水解酪蛋白粉增強(qiáng)中藥復(fù)方降血壓作用的研究

陳有軍，嚴(yán)群超，陳國(guó)留，吳美音.廣州藍(lán)韻醫(yī)藥研究有限公司，廣東 廣州 50663；.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5063

◆實(shí)驗(yàn)研究◆

水解酪蛋白粉增強(qiáng)中藥復(fù)方降血壓作用的研究

陳有軍1，嚴(yán)群超2，陳國(guó)留1，吳美音1
1.廣州藍(lán)韻醫(yī)藥研究有限公司，廣東 廣州 510663；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632

目的：考察水解酪蛋白粉（Casein hydrolysate，CH）對(duì)天麻、鉤藤和杜仲?gòu)?fù)方（Chines herbal compound，CHC）降血壓作用的影響和急性毒性。方法：將SD大鼠分為空白對(duì)照組和樣品正常組，給予蒸餾水和CH與CHC配伍藥物；將原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）分為牛黃降壓膠囊組、CH-CHC藥物低、中、高劑量組、CH組和CHC組及模型對(duì)照組，每天灌胃給藥1次，連續(xù)4周，記錄大鼠收縮壓、舒張壓、心率和血清一氧化氮（NO）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、內(nèi)皮素-1（ET-1）含量；急性毒性實(shí)驗(yàn)以KM小鼠按最大給藥體積灌胃，每天2次，連續(xù)14天，記錄動(dòng)物一般變化和主要臟器系數(shù)。結(jié)果：與模型對(duì)照組比較，CH-CHC中高劑量組、CH組和CHC組大鼠收縮壓和舒張壓顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），CH-CHC降血壓作用顯著優(yōu)于CH組和CHC組（P＜0.05），相應(yīng)血清AngⅡ、NO和ET-1水平也具有顯著性差異，各藥物組對(duì)大鼠心率均無(wú)顯著影響，急性毒性試驗(yàn)藥物組與對(duì)照組結(jié)果無(wú)顯著差異。結(jié)論：CH可以顯著增強(qiáng)天麻、鉤藤和杜仲?gòu)?fù)方的降血壓作用，兩者配伍無(wú)急性毒性作用。

水解酪蛋白粉；天麻；鉤藤；杜仲；降血壓；急性毒性

酪蛋白是乳液中含量最豐富的蛋白質(zhì)，除具有營(yíng)養(yǎng)功能之外，還具有重要的生理功能，是生物活性肽的良好來(lái)源［1］。研究發(fā)現(xiàn)，水解酪蛋白粉（casein hydrolysate，CH）具有顯著的降血壓作用，其作用機(jī)制主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制血管緊張素的生成，發(fā)揮降低血壓的作用，安全性高、無(wú)副作用，在高血壓的防治中具有十分重要的研究?jī)r(jià)值和實(shí)用價(jià)值［1～2］。然而高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，為探索多途徑多靶點(diǎn)協(xié)同降血壓新的聯(lián)合用藥，本試驗(yàn)擬將CH配伍常用降血壓中藥天麻、鉤藤和杜仲?gòu)?fù)方（CHC），考察兩者協(xié)同治療高血壓的作用效果及其急性毒性作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器JJ3000動(dòng)物電子秤，G&G公司產(chǎn)品；BS224S電子天平，德國(guó)SARTORIUS產(chǎn)品；CODA多通道無(wú)創(chuàng)測(cè)壓系統(tǒng)，美國(guó)Kent公司產(chǎn)品；ThermoVarioskan光柵型多功能微孔板讀數(shù)儀，美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重180～220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)44007200021139）；KM小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：44007200017836）；原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），雄性，10～12周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（合格證號(hào)：11400700087313）。

1.3試驗(yàn)藥物及試劑CH是以酪蛋白為原料，加水溶解后添加蛋白酶（加工助劑），經(jīng)酶解、滅酶、殺菌、過(guò)濾、噴霧干燥等工藝加工制成，由無(wú)限極（中國(guó)）有限公司提供（批號(hào)：20140820）；天麻、鉤藤和杜仲飲片均購(gòu)自四川新荷花中藥飲片股份有限公司；牛黃降壓膠囊（百善唐威藥業(yè)有限公司，批號(hào)：04100）。大鼠內(nèi)皮素-1（ET-1）酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒（上海西塘生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：1503261）；大鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒（上海西塘生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：1503252）；一氧化碳（NO）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)：20150414）。

1.4實(shí)驗(yàn)藥物樣品制備按等比例稱取天麻、鉤藤和杜仲，分別加12倍量水煎煮1.5 h和10倍量水煎煮1 h，合并濾液，減壓濃縮；CH使用時(shí)按劑量要求加入中藥濃縮液或水中，加熱溶解，攪拌均勻；牛黃降壓膠囊使用時(shí)以水配制成所需濃度。

1.5動(dòng)物分組及給藥取SD大鼠分為空白對(duì)照組和樣品正常組，分別給予蒸餾水10 mL/kg、CH-CHC藥物混合液（CH-CHC生藥分別為0.033 g/kg和0.5 g/kg）；取SHR大鼠按血壓及體重隨機(jī)分為模型對(duì)照組、CH-CHC低、中、高劑量組（CH-CHC生藥劑量分別為 0.016 g/kg和 0.25 g/kg、0.033 g/kg和0.5 g/kg、0.067 g/kg和1.0 g/kg），CH組（0.033 g/kg）和CHC組（生藥0.5 g/kg），牛黃降壓膠囊組（0.288 g/kg），每組8只，每天1次，連續(xù)給藥4周。

急性毒性試驗(yàn)分組及給藥：取KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，分為正常組和CH-CHC組，每組20只，禁食12h后按最大給藥體積灌胃，CH-CHC劑量為2.8 g/kg和42.4 g/kg，每天2次，間隔6h，正常組給予等量蒸餾水，各組動(dòng)物定量給予鼠糧。

1.6測(cè)定方法功效試驗(yàn)給藥第4周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用CODA多通道無(wú)創(chuàng)測(cè)壓系統(tǒng)進(jìn)行組間平行檢測(cè)，檢測(cè)收縮壓、舒張壓和心率。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，取血，分離血清，檢測(cè)各組大鼠血清中NO、AngⅡ、ET-1含量。急性毒性試驗(yàn)給藥前和給藥后第3、5、8、10、12、14天稱重，觀察動(dòng)物行為活動(dòng)、毛色、進(jìn)食情況及糞便等一般體征，第14天處死動(dòng)物，肉眼剖檢胸腺、肝、脾、腎上腺、腎、睪丸（或子宮）等重要臟器，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1各組大鼠血壓指標(biāo)比較見(jiàn)表1。給藥4周后，和模型對(duì)照組動(dòng)物比較，各藥物組對(duì)大鼠收縮壓和舒張壓均有一定的降低。CH-CHC中及高劑量組、CH組和CHC組與模型對(duì)照組比較，血壓均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），CHC-CH中劑量組降血壓作用顯著優(yōu)于CHC組和CH組（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組與樣品正常組動(dòng)物血壓值無(wú)顯著性差異，所有動(dòng)物心率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明藥物對(duì)正常動(dòng)物血壓和心率無(wú)影響。

表1　各組大鼠血壓指標(biāo)比較（±s）

表1　各組大鼠血壓指標(biāo)比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與CHC中劑量組比較，⑤P＜0.05

組別空白對(duì)照組樣品正常組模型對(duì)照組牛黃降壓膠囊CH-CH C-低CH-CH C-中CH-CH C-高CH組CH C組收縮壓（mmH g）　　舒張壓（mmH g）　　心率（次/min）給藥前115.34±7.87 109.18±10.68 182.07±29.01②186.00±19.32 177.71±15.27 182.00±10.36 185.00±19.32 186.35±15.41 180.51±10.89 4 w 114.25±11.14 112.06±15.60 202.09±5.12②164.34±28.91④193.29±9.96 164.34±25.34④150.27±17.30④185.14±15.26③⑤178.35±18.67④⑤給藥前81.48±7.62 78.97±10.66 137.47±30.61②136.30±22.93 132.11±19.92 133.55±14.25 137.23±11.07 136.65±12.79 134.20±9.21 4 w 76.71±8.90 84.28±13.27 152.88±7.95②123.68±27.21④145.91±11.33 116.27±17.11④120.20±10.25④133.42±12.48③⑤128.65±17.11③⑤給藥前312.96±130.55 339.75±36.80 362.61±48.49 342.41±55.42 320.19±28.67 350.83±34.17 311.53±47.28 335.47±41.56 345.79±54.25 4 w 291.37±53.44 301.29±34.73 362.99±28.47 366.26±44.27 335.59±30.82 313.42±51.24 315.89±46.14 326.13±36.25 338.41±40.00

2.2各組大鼠生化指標(biāo)比較見(jiàn)表2。給藥4周后，各藥組相應(yīng)血清AngⅡ、NO和ET-1水平與模型對(duì)照組比較，大部分具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。同時(shí)，CHC-CH中劑量組血清AngⅡ和ET-1水平較CH組和CHC組也具有顯著差異（P＜0.05），表明復(fù)方中藥與CH配伍聯(lián)合使用降血壓作用具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表2　各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）

表2　各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，③P＜0.05，④P＜0.01；與CH-CHC中劑量組比較，⑤P＜0.05，⑥P＜0.01

組別空白對(duì)照組樣品正常組模型對(duì)照組牛黃降壓膠囊CH-CHC-低CH-CHC-中CH-CHC-高CH組CHC組血清生化指標(biāo)N O（μmol/L）16.06±5.02 16.21±5.80 7.95±1.28②12.85±4.46④8.99±4.27 10.41±2.28③8.49±1.86 10.21±0.36③9.89±0.74③A ngⅡ（ng/mL）1.54±0.37 1.57±0.33 2.59±0.45②1.67±0.90④1.80±0.54③1.66±0.24④1.70±0.20③1.96±0.18③⑤1.82±0.10③⑤ET-1（pg/mL）15.04±4.49 15.22±2.39 25.43±4.76②16.15±5.62④18.43±3.85③15.09±1.74④15.30±4.58④22.74±4.27③⑤20.40±3.40③⑤

2.3各組急性毒性試驗(yàn)結(jié)果比較見(jiàn)圖1。①一般情況觀察：正常組和CH-CHC組動(dòng)物均無(wú)死亡，其行為活動(dòng)、進(jìn)食、體重、體表顏色和運(yùn)動(dòng)功能等未見(jiàn)明顯異常；無(wú)運(yùn)動(dòng)增加或減少；正常反射、翻正反射等神經(jīng)反射存在，無(wú)僵硬、痙攣、或運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，無(wú)四肢或全身震顫，每天進(jìn)食量也無(wú)明顯差異。②各組小鼠體重：各組小鼠體重結(jié)果表明，給藥后各組小鼠體重增加趨勢(shì)基本相同，說(shuō)明在樣品最大給藥量，給藥14天后，對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。動(dòng)物肝臟、腎臟、脾臟、胸腺、腎上腺、睪丸和子宮等臟器均無(wú)發(fā)現(xiàn)有明顯異常，其臟器系數(shù)與正常組比較均無(wú)差異。

圖1　各組急性毒性試驗(yàn)結(jié)果比較

3　討論

酪蛋白結(jié)構(gòu)比較開(kāi)放、松散、易受各種蛋白酶的作用而發(fā)生水解，其水解物是生物降血壓活性肽的主要來(lái)源［3～4］，功能試驗(yàn)及臨床研究等均表明，CH具有顯著的降低血壓的作用［5～6］。其降壓作用是通過(guò)與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-I-converting enzyme，ACE）活性中心結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ACE活性，阻礙ACE催化血管緊張素Ⅰ分解成血管緊張素Ⅱ，發(fā)揮降血壓作用［2，7］。天麻、鉤藤及杜仲等中藥被廣泛應(yīng)用于高血壓的治療，天麻素與鉤藤總堿可發(fā)揮協(xié)同降壓作用，兩者水提混合液對(duì)高血壓大鼠降血壓的效果有顯著增強(qiáng)［8～9］，兩者的作用途徑多樣，包括降低AngⅡ和醛固酮（ALDO）含量、抑制心肌組織中胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）等細(xì)胞因子的表達(dá)、促進(jìn)心肌間質(zhì)膠原的降解等［10］?，F(xiàn)代研究表明，杜仲具有顯著的降血壓作用，其降血壓作用是通過(guò)舒張血管平滑肌的作用而實(shí)現(xiàn)［11～12］。水解酪蛋白粉與該中藥復(fù)方的配伍使用，為發(fā)揮多途徑多靶點(diǎn)降血壓作用提供了可能，可作為一個(gè)協(xié)同降壓產(chǎn)品組方的有益探索目標(biāo)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，給藥4周后，CHC組和CH組均表現(xiàn)出顯著的降低收縮壓和舒張壓的作用，兩者配伍后中及高劑量組降低收縮壓和舒張壓作用較模型對(duì)照組顯著，而且降壓作用較兩者單獨(dú)使用得到顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），這可能與配方中多組分發(fā)揮藥物的協(xié)同作用有關(guān)。高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多靶點(diǎn)、多條信號(hào)通路，血清中與之相關(guān)的活性指標(biāo)主要有AngⅡ、內(nèi)皮素（ET）和NO等，其中ET為血管收縮因子，NO是舒血管物質(zhì)，它們通過(guò)激素機(jī)制和血管機(jī)制等作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和血管，調(diào)節(jié)心血管功能，在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中有著重要作用［13～14］。試驗(yàn)結(jié)果表明，CH-CHC配伍使用可升高NO含量，降低血漿ET-1和AngⅡ含量，多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮了降血壓作用。而藥物對(duì)正常大鼠的各項(xiàng)考察指標(biāo)均無(wú)異常影響，未見(jiàn)明顯的急性毒性反應(yīng)，樣品服用安全，酪蛋白與中藥復(fù)方聯(lián)合使用具有一定的推廣價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effect of Casein Hydrolysate on Strengthening Chinese Herbal Compound for Reducing Blood Pressure

CHEN Youjun，YAN Chaoqun，CHEN Guoliu，WU Meiyin

Objective：To investigate the effect and acute toxicity of Casein hydrolysate（CH）on Chinese herbal compound（CHC）of gastrodia elata，uncaria and eucommia in reducing blood pressure.Methods：SD rats were divided into the control group and CH-CHC normal group，CH and CHC compatibe drugs and distilled water being given.Rats with essential hypertension were divided into niuhuang jiangya capsules group，CH-CHC drugs low，mid and high dose groups，CH group，CHC group，oral administration once every day for 4 weeks.Recorded systolic pressure，diastolic pressure，heart rate and contents of serum nitric oxide（NO），angiotoninⅡ（AngⅡ），endothelin-1（ET-1）.KM rats were gavaged according the maximum dose volume on the acute toxicity test，2 times every day for 14 days.Recorded the common changes and the main organ coefficient of animal.Results：Comparing with those in the model group，the systolic pressure and diastolic pressure of the rats in CH-CHC mid and high dose group，CH group and CHC group were dropped significantly（P＜0.05 or P＜0.01），the effect of CH-CHC reducing blood pressure being obviously superior to that in CH group and CHC group（P＜0.05），so as the levels of corresponding serum AngⅡ，NO and ET-1.There was no significant effect on heart rate of rat in every drug group，and there was also no difference between the acute toxicity drug group and the control group.Conclusion：CH can improve the effect of CHC of gastrodia elata，uncaria and eucommia in reducing blood pressure.The compatibility of the two drugs is no acute toxicity.

Casein hydrolysate；Gastrodia elata；Uncaria；Eucommia；Reduce blood pressure；Acute toxicity

R285.5

A

0256-7415（2016）04-0266-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.101

2015-11-20

陳有軍（1979-），男，制藥工程師，主要從事中藥研發(fā)等工作。

嚴(yán)群超，E-mail：jnyqc163@163.com。