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    大血藤總黃酮分離純化工藝研究

    2016-10-19 00:51:00王建權(quán)李奎永慈溪市中醫(yī)醫(yī)院浙江慈溪35300華東理工大學(xué)藥學(xué)院上海0037
    新中醫(yī) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:大孔黃酮提取物

    王建權(quán),李奎永.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院,浙江 慈溪 35300;.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 0037

    大血藤總黃酮分離純化工藝研究

    王建權(quán)1,李奎永2
    1.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院,浙江 慈溪 315300;2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237

    目的:研究大孔吸附樹(shù)脂分離純化大血藤總黃酮的工藝條件。方法:以蘆丁為對(duì)照品,考察大孔吸附樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的富集純化工藝。結(jié)果:采用DA201型大孔吸附樹(shù)脂,上樣吸附后,用純化水和30%乙醇除雜,再用5BV、50%乙醇洗脫,可得到總黃酮含量為69.78%的大血藤提取物。結(jié)論:DA201型大孔吸附樹(shù)脂在確定的工藝條件下,具有工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn),能得到總黃酮純度較高的大血藤提取物。

    大血藤;總黃酮;大孔吸附樹(shù)脂;分離純化

    大血藤亦被稱為大活血、血藤等,為木通科植物大血藤的干燥根莖,多以莖入藥,在我國(guó)南方地區(qū)分布廣泛,具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、清熱解毒等功效,臨床上主要用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、痛經(jīng)、腹痛等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大血藤含有蒽醌類、黃酮類、皂苷類等成分[1],現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[2~3],其含有的活性成分具有保護(hù)心肌、增加缺氧耐受力、抗菌消炎等作用,在臨床應(yīng)用較為廣泛。大血藤總黃酮為其主要活性成分,目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其分離純化工藝研究,筆者采用大孔吸附樹(shù)脂分離純化得到了總黃酮含量較高的大血藤提取物,可為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供參考。

    1 材料與儀器

    1.1材料蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定所研究院,120716-201409);HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201型大孔吸附樹(shù)脂(均為滄州寶恩化工有限公司提供);大血藤購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為木通科大血藤屬植物藤莖;甲醇(色譜純)(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司,20130320);其余試劑均為分析純。

    1.2儀器Agilent 1200系列高效液相色譜儀(Agilent 1200色譜泵,ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,Agilent 1200色譜工作站);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);KQ3200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DFT-50手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司);R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1方法

    2.1.1大血藤總黃酮的提取取大血藤藥材飲片,干燥、粉碎、過(guò)篩,取粉末約0.5 g,精密稱定,置于具塞的錐形瓶中,加40 mL甲醇,超聲提取60 min,放冷、靜置、過(guò)濾。濾渣用少量甲醇洗入錐形瓶中,加適量甲醇(總體積約40 mL),超聲提取60 min,放冷、靜置、過(guò)濾。合并兩次所得濾液,置于100 mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,即得。

    2.1.2大血藤總黃酮含量測(cè)定采用紫外-可見(jiàn)分光光度法,以蘆丁為對(duì)照品,在360 nm處測(cè)定其吸光度值,以吸光度為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=0.2078X-0.2011,R2=0.9991,大血藤提取物照該方法稀釋并測(cè)定,計(jì)算其總黃酮含量。

    2.1.3上柱液的預(yù)處理稱取大血藤藥材飲片,加10倍量50%乙醇,于80℃加熱回流提取2次,每次1 h,合并提取液,濾過(guò)、減壓濃縮,配制成適用于樹(shù)脂吸附的大血藤浸出液。

    2.2工藝參數(shù)的考察與優(yōu)化

    2.2.1大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理分別稱取HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201大孔吸附樹(shù)脂適量,乙醇溶脹24 h后回流提取12 h,除去樹(shù)脂中殘留的致孔劑等雜質(zhì)。濕法裝柱,用95%乙醇洗滌樹(shù)脂至流出液加等量水不呈現(xiàn)白色混濁為止。再用水洗至無(wú)醇味。改用5%鹽酸溶液沖洗樹(shù)脂,水洗至中性后換用2%氫氧化鈉溶液洗滌,最后水洗至中性即可。

    2.2.2大孔吸附樹(shù)脂類型的選擇取已處理好的樹(shù)脂,置100 mL三角瓶中,加入30 mL固含量為12.14 mg·mL-1的預(yù)處理液。密塞,室溫下以振蕩頻率200次/h振蕩24 h。待充分吸附后,靜置,傾出上清液,并加入適量蒸餾水洗滌樹(shù)脂。洗滌液與上清液合并,另器儲(chǔ)存。再加入100 mL95%乙醇在室溫下洗脫。測(cè)定殘留液和95%乙醇洗脫液中總黃酮含量,各種類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量及解吸率結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

    按以下公式計(jì)算吸附率(%)、吸附量(mg/mL)以及解吸率(%)。吸附率(%)=(M0-C1V1)/M0×100%;吸附量(mg/mL)=(M0-C1V1)/V0;解吸率(%)=C2V2/(M0-C1V1)×100%。其中M0為初始加入的大血藤提取物的質(zhì)量;V0為樹(shù)脂的體積;C1為殘留液中大血藤總黃酮的濃度;V1為殘留液體積(100 mL);C2為醇洗液中大血藤總黃酮的濃度;V2為醇洗液體積(100 mL)。

    表1 不同類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量 mg·mL-1

    表2 不同類型樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的解吸率 %

    由表1、表2可知:DA201樹(shù)脂對(duì)大血藤總黃酮的吸附量為最大,且解吸效果最好。故選用DA201樹(shù)脂用于大血藤總黃酮的分離純化。

    2.2.3動(dòng)態(tài)吸附條件的考察選取DA201樹(shù)脂為模型,考察不同影響因素對(duì)大血藤總黃酮吸附效果的影響。經(jīng)預(yù)處理過(guò)的樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為1 cm的玻璃柱,上樣,飽和吸附6 h后,開(kāi)始洗脫。

    2.2.3.1上樣流速對(duì)吸附率的影響上樣流速太快,大血藤總黃酮得不到充分吸附就隨上樣液流出;流速過(guò)慢雖可提高大血藤總黃酮的吸附率,但耗時(shí)較多。筆者考察了樹(shù)脂柱床體積為5 mL,流速分別為0.5、1.0、1.5 mL·min-1時(shí)對(duì)吸附率的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)流速為0.5 mL·min-1,上樣體積為濕樹(shù)脂柱床體積20倍時(shí),大血藤總黃酮基本不泄漏,而流速為1.0 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較晚,可以通過(guò)反復(fù)上樣的方法彌補(bǔ)。上樣流速為1.5 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較早。為節(jié)約上樣時(shí)間,選擇流速1.0 mL·min-1為佳。

    2.2.3.2吸附量與樹(shù)脂量的關(guān)系見(jiàn)表3。本試驗(yàn)考察了吸附液濃度為245 mg·mL-1,大血藤提取物與大孔樹(shù)脂用量的比值(m1∶m2)分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時(shí)大血藤總黃酮的吸附率。

    表3 不同的m1:m2的吸附率

    由表3可知,當(dāng)大血藤提取物與大孔樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)較合適。雖然大血藤提取物與樹(shù)脂之間質(zhì)量比為1∶25時(shí)吸附效果更好,但這與大血藤提取物與樹(shù)脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),故選取大血藤提取物與樹(shù)脂之間質(zhì)量比1∶20為最佳條件。

    2.3洗脫劑濃度及用量的確定

    2.3.1洗脫劑濃度的確定DA201樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂,大血藤總黃酮為中等極性的物質(zhì),可先用純化水除去水溶性雜質(zhì),再用不同濃度的乙醇為洗脫劑依次洗脫。乙醇的洗脫濃度梯度為:0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。結(jié)果顯示,大血藤總黃酮主要富集于70%濃度的乙醇中。故應(yīng)收集50%濃度的乙醇洗脫液。

    2.3.2洗脫劑用量的考察經(jīng)飽和吸附的樹(shù)脂,先分別用純化水和30%乙醇洗去部分雜質(zhì),均以洗脫液無(wú)色或接近無(wú)色為終點(diǎn),然后更換下一個(gè)濃度梯度。收集50%乙醇洗脫液,每2.5 BV(柱床體積)收集一次,并進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,當(dāng)洗脫劑用量為5 BV時(shí),大血藤總黃酮可基本洗脫完全。故選定洗脫劑用量為5 BV。

    2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室小試所得到的工藝參數(shù)的穩(wěn)定性,保證工業(yè)化生產(chǎn)的順利進(jìn)行,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室研究成果的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了3批中試分離純化。對(duì)50%濃度乙醇洗脫液進(jìn)行了含量測(cè)定,可得到總黃酮含量為69.78%(批次1、2、3純度均數(shù))的大血藤提取物。結(jié)果見(jiàn)表4。三批中試結(jié)果表明,所建立的DA201大孔吸附樹(shù)脂法分離純化大血藤總黃酮的方法穩(wěn)定、可靠,適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

    表4 DA201大孔吸附樹(shù)脂純化大血藤總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3 討論

    大血藤總黃酮為大血藤中較重要的活性成分,近年來(lái)有關(guān)大血藤總黃酮報(bào)道的文獻(xiàn)較多,如倪士峰等[4]研究表明,大血藤總黃酮具有清除氧自由基的作用,還可抑制細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、防治心血管疾?。桓鹈骶盏龋?]采用聚酰胺薄層層析的方法對(duì)大血藤提取物進(jìn)行分離,獲得了10余種黃酮類成分,并采用高效液相色譜法對(duì)大血藤葉片、嫩莖、葉柄等藥用部位中黃酮類成分進(jìn)行分析,初步可知大血藤葉片及嫩莖中黃酮類化合物較多。盡管大血藤總黃酮的藥理活性、化學(xué)成分分析較多,但大血藤總黃酮的分離純化研究報(bào)道極少,因而研究大血藤總黃酮分離純化工藝具有較大的應(yīng)用價(jià)值,有可能為臨床提供治療疾病的有效部位[6]。

    大孔吸附樹(shù)脂的類型、用量等對(duì)活性成分的分離純化有較大的影響,本研究前期通過(guò)靜態(tài)吸附及動(dòng)態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn),篩選得到了適合用于大血藤提取物中總黃酮富集的樹(shù)脂類型,即中等極性的DA201樹(shù)脂,同時(shí)對(duì)樹(shù)脂的用量與分離純化效果的相關(guān)性進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示,樹(shù)脂的用量越大,越有利于其吸附總黃酮,即吸附率越高,但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需充分考慮分離純化工藝的經(jīng)濟(jì)性、可行性、高效性等,因樹(shù)脂用量過(guò)大會(huì)消耗過(guò)多的洗脫溶劑,部分雜質(zhì)亦會(huì)進(jìn)入洗脫液,導(dǎo)致大血藤總黃酮含量降低,間接降低了樹(shù)脂的分離純化效果[7],故本研究綜合各方面影響大血藤總黃酮純度的因素及工業(yè)化生產(chǎn)的效率,篩選最適宜的樹(shù)脂和大血藤提取物的比例,以便提高工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮的效率。

    本研究最終確定了大血藤總黃酮的分離純化條件為:大血藤提取物經(jīng)初步后,用已處理好的DA201型大孔吸附樹(shù)脂將大血藤提取物進(jìn)行吸附,待吸附完成后,先用純化水及30%乙醇除雜,再用5BV、50%乙醇洗脫,收集洗脫液,過(guò)濾并濃縮干燥即得大血藤總黃酮。為保證工藝的可行性,在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了三批中試試驗(yàn),結(jié)果顯示該分離純化工藝具有工藝穩(wěn)定、可靠,適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn),為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供了參考。

    [1]馬瑞麗,于小鳳,徐秀泉,等.大血藤的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2012,31(6):1-5.

    [2]丁越,張永,丁文平,等.HPLC測(cè)定大血藤藥材中綠原酸的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(4):99-102.

    [3]劉宇文,殷紅妹,鄒耀華.HPLC同時(shí)測(cè)定大血藤中紅景天苷和綠原酸的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2012,29(10):947-949.

    [4]倪士峰,傅承新,吳平.大血藤化學(xué)成分及藥學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源,2004,23(4):8-10.

    [5]葛明菊,金則新,李鈞敏,等.大血藤黃酮類化合物組成的初步研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,19(4):382-386.

    [6]衛(wèi)建琮,李華峰,喬華,等.中藥蒲公英花中總黃酮的分離純化研究[J].中國(guó)藥物與臨床,2014,14(1):19-21.

    [7]趙惠茹,馬姣姣,魏彩霞,等.大孔吸附樹(shù)脂分離純化蒲公英中總黃酮的工藝研究[J].中國(guó)藥業(yè),2014,23(12):81-83.

    (責(zé)任編輯:劉淑婷)

    R284.2

    A

    0256-7415(2016)04-0275-02

    10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.104

    2015-12-19

    王建權(quán)(1979-),男,主管中藥師,主要從事中藥研究工作。

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