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    丹參對子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

    2016-10-19 00:51:38盧妙蓮李云曾瑞麗林海標(biāo)余冬青張秀娟曹楠楠王建兵廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科廣東廣州500廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科廣東廣州500廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科廣東廣州500
    新中醫(yī) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)異位癥中醫(yī)藥大學(xué)

    盧妙蓮,李云,曾瑞麗,林海標(biāo),余冬青,張秀娟,曹楠楠,王建兵.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,廣東 廣州 500 .廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科,廣東 廣州 500 .廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科,廣東 廣州 500

    丹參對子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

    盧妙蓮1,李云1,曾瑞麗1,林海標(biāo)1,余冬青2,張秀娟3,曹楠楠1,王建兵1
    1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,廣東 廣州 510120 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科,廣東 廣州 510120 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科,廣東 廣州 510120

    目的:觀察丹參對子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)mRNA和蛋白表達(dá)的影響,探討其可能的機(jī)制。方法:用混合酶消化法進(jìn)行間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),分別加入空白對照(空白組),不同濃度丹參(1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,15 mg/L)(丹參1組、丹參2組、丹參3組、丹參4組)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h后,用CCK-8法觀察不同濃度的丹參對間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響,RT-PCR法檢測其對MMP-9 mRNA表達(dá)的影響,Western blotting檢測其對MMP-9蛋白含量的影響。結(jié)果:CCK-8法結(jié)果顯示,除丹參1組外,其余丹參組間質(zhì)細(xì)胞增殖與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較,除丹參1組外,各丹參組MMP-9mRNA表達(dá)降低、MMP-9蛋白表達(dá)量減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:丹參可以抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖,同時可以抑制MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá),從而降低對細(xì)胞外基質(zhì)的降解,最終抑制子宮異位內(nèi)膜的種植、侵襲和轉(zhuǎn)移。

    子宮內(nèi)膜異位癥;丹參凍干粉;異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞;基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)

    子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EM)是婦科疑難病、多發(fā)病。子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行異位侵襲和種植過程中,必須降解該組織細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,基質(zhì)金屬酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族中的MMP-9可能發(fā)揮重要作用[1]?,F(xiàn)應(yīng)用不同濃度丹參對EM在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的MMP-9 mRNA及蛋白進(jìn)行干預(yù),探討其可能的機(jī)制。

    1 材料及方法

    1.1試劑與藥物高糖DMEM(Thermo公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、Trizol(Invitrogen公司)、胰蛋白酶(Science公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)、PCR試劑盒(Tiangen公司)、二甲基亞砜(DMSO)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、甘氨酸(GLY)、MMP-9兔抗人多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體,以上試劑購自廣州碧云天生物公司。丹參的凍干粉由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗室制備加工后-20℃保存。

    1.2儀器與設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、Thermo MultiskanAscent酶標(biāo)儀、96孔熱循環(huán)儀(AB公司)、倒置相差顯微鏡(Nikon公司)、CP225D十萬分之一分析天平(Sartorius公司)、紫外凝膠成像儀(Bio-Rad公司)、穩(wěn)定電流電泳儀(北京六一儀器)。

    1.3細(xì)胞培養(yǎng)與傳代實驗獲得了廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。15例異位內(nèi)膜組織均來自2014年5月-2014年10月本院婦科行卵巢巧克力囊腫(增殖期)住院手術(shù)的患者。培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[2]。將子宮內(nèi)膜組織剪成肉眼模糊狀,加入膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶的混合酶,消化后的細(xì)胞經(jīng)38 μm(400目)篩網(wǎng)過濾后得到含間質(zhì)細(xì)胞的濾液。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后將未貼壁細(xì)胞吸出,加入新的培養(yǎng)液,放入37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞極盡鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代次數(shù)越多,間質(zhì)細(xì)胞純度越高[3]。

    1.4CCK-8實驗取對數(shù)生長期間質(zhì)細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育,使細(xì)胞處于G0期。每孔分別加入不同濃度的培養(yǎng)基100μL(空白組加入不含胎牛血清DMEM,丹參條件組加入終濃度為1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,15 mg/L4個組即丹參1組,丹參2組,丹參3組,丹參4組),每組各設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)48 h,每孔分別加入10 μL CCK-8液孵育1 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度值(OD值)。

    1.5RT-PCR檢測PCR擴(kuò)增MMP-9基因,采用GAPDH作為內(nèi)參照,引物序列如下:MMP-9上游引物5′-TCCCTG GAGACCTGAGAACC-3′,下游引物5′-GGCAAGTCTTCCG AGTAGTTT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物 312bp;GAPDH上游引物 5′-GGGGCCATCCACAGTCTTC-3′,下游引物5′-CACCATC TTCCAGGAGCGAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物352bp;反應(yīng)條件為:94℃3 min,94℃30 s,58℃30 s,72℃1 min,72℃延伸5 min,30個循環(huán)。用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析灰度值,以各條帶與GAPDH內(nèi)參條帶的比值,作為MMP-9 mRNA相對表達(dá)水平。

    1.7Western blotting檢測按試劑盒說明書提取總蛋白,按BCA法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品,用SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(PVDF膜),300 mA恒流轉(zhuǎn)2 h,隨后將PVDF膜置于含50g/L脫脂牛奶溶液中進(jìn)行封閉,MMP-9和β-actin一抗分別用抗體稀釋液稀釋,膜置于一抗稀釋液中,于4℃下平緩搖動過夜,二抗辣根過氧化物標(biāo)記的IgG多克隆抗體按1∶5000稀釋,膜在二抗稀釋液中室溫慢搖1 h,暗室內(nèi)曝光檢測。用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)將每個條帶灰度值數(shù)字化,目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表目的蛋白的相對含量。

    1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)用(±s)表示。多組比較采用單因素方差分析(ANOVA),將所有的條件組分別與指定的對照組進(jìn)行比較。

    2 結(jié)果

    2.1間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)4 h后細(xì)胞基本全部貼壁,聚集成團(tuán)并呈多角形;72 h后呈長梭形或紡錘形,交織成網(wǎng);傳代后的細(xì)胞生長較快,而且性狀穩(wěn)定,隨著傳代次數(shù)的增加,間質(zhì)細(xì)胞的純度也越高。

    2.2各組間質(zhì)細(xì)胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)比較見表1、圖1、圖2。CCK-8法結(jié)果顯示,除丹參1組外,其余丹參組間質(zhì)細(xì)胞增殖與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較,除丹參1組外,各丹參組MMP-9 mRNA表達(dá)降低、MMP-9蛋白表達(dá)量減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 各組間質(zhì)細(xì)胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s)

    表1 各組間質(zhì)細(xì)胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s)

    與空白組比較,①P<0.05

    組別空白組丹參1組丹參2組丹參3組丹參4組O D值0.754±0.029 0.738±0.021 0.669±0.036①0.456±0.034①0.358±0.028①M M P-9 mRN A 0.699±0.089 0.685±0.009 0.602±0.013①0.549±0.017①0.411±0.007①M M P-9蛋白0.819±0.010 0.798±0.039 0.705±0.119①0.646±0.388①0.549±0.214①

    3 討論

    目前由于西藥和手術(shù)給EM患者身心帶來損傷,而采用中醫(yī)治療不僅能緩解這種狀況,還能提高受孕率,具有復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,瘀血內(nèi)停是導(dǎo)致EM臨床癥狀和體征的主要因素,故活血化瘀,行氣止痛為其治療大法[4],并根據(jù)辨證輔以補(bǔ)腎健脾,疏肝行氣,清熱解毒化痰制品。丹參又名赤參,具有活血調(diào)經(jīng),祛瘀止痛,涼血消癰,清心除煩,養(yǎng)血安神等功效。

    圖1 不同條件組MMP-9 mRNA相對表達(dá)量

    圖2 不同條件組MMP-9蛋白相對表達(dá)量

    EM在早期主要通過黏附性糖蛋白分子黏附于腹膜間皮表面,繼而破壞細(xì)胞外基質(zhì),所以細(xì)胞外基質(zhì)的降解是新生血管形成以及組織結(jié)構(gòu)重建的基本條件[5]。有許多因子在細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用,其中對MMPs家族研究較為廣泛,MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶。研究表明,異位內(nèi)膜組織中MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng),提示其在EM的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[6]。它幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的所有成分,但主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅲ型/Ⅳ型膠原和明膠3種主要成分,并能促進(jìn)心血管的生成,在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲和生長過程中發(fā)揮重要作用[7]。

    本研究通過建立體外子宮異位癥間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系,消除體內(nèi)外各種影響因素,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在給予1 mg/L藥物后,作用不明顯。給予5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L不同濃度藥物刺激后,間質(zhì)細(xì)胞的增殖受到影響(P<0.05),丹參對異位間質(zhì)細(xì)胞生長的抑制作用呈劑量依賴性,隨著濃度增高而作用增強(qiáng),表明丹參對異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖具有抑制作用;同時觀察到,除1 mg/L組外,其它組MMP-9 mRNA和MMP-9蛋白表達(dá)水平與空白組具有顯著差異(P< 0.05),子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)丹參作用24 h后MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。所以丹參可以通過降低MMP-9的產(chǎn)生,從而降低對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞達(dá)到減輕臨床癥狀的目的。但是中藥是通過多種途徑發(fā)揮作用,僅靠本實驗還不能確定丹參具體能夠影響到的細(xì)胞因子和酶,對此還有待深入系統(tǒng)的探討和研究。

    [1]王紅靜,黃倩,安寒,等.中草藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的系統(tǒng)評價[J].Chinese J Evidence-Based Medicine,2004,4(9):602-608.

    [2] Brueggmann D,Templeman C,Starzinski-Powitz A,etal.Novel three-dimensional invitromodelsof ovarian endometriosis[J].J Ovarian Res,2014,7:17.

    [3]唐雪蓮,謝梅青,張鳳麗.高純度分離子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞和體外培養(yǎng)技術(shù)[J].中山大學(xué)學(xué)報,2003,24(6):589-592.

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    (責(zé)任編輯:駱歡歡)

    Effect of Salviae Miltiorrhizae on Stromal Cells MMP-9 mRNA and Protein Expression of Endometriosis

    LU Miaolian,LI Yun,ZENG Ruili,LIN Haibiao,YU Dongqing,ZHANG Xiujuan,CAO Nannan,WANG Jianbing

    Objective:To observe the effect of salviae miltiorrhizae on matrix metalloproteinase 9(MMP-9)mRNA and protein expression of endometriosis and discuss their feasible mechanism.Methods:Cultured stromal cells by the method of mixed enzymatic digestion,added respectively nothing(blank group)or different concentration of salviae miltiorrhizae(1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,15 mg/L)(salviae miltiorrhizae 1 group,salviae miltiorrhizae 2 group,salviae miltiorrhizae 3 group,salviae miltiorrhizae 4 group).After cells were routine cultured for 48 h,observed the effect of different concentration of salviae miltiorrhizae on stromal cell proliferation by the method of CCK-8,and detected the effect on MMP-9 mRNA expression by the method of RT-PCR,then detected the effect on MMP-9 protein level by the method of Western blotting.Results:The result of CCK-8 showed that,differences of stromal cell proliferation between blank group and salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group were statistical significant(P<0.05).Comparing with blank group,MMP-9mRNA expression was decreased and MMP-9 protein expression also was reduced in salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group,differences being statistical significant(P<0.05).Conclusion:Salviae miltiorrhizae can inhibit ectopic stromal cell proliferation,meanwhile inhibit MMP-9mRNA and protein expression,consequently reduce degradation of extra cellular matrix,and ultimately inhibit cultivation,invasion and metastasis of uterus ectopic endometrium.

    Endometriosis;Salviae miltiorrhizae freeze-dried powder;Ectopic stromal cell;Matrix metalloproteinase 9(MMP-9)

    R711.71

    A

    0256-7415(2016)04-0278-03

    10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.105

    2015-04-23

    廣東省中醫(yī)藥局課題(20132154)

    盧妙蓮(1979-),女,副主任技師,研究方向:臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化。

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