丹蔞片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠抵抗素和血管內(nèi)皮的影響

繆靜，陳潔，周鑫斌，徐曉明，毛威浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310006

丹蔞片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠抵抗素和血管內(nèi)皮的影響

繆靜，陳潔，周鑫斌，徐曉明，毛威
浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310006

目的：觀察丹蔞片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）模型大鼠血清抵抗素（Resistin）和血管內(nèi)皮的影響，探討丹蔞片對(duì)AS模型大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法：32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、他汀組、丹蔞組，每組8只。正常組大鼠喂食基礎(chǔ)飼料12周，余各組均采用高糖高脂飲食+維生素D3腹腔注射方法復(fù)制AS模型。模型組、他汀組、丹蔞組，分別給予生理鹽水、阿托伐他汀片混懸液、丹蔞片混懸液灌胃干預(yù)8周。干預(yù)結(jié)束后，行ELISA法檢測(cè)大鼠血清Resistin、內(nèi)皮素-1（ET-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）的水平。結(jié)果：①與正常組比較，模型組大鼠血清Resistin、ET-1、IL-6和TNF-α水平升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05），NO水平下降（P＜0.05）；②與模型組比較，他汀組大鼠血清Resistin、ET-1、IL-6和TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），NO水平上升（P＜0.01）；丹蔞組大鼠血清Resistin、ET-1、IL-6和TNF-a水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），NO水平上升（P＜0.01）；③他汀組與丹蔞組之間大鼠血清resistin、ET-1、IL-6、TNF-α和NO之間水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：①丹蔞片可降低AS模型大鼠血清Resistin、ET-1、IL-6和TNF-α水平，升高NO水平，減輕AS模型大鼠血管內(nèi)皮的損傷，作用與他汀類藥物相似。②丹蔞片可保護(hù)血管內(nèi)皮，其作用機(jī)制可能是通過(guò)降低血清Resistin、ET-1、IL-6和TNF-α水平，增加NO的分泌，從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整和功能的完善。

丹蔞片；動(dòng)脈粥樣硬化；抵抗素；血管內(nèi)皮損傷

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心?。╟oronary artery heart disease，CHD）的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、膽固醇脂質(zhì)的堆積、血管的慢性炎癥、平滑肌細(xì)胞異常遷移增殖為特征。其病因眾多，涉及高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖及吸煙等眾多因素。人們?cè)趯?duì)AS發(fā)病機(jī)制的長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，抵抗素（Resistin）與AS關(guān)系密切，近年來(lái)，Resistin作為一種前炎性分子的新特性被提出，Resistin可被作為促炎反應(yīng)的標(biāo)志物［1］，可促進(jìn)多種炎癥標(biāo)志物的表達(dá)［2］，誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)［3］，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并引起血管內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷及內(nèi)皮功能障礙是AS的始動(dòng)步驟。因此，降低血清Resistin水平，減少炎癥因子分泌是預(yù)防AS的重要措施之一。他汀類藥物是目前公認(rèn)的多靶點(diǎn)治療AS的藥物，具有降脂［4］、抑制炎癥反應(yīng)［5］和穩(wěn)定斑塊［6］的作用。在CHD的中醫(yī)藥防治方面，痰瘀同治取得了良好的臨床效果。丹蔞片是以瓜蔞、薤白為君藥的痰瘀同治代表方，能寬胸通陽(yáng)、化痰散結(jié)、活血化瘀，有較好的臨床療效［7］，其療效機(jī)制可能與保護(hù)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能的完整有關(guān)。本研究觀察了丹蔞片對(duì)AS大鼠血清Resistin、內(nèi)皮素-1（ET-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）水平的影響，探討丹蔞片是否具有通過(guò)降低血清Resistin水平，減少ET-1、IL-6和TNF-α分泌，增加NO的釋放，從而達(dá)到保護(hù)AS模型大鼠損傷血管內(nèi)皮的作用，抑制或延緩AS的病情進(jìn)展。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)Wistar大鼠32只，雄性，體重（160±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠在同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組：正常組，模型組，他汀組，丹蔞組，每組8只。正常組喂飼基礎(chǔ)飼料12周。余各組參考文獻(xiàn)方法［8］采用高糖高脂飲食加維生素D3腹腔注射方法復(fù)制AS模型。喂飼高糖高脂飲食4周（10%蛋黃粉、10%蔗糖、10%豬油、1.25%膽固醇、0.5%膽鹽、68.25%基礎(chǔ)飼料），同時(shí)給予維生素D3 70萬(wàn)IU/kg腹腔注射。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法①丹蔞片：由吉林康乃爾藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)成品藥粉；②阿托伐他汀片：輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：045912K；③維生素D3：四川華蜀動(dòng)物藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：CG-057。造模成功后，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算，以臨床等效劑量給藥，實(shí)施灌胃干預(yù)措施8周。模型組給予生理鹽水每天10 mL/kg灌胃，他汀組將阿托伐他汀鈣片用生理鹽水制成0.18 mg/mL濃度的混懸液，10 mL/kg/d灌胃，丹蔞組以45 mg/mL濃度的混懸液，10 mL/kg/d灌胃。

1.3試劑器材大鼠抵抗素（Resistin）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和一氧化氮（NO）ELISA試劑盒：上海西塘生物科技有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀：型號(hào)：ELX800，美國(guó)寶特；臺(tái)式冷凍多用離心機(jī)：型號(hào)：CL31R，Thermo Electron Corporation。

1.4標(biāo)本采集干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，4%水合氯醛1 mL/100 g腹腔注射麻醉，心臟取血。

1.5ELISA法檢測(cè)各指標(biāo)心臟取血后靜置30 min，待血凝，3000 r/min，離心10 min，提取血清，具體操作按ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。結(jié)果判定：在波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品OD值算出相應(yīng)的Resistin、ET-1、IL-6、TNF-α和NO濃度。

2　結(jié)果

2.1各組血清Resistin、ET-1和NO水平比較見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組血清Resistin和ET-1水平上升，NO水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，他汀組血清Resistin和ET-1水平降低，NO水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；丹蔞組血清Resistin和ET-1水平較模型組降低，NO水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）；給藥組間血清Resistin，ET-1和NO水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組血清Resistin、ET-1和NO水平比較（±s）

表1　各組血清Resistin、ET-1和NO水平比較（±s）

與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05

組別正常組模型組他汀組丹蔞組n 8 8 8 8 Resistin（ng/mL）3.311±0.180 3.348±0.238①3.254±0.208③3.222±0.188③ET-1（pg/mL）10.357±2.593 13.472±4.336②10.264±2.319③9.393±2.152③N O（μmol/L）50.260±4.585 47.517±2.435①51.066±3.120③52.965±1.941③

2.2各組血清IL-6和TNF-α水平比較見(jiàn)表2。與正常組比較，模型組血清IL-6和TNF-α水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，他汀組血清IL-6和TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；丹蔞組血清IL-6和TNF-α水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.01）；給藥組間血清IL-6和TNF-α水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組血清IL-6和TNF-α水平比較（±s）

表2　各組血清IL-6和TNF-α水平比較（±s）

與正常組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別正常組模型組他汀組丹蔞組n 8 8 8 8 IL-6（pg/mL）134.469±14.204 153.903±16.125①135.806±15.821③128.051±17.642③TN F-α（pg/mL）73.973±13.070 87.385±4.628②82.202±3.791④79.866±3.797③

3　討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的重要組成部分，既是一個(gè)內(nèi)分泌器官，也是一個(gè)激素靶器官，具有分泌生物活性物質(zhì)，主動(dòng)調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)，調(diào)控血流流動(dòng)，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，防止炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及調(diào)節(jié)脂質(zhì)的過(guò)氧化等多種生物學(xué)功能，對(duì)維持血管壁的完整性具有特殊意義。高脂血癥，高血壓，糖尿病，肥胖與吸煙等均能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損或功能障礙。Resistin是Steppan等［9］在研究新一代胰島素增敏劑-噻唑烷二酮類（TZDs）的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪細(xì)胞因子，因其可抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，具有抵抗胰島素的作用，故命名為抵抗素。在對(duì)其進(jìn)行深入研究中發(fā)現(xiàn)，Resistin與AS關(guān)系密切。AS是由一系列特異性細(xì)胞和分子參與的慢性炎癥反應(yīng)［10］，從早期的內(nèi)皮損害到易損斑塊的形成，都有大量的炎癥細(xì)胞因子參與其中，而Resistin作為一種促AS發(fā)生的炎癥因子的標(biāo)志物［11］，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，是連接炎癥反應(yīng)與AS的紐帶［12］。Resistin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有激活作用，可增加ET-1mRNA的表達(dá)［13］，并誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的釋放［14］。ET-1是公認(rèn)的強(qiáng)效內(nèi)皮源性縮血管因子，能引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。TNF-α與IL-6與AS均密切相關(guān)，可造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，參與AS病變的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究觀察了丹蔞片對(duì)AS模型大鼠血清ET-1，IL-6，TNF-α等炎癥因子的影響，發(fā)現(xiàn)AS模型大鼠上述炎癥因子水平均明顯增加，丹蔞片對(duì)Resistin、ET-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子均有顯著抑制作用，作用與阿托伐他汀相似。

NO是重要的內(nèi)源性血管舒張因子，可使血管舒張并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，其是由內(nèi)皮一氧化氮合酶（Endotheliumnitricoxidesynthase，eNOS）以左旋精氨酸為底物合成，而Resistin能引起內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性下降，減少NO的合成和釋放［15］，引起血管舒張功能受損，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本研究結(jié)果顯示，在血清Resistin水平上升的同時(shí)，血清NO水平下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］，說(shuō)明Resistin確可引起血清NO的產(chǎn)生和釋放減少。經(jīng)丹蔞片干預(yù)后，AS模型大鼠血清Resistin水平明顯下降，NO水平上升，說(shuō)明丹蔞片或可通過(guò)降低血清Resistin的水平，減少其對(duì)NO的抑制作用這一途徑，增加NO的生成及釋放，從而改善損傷血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能。

隨著政治、經(jīng)濟(jì)、生活環(huán)境發(fā)生變化，CHD的證候特征發(fā)生了變化，“因痰致瘀，痰瘀互結(jié)”逐漸成為本病重要的病理特點(diǎn)，因此痰瘀同治可能成為治療CHD的一個(gè)很好的切入點(diǎn)。丹蔞片是以瓜蔞皮、薤白為君藥，丹參、川芎、赤芍、郁金、黃芪為臣藥組成的具有寬胸通陽(yáng)，化痰散結(jié)、活血化瘀功效的痰瘀同治方。臨床研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片可以改善冠心病心絞痛患者臨床癥狀，減少發(fā)作次數(shù)，改善心電圖ST段下移程度，降低血脂水平，具有穩(wěn)定和減小粥樣斑塊及抗氧化作用［16～18］，但其實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹蔞片干預(yù)后，AS模型大鼠血清Resistin、ET-1、IL-6、TNF-α含量均有顯著減少，NO含量增加，提示丹蔞片能抑制AS模型大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，抑制或延緩AS的發(fā)生發(fā)展，這也為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥防治CHD動(dòng)脈粥樣硬化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］CuratCA， WegnerV， SengenesC， etal. Macrophagesin humanvisceral adiposetissue： increased accumulation in obesity and a source of resist in and visfatin［J］.Diabetologia，2006，49（4）：744-747.

［2］Silswal N，Singh AK，Aruna B，et al.Human resistinstimulatesthepro-inflammatory cytokinesTNF-alpha and IL-12 inmacrophages by NF-kappaB-dependent pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，334（4）：1092-1101.

［3］Verma S，Li SH，Wang CH，et al.Resistin promotes endothelia cellactivation：further evidence of adipokineendothelialinter action［J］.Circulation，2003，108（6）：736-740.

［4］Tonkin A，Aylward P，Colquhoun D，et al.Prevention of cardiovascular events and death with Pravastatin in patients with coronary heart disease and a broad range of initial cholesterol levels［J］.N EngI J Med，1998，339（19）：1349-1357.

［5］Rosenson RS.Pluripotential mechanisms of cardioprotection with H-MG-COA reductase inhibitor therapy［J］. Am J Cardiovasc Drugs，2001，1（6）：411-420.

［6］OzmenJ，BobryshevYV，LordRS，etal. Identification of dendritic cells in aortic atherosclerotic lesionsinratswithdiet-inducedhypercholesterolaemia［J］.Hi-stolHistopathol，2002，17（1）：223-237.

［7］陳新標(biāo).丹蔞片聯(lián)合低分子肝素治療不穩(wěn)定心絞痛療效觀察［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（24）：49-50.

［8］陳雋妍，毛威，倪桂寶，等.動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀互結(jié)證大鼠模型的建立［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16（26）：3789-3793.

［9］Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin links obesity to diabetes［J］.Nature，2001，409（6818）：307-312.

［10］Libby P.Inflammation in atherosclerosis［J］.Nature，2002，420（6917）：868-874.

［11］Kunnari A，Ukkola O，Paivansalo M，et al.High plasma resistin levelis associated with enhanced highlysensitive Creactive protein and leukocytes［J］.J Clin EndocrinolMetab，2006，91（7）：2755-2760.

［12］Reilly MP，Lehrke M，Wolfe ML，et al.Resistin is an inflammatory marker of atherosclerosis in humans［J］. Circulation，2005，111（7）：932-939.

［13］Verma S， Li SH， Wang CH， et al.Resistin promotes endothelial cell activation：further evidence of adipokine-endothelial interaction［J］.Circulation，2003，108（6）：736-740.

［14］Rothwell SE，Richards AM，Pemberton CJ，et al. Resistinworsenscardiacischaemia-reperfusionin jury［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，349（1）：400-407.

［15］Kougias P，Chai H，Lin PH，et al.Adipocyte-derived cytokineresistincausesendotheliadysfunctionof porcine coronary arteries［J］.Vasc Surg，2005，41（4）：691-698.

［16］吉金榮，高彩霞.丹萎片治療肥胖型冠心病心絞痛的臨床觀察［J］.光明中醫(yī)，2012，27（12）：2456-2457.

［17］周敏軍.丹蔞片治療痰瘀互阻型冠心病心絞痛患者70例臨床療效觀察［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，22（18）：98.

［18］許祥坤.丹蔞片治療痰瘀互阻型老年冠心病心絞痛的臨床療效［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（10）：5126-5127.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effect of Danlou Tablets on Resistin and Vascular Endothelial Injury in the Rat Model of Atherosclerosis

MIU Jing，CHEN Jie，ZHOU Xinbin，XU Xiaoming，MAO Wei

Objective：To observe the effect of Danlou tablets on serum resistin and vascular endothelial injury in the rat model of atherosclerosis（AS）and discuss the protective effect and possible mechanism of Danlou tablets in the rat model of AS.Methods：Thirty-two of male Wistar rats were divided into the normal group，the model group，statin group and Danlou group randomly，8 cases in each group.The rats in the normal group were fed by basal feed for 12 weeks；the rats in other groups were fed by high-sucrose-fat diet and vitamin D3 intraperitoneal injection to copy AS models.The rats in the model group，statin group and Danlou group were given respectively normal saline，suspension of atorvaststin，suspension of Danlou tablets for lavage intervention for 8 weeks.After intervention，detected the levels of rat serum resistin，endothelin-1（ET-1），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and nitric oxide（NO）.Results：Comparing with those in the normal group，the levels of serum resistin，ET-1，IL-6 and TNF-α in the model group were all increased（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05），the level of NO were dropped（P＜0.05）.Comparing with those in the model group，the levels of serum resistin，ET-1，IL-6 and TNF-α in the statin group were all dropped（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），the levels of NO were increased（P＜0.01）；the levels of serum Resistin，ET-1，IL-6 and TNF-α in the Danlou group were all dropped（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），the levels of NO were increased（P＜0.01）.The difference of serum resistin，ET-1，IL-6，TNF-α and NO between the statin group and Danlou group were not significant（P＞0.05）.Conclusion：Danlou tablets can reduce the levels of serum resistin，ET-1，IL-6 and TNF-α，and improve the levels of NO，and relieve vascular endothelial injury in AS model rats.Its effect is similar to statin drugs.Danlou tablets can protect vascular endothelial，and its mechanism is to protect structure integrity of vascular endothelia cells and function perfection by reducing the levels of serum resistin，ET-1，IL-6 and TNF-α and increasing secretion of NO.

Danlou tablets；Atherosclerosis；Resistin；Vascular endothelial injury

R972+.6

A

0256-7415（2016）04-0269-04

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.102

2015-11-12

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007C33022）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201327471）

繆靜（1984-），女，在讀博士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管病基礎(chǔ)和臨床研究。

毛威，E-mail：maoweilw@163.com。