39例成人急性乙型肝炎患者血清HBV基因變異檢測及其臨床意義探討*

杜曉菲，馬麗娜，柳雅立，魏飛力，吳云，陳新月

39例成人急性乙型肝炎患者血清HBV基因變異檢測及其臨床意義探討*

杜曉菲，馬麗娜，柳雅立，魏飛力，吳云，陳新月

目的了解成人急性乙型肝炎患者流行的病毒基因型及基因變異情況。方法在2010年12月～2014年1月北京佑安醫(yī)院收治39例急性乙型肝炎患者，采用直接基因測序法和平行等位基因特異性檢測技術(shù)檢測HBV基因型、P區(qū)、S區(qū)、前C區(qū)（PreC）和基本核心啟動子（BCP）區(qū)序列。結(jié)果在39例患者中，成功測序35例。35例急性乙型肝炎患者感染HBV B基因型12例（36.4%），C基因型21例（57.6%，D基因型2例（6.0%）；通過直接測序法和PASS法均檢測到同1例患者存在A181S耐藥變異，變異病毒占準(zhǔn)種池比例達(dá)100%；直接測序法檢測到1例患者存在S區(qū)S132F和W172C變異；1例患者存在PreC/BCP區(qū)G1896A和T1758C變異。結(jié)論急性乙型肝炎患者感染病毒基因型與文獻(xiàn)報道的慢性乙型肝炎患者感染病毒基因型分布一致，以C型和B型為主，存在P區(qū)、S區(qū)和PreC/BCP區(qū)變異可能，未見不同病毒株感染引起轉(zhuǎn)歸的不同。

急性乙型肝炎；基因型；變異

已有關(guān)于耐藥變異病毒引起急性乙型肝炎（Acute hepatitis B，AHB）[1～4]、抗病毒藥物相關(guān)的疫苗逃避變異病毒（Antiviral drug-associated potential vaccine escape mutant，ADAP-VEMS）感染者再次接種乙肝疫苗而產(chǎn)生HBsAb成功的報道[5,6]。本文對我院收治的明確診斷為AHB患者進(jìn)行HBV S區(qū)、P區(qū)、前C區(qū)（PreC）和基本核心啟動子（Basal core promoter，BCP）區(qū)基因序列測定，了解有無變異病毒，觀察患者臨床特點及轉(zhuǎn)歸情況。

1　資料與方法

1.1研究對象2010年12月至2014年1月北京佑安醫(yī)院國際醫(yī)療部收治的AHB患者39例，AHB診斷參照2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會和肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)［7］，同時本研究將其定義為：既往無乙型肝炎病毒感染史（發(fā)病前半年內(nèi)體檢HBsAg陰性），無乙型肝炎家族史，臨床表現(xiàn)具有急性肝炎的癥狀和體征，實驗室檢查血清轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，或伴有膽紅素升高，病原學(xué)檢測血清HBsAg、HBeAg、HBV DNA、抗-HBc IgM陽性。排除其他嗜肝病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染及酒精性、自身免疫性肝病等原因引起的急慢性肝損害。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，受試者簽署知情同意書。

1.2血清HBV DNA檢測和基因測序使用QIAamp DNA Blood mini Kits（美國Qiagen公司，貨號為51106）提取血清HBV DNA，采用ntPCR技術(shù)擴增目的基因，采用雙脫氧終止法對ntPCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。HBV P區(qū)序列測定使用引物1：54-75 CTCGTGGTGGACTTCTCTC；引物2：1267-1287 GC AAAGCCCAAAAGACCCAC；引物3：253-271 TTCC TGCTGGTGGCTCCAgTTC；引物4：1000-1019 TGCT AGGAGTTCCGCAGTATG；PreC/BCP區(qū)測序使用引物1：1604-1623 TCGCATGGAGACCACCGTGA；引物2：2060-2076 ATAGCTTGCCTGAGTGC；引物3：1653-1672 CATAAGAGGACTCTTGGACT；引物4：1957-1974 GGAAAGAAGTCAGAAGGC。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，應(yīng)用ABI 3730XL測序儀進(jìn)行雙向序列測定。應(yīng)用ContigExpress和Bioedit軟件，對測序結(jié)果進(jìn)行拼接和校正。將結(jié)果提呈至斯坦福大學(xué)耐藥分析網(wǎng)頁（http：//hivdb.stanford. edu/HBV/HBVseq），參照其version 0.8耐藥基因庫進(jìn)行虛擬表型分析，對不同位點的核苷（酸）耐藥變異進(jìn)行判定。

1.3平行等位基因特異性序列檢測（Parallel allelespecific sequencing assay，PASS）PCR擴增引物和測序引物由美國Integrated HBV DNA Technologies（IDT）公司合成。應(yīng)用蛋白酶K-苯酚抽提法提取血清HBV DNA。采用PASS法檢測HBV耐藥位點。PASS技術(shù)是應(yīng)用聚合酶技術(shù)分析病毒基因組。首先擴增一段HBV P區(qū)1.1 kb基因片段，包含了主要耐藥位點，一個丙烯?；囊锟赏ㄟ^共價結(jié)合作用固定在聚丙烯酰胺凝膠上，因此在進(jìn)行膠內(nèi)PCR時，擴增的產(chǎn)物僅能積聚到單個HBV DNA模板附近。在擴增后，游離的DNA鏈可通過變性洗滌，固相的HBV DNA鏈與序列互補的引物雜交，而引物的3'端直接位于產(chǎn)生耐藥的單核苷酸突變位點的上游。在不同熒光素標(biāo)記的單核苷酸存在的情況下，引物進(jìn)行單核苷酸延伸，可帶上不同顏色熒光標(biāo)記的堿基。然后，通過微距陣掃描成像區(qū)分出顏色不同的野生型和突變型，同一塊凝膠循序性地用不同的引物對耐藥位點進(jìn)行檢測。本次研究檢測15個主要的耐藥位點，分別為L80V、L80I、L180M、V173L、A181T、A181V、A181S、T184G1、T184G2、M2 04V、M204I、A194T、S202I、N236T、M250V。

1.4統(tǒng)計方法應(yīng)用SPSS21.0軟件（IBMInc，Chicago，IL）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。連續(xù)變量檢測前進(jìn)行正態(tài)性檢驗，將非正態(tài)性資料轉(zhuǎn)換成正態(tài)后再檢驗。對符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，對偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。兩組間連續(xù)變量的比較采用t檢驗和秩和檢驗。計數(shù)資料采用Chi-square檢測。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P值小于0.05。

2　結(jié)果

2.1一般情況39例AHB患者均為漢族，男性25例，女性14例；平均年齡為37.6±12.9歲（18～66歲）。13例為性接觸傳播，2例有看牙醫(yī)經(jīng)歷，其余24例患者感染途徑不明?；颊呷朐簳r谷丙轉(zhuǎn)氨酶為（1655.7±451）U/L，總膽紅素（146.8±74.1）μmol/L，血清HBV標(biāo)志物轉(zhuǎn)換時間如表1（以患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀的時間為疾病起點）。

2.2感染HBV基因分型情況對39例患者入院時留取血清，進(jìn)行HBV基因測序，其中35例成功完成擴增測序。根據(jù)S區(qū)核苷酸序列異源性是否≥4%，判斷基因型，結(jié)果B基因型為36.4%（12/35），C基因型為57.6%（21/35），D基因型為6.0%（2/35）。

2.3P區(qū)基因變異與病情經(jīng)PCR擴增直接測序法檢測，在35例AHB患者中，有1例（2.9%）患者感染的HBV存在基因耐藥變異，即為rtA181S位變異（圖1），其感染HBV為B基因型，該患者男性38歲，臨床診斷符合急性無黃疸型肝炎，發(fā)病1周入院。入院后，血清ALT峰值為1784.6 U/L，TBIL20.4μmol/L，HBV DNA 5.71×104IU/ml，HBsAg 4647 IU/ml。隨著肝功能指標(biāo)好轉(zhuǎn)，相繼出現(xiàn)血清HBV DNA消失，HBeAg/HBeAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換和HBsAg/HBsAb血清學(xué)轉(zhuǎn)換。病程7周，臨床痊愈。該患者性伴侶為慢性乙型肝炎患者，已服用阿德福韋酯治療2年，但處于病毒學(xué)突破狀態(tài)（初始治療時血清HBV DNA為2.3×107IU/ml，治療24周時血清HBV DNA降至5.63×102IU/ml，但在3月前復(fù)查升至4.8×105IU/ml）。進(jìn)一步采用PASS法復(fù)查并觀察該AHB患者感染的HBV rt A181S變異病毒在準(zhǔn)種池中所占比例，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)RT A181S變異，未見其他RT區(qū)變異，與直接測序檢測結(jié)果一致，變異病毒株在準(zhǔn)種池中占100%（圖2）。

表1　39例AHB患者血清HBV標(biāo)記物轉(zhuǎn)換時間（w）

圖1　P區(qū)變異患者RT區(qū)基因序列可見A181S變異

圖2　P區(qū)變異復(fù)檢血清HBV DNA經(jīng)PASS進(jìn)行不同耐藥位點檢測，該圖為A181位點檢測結(jié)果，圖中紅色斑點為變異病毒株，綠色斑點為野毒株，可見該位點無野毒株，均為變異株

2.4S區(qū)測序情況在35例AHB患者中，檢測到1例患者感染的HBV存在S區(qū)基因變異，變異位點為I110L、S132F和W172C（圖3）。該患者與前述存在P區(qū)變異者為同一患者。

圖3　S區(qū)變異患者基因序列可見I110L、S132F和W172C變異

2.5PreC/BCP區(qū)測序情況在35例AHB患者中，檢測到1例患者感染的HBV同時存在前C區(qū) G1896A和BCP區(qū)T1758C變異。該患者男性47歲，感染途徑不明。發(fā)病第5天入院，入院時血清HBeAg陰性。ALT峰值為4863.4 U/L，TBIL為169 μmol/L，HBV DNA為9.8×103IU/ml，病毒基因型為C型。起病8周后肝功能恢復(fù)正常，第6周血清HBsAg轉(zhuǎn)陰，第11周HBV DNA檢測不到，病程11周。

3　討論

有文獻(xiàn)報道AHB患者HBV基因型可能因傳播途徑不同而不同。在日本，通常以B型和C型為主，但近年A基因型比例在明顯上升，并認(rèn)為與性傳播途徑感染有關(guān)［8-12］。本組在有明確傳播途徑的患者也以性傳播為主，但感染病毒基因型無特殊，與其他中心的研究報道一致［13-15］，提示性傳播為AHB的主要感染途徑。近年先后有在AHB患者中檢測到耐藥變異病毒株的報道［3，16-18］，其檢出率約占2%～7%，但未報道耐藥變異株在準(zhǔn)種池中所占比例，也極少涉及耐藥變異病毒感染患者的感染途徑及轉(zhuǎn)歸的追蹤。雖然目前現(xiàn)有資料提示耐藥變異病毒在急性HBV感染中的比例不高，但作為新的、初始即耐藥的傳染源在流行病學(xué)上可能具有重要的意義。181位點作為一個共享的耐藥位點，一旦出現(xiàn)耐藥變異，將引起ADV、LAM、LDT的原發(fā)性耐藥，并降低TDF的敏感性。

我們發(fā)現(xiàn)1例患者感染的HBV同時存在S區(qū)S132F和W172C變異。S132F變異位于α決定簇第一環(huán)內(nèi)（124～137AA），可能導(dǎo)致HBsAg與相應(yīng)抗體的結(jié)合力明顯下降［19］，但該患者預(yù)后好，提示S132F變異非主要影響抗體結(jié)合力的位點，也可能變異毒株為非優(yōu)勢株而被自然淘汰。S區(qū)α決定簇變異株主要傳播途徑主要經(jīng)母嬰垂直傳播，罕見水平傳播，對于該患者感染的S132F變異株是否為水平傳播引起，需追蹤其性伴侶感染的HBV基因序列，以進(jìn)一步明確?？紤]S區(qū)W172C變異為rtA181S突變導(dǎo)致的，使得HBsAg截短。近年體外細(xì)胞和動物實驗結(jié)果證實HBsAg截短變異有潛在的致癌作用，但至今尚無明確的臨床研究證實抗病毒治療耐藥相關(guān)突變與致癌性有關(guān)。長期抗病毒治療引起的病毒突變，特別是引起前S與S區(qū)突變的潛在致癌性值得進(jìn)一步研究。目前關(guān)于ADAP-VEMS感染疫苗免疫人群病例報道較少［6］，尚不清楚免疫預(yù)防接種和抗病毒治療兩者聯(lián)合是否會加速ADAP-VEMs在人群中的傳播。在臨床上，有必要進(jìn)行ADAP-VEMs監(jiān)測，因為無論是乙肝免疫球蛋白或是主動免疫均不能阻止ADAP-VEMs的母嬰傳播。一旦嬰兒被傳播，后續(xù)治療將更復(fù)雜。

在本研究中另檢測到1例患者感染的HBV同時存在PreC區(qū)G1896A和BCP區(qū)T1758C變異。大量研究表明HBV PreC/BCP區(qū)變異或聯(lián)合變異可造成HBeAg表達(dá)下降或停止，但HBV仍然能復(fù)制和傳播。該患者入院時HBeAg即為陰性，結(jié)合其病毒測序發(fā)現(xiàn)存在PreC/BCP變異，推測可能其感染的病毒即為變異病毒。PreC/BCP變異的意義未完全明確，研究提示HBeAg陰性和PreC區(qū)（G1896A、G1899A）變異可能與重型乙型肝炎和暴發(fā)性乙型肝炎（FHB）的發(fā)生有關(guān)［20］。

本組39例AHB患者臨床特征及基線無治療干預(yù)的血清病毒基因測序結(jié)果提示P區(qū)、S區(qū)、PreC/BCP區(qū)變異病毒均可造成傳播，最終臨床轉(zhuǎn)歸好。但因病例數(shù)少，尚不能確定其慢性化或重癥化比率。

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（收稿：2016-04-15）

（本文編輯：陳從新）

Hepatitis B viral genotypes and gene mutations in 39 adult patients with acute hepatitis B

Du Xiaofei，Ma Lina，Liu Yali et al.
Department of International Medical Service，You'an Hospital，Capital Medical University，Beijing 100069，China

ObjectiveTo investigate the prevalent viral genotypes and possible gene mutation in adults with acute hepatitis B（AHB）.MethodsSerum samples of 39 patients with AHB admitted in our hospital were collected between December 2012 and January 2014.Viral genotypes and sequences of P region，S region，Pre C region and basic core promoter（BCP）were detected by direct sequencing and parallel allele specific sequencing（PASS）.Results35 out of 39 patients with AHB were sequenced successfully.Genotype distribution in these 35 cases was as follows.Genotype B accounted for 36.4%（12/35），genotype C for 57.6%（21/35），and genotype D for 6.0%（2/35）；A181S drug resistance mutation was found in one patient by both sequencing methods，while S132F and W172C mutations in S region as well as G1896A andT1758C mutations in PreC/BCP regions were noticed by direct sequencing in two different cases，respectively.ConclusionsViral genotype distribution of common genotype C and B in patients with AHB is not different in patients with CHB.Patients infected with P region，S region or PreC/BCP region mutants might have similar prognosis as patients infected with wild HBV.

Acute hepatitis B；Genotype；Mutation

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.004

“十二五”國家科技重大專項（編號：2013ZX1002002-006）；首都臨床特色應(yīng)用研究與成果推廣項目（編號：Z151100004015181）；北京市衛(wèi)生和計劃生育委員會科技成果和適宜技術(shù)推廣項目（標(biāo)號：TG-2015-020）

100069北京市首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院國際醫(yī)療部

杜曉菲，女，36歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝病診療工作。E-mail：dxiaofei80@sina.com

陳新月，E-mail：chenxydoc@163.com