 μL，4對(duì)轉(zhuǎn)化體特異引物上、下游引物終濃度各0.2 μmol/L，4個(gè)轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板各1 mg/L，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度設(shè)置梯度50、54、56、58、60、64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，按照條帶特異、二聚體少、擴(kuò)增效率一致等要求選擇適宜的引物退火溫度。

利用以上體系和程序?qū)Χ嘀豍CR引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 12.5 μL，4對(duì)引物終濃度按照表2設(shè)置引物濃度梯度，4個(gè)轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板各1 mg/L，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序選擇退火溫度優(yōu)化后確定的程序。采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，按照條帶特異、二聚體少、擴(kuò)增效率一致等要求選擇適宜的引物濃度配比。

1.5 多重PCR方法靈敏度檢測(cè)

將4個(gè)轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板等比混合，將混合后的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，使得每個(gè)反應(yīng)體系中基因組DNA的拷貝數(shù)分別為1 000、200、100、50、20、10個(gè)，利用試驗(yàn)優(yōu)化后的多重PCR方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.6 已知樣品驗(yàn)證

利用試驗(yàn)優(yōu)化后的MPCR檢測(cè)體系，對(duì)已知樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取

樣品總DNA提取純化采用植物基因組提取試劑盒，通過(guò)NanoDrop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度和質(zhì)量。結(jié)果表明，所有樣品濃度都大于25 ng/μL，且OD260 nm/OD280 nm范圍為1.8～2.0，OD260 nm/OD230 nm大于2.0，提取的樣品DNA可滿足PCR擴(kuò)增對(duì)模板DNA的要求[19]，將樣品DNA濃度稀釋至25 ng/μL待測(cè)。

2.2 單個(gè)轉(zhuǎn)化體特異性驗(yàn)證

本試驗(yàn)選擇的單個(gè)轉(zhuǎn)化體PCR檢測(cè)方法可以將目的基因片段成功擴(kuò)增，而其他不含該轉(zhuǎn)化體的樣品中沒有相應(yīng)擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）表明，4個(gè)轉(zhuǎn)化體引物目的條帶特異，沒有非特異性條帶出現(xiàn)，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步說(shuō)明本試驗(yàn)選擇的4個(gè)轉(zhuǎn)化體引物可用于多重PCR檢測(cè)體系研究。

2.3 多重PCR條件的優(yōu)化

結(jié)果（圖2）表明，退火溫度太低容易產(chǎn)生非特異性條帶和引物二聚體，而退火溫度太高又不能使全部目的條帶得到理想擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度為50 ℃時(shí)，所有目的條帶都未得到擴(kuò)增，而且還出現(xiàn)了許多非特異性條帶，退火溫度50 ℃是不適合的。當(dāng)退火溫度為54和56 ℃時(shí)，雖然所有目的條帶都得到擴(kuò)增，但也出現(xiàn)了許多非特異性條帶，退火溫度54和56 ℃也是不適合的。而退火溫度為64 ℃時(shí)，Bt11轉(zhuǎn)化體的目的條帶未得到有效擴(kuò)增，退火溫度64 ℃也不適合。當(dāng)退火溫度為58和60 ℃時(shí)，目的條帶得到擴(kuò)增，且沒有出現(xiàn)非特異條帶，考慮到所有目的條帶擴(kuò)增效率和單基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，因此，選擇多重PCR反應(yīng)的適宜退火溫度為58 ℃。

通過(guò)引物濃度梯度試驗(yàn)，結(jié)果（圖3）表明，各引物終濃度按照方案F配比時(shí)，各轉(zhuǎn)化體目的條帶的擴(kuò)增效率高并且一致，沒有非特異性條帶出現(xiàn)；而其他幾種引物濃度方案結(jié)果均不理想，目的基因存在無(wú)擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不一致以及出現(xiàn)非特異條帶現(xiàn)象等。因此，最終確定適宜的引物終濃度（μmol/L）配比為0.4∶0.4∶0.4∶0.4。

2.4 多重PCR靈敏度結(jié)果

結(jié)果（圖4）表明，在模板濃度不低于100個(gè)拷貝時(shí)，4個(gè)轉(zhuǎn)化體目的條帶均可得到有效擴(kuò)增。而當(dāng)模板濃度低于100個(gè)拷貝時(shí)，4個(gè)轉(zhuǎn)化體目的條帶幾乎沒有擴(kuò)增。本試驗(yàn)所建立的多重PCR檢測(cè)體系靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝。

2.5 已知樣品驗(yàn)證

采用優(yōu)化后的多重PCR體系對(duì)已知樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖5）表明，所有已知樣品的擴(kuò)增條帶與其含有的轉(zhuǎn)化體一致，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的多重PCR檢測(cè)方法的可靠性。

3 小結(jié)與討論

多重PCR最早由Chamberlain等[12]于1988年提出，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物等領(lǐng)域，包括基因敲除分析、多態(tài)性分析、定量分析、RNA檢測(cè)及微生物耐藥檢測(cè)等[20]。在實(shí)際應(yīng)用中，不同引物序列對(duì)多重PCR結(jié)果存在很多影響因素（如引物濃度、退火溫度等）。在關(guān)鍵影響因素引物濃度選擇過(guò)程中，本試驗(yàn)采用不同引物濃度梯度和引物配比，在充分考慮PCR反應(yīng)過(guò)程中易產(chǎn)生的引物二聚體、非特異性條帶等特殊情況下，選擇目的條帶特異、引物二聚體少，各轉(zhuǎn)化體引物擴(kuò)增效率相對(duì)一致的引物濃度配比。退火溫度是多重PCR反應(yīng)中一個(gè)關(guān)鍵因素。通常情況下可以依據(jù)引物的解鏈溫度直接選擇退火溫度，但有時(shí)結(jié)果與預(yù)期并不一致。在多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化過(guò)程中，最簡(jiǎn)單的方法就是設(shè)置54 ℃為初始退火溫度，如果多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶，需適當(dāng)提高引物退火溫度，反之則降低引物退火溫度[21]。本試驗(yàn)從6個(gè)退火溫度中，根據(jù)4個(gè)轉(zhuǎn)化體引物特異性條帶擴(kuò)增效率、非特異性條帶以及引物二聚體的產(chǎn)生等因素確定了58 ℃作為轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測(cè)體系退火溫度。

為了提高檢測(cè)效率，本試驗(yàn)將分辨率更高、電泳條帶更清晰的毛細(xì)管電泳引入到多重PCR檢測(cè)體系中，也是本研究的最大特點(diǎn)。目前毛細(xì)管電泳技術(shù)已應(yīng)用于無(wú)機(jī)及有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽的分離分析，核酸的分離分析等方面[22]。雖然目的條帶間堿基差異大也可以采用普通瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行分析判斷，但毛細(xì)管電泳能將擴(kuò)增目的條帶分離得更明顯，結(jié)果更加清晰；如果需要檢測(cè)的目的基因間的堿基差異大小不能采用普通瓊脂糖凝膠電泳方式進(jìn)行準(zhǔn)確分析，特別是在只有幾個(gè)堿基差異時(shí)，毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)則更明顯。

本試驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)在1個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)4種轉(zhuǎn)化體，有效簡(jiǎn)化了操作步驟、縮短了檢測(cè)時(shí)間、提高了檢測(cè)效率，為轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)提供了速度快、效率高、成本低以及污染小的方法。

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