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    Ag-NORs 與人頭發(fā)毛囊細胞活性的研究

    2013-09-11 08:42:38吳安花向玲麗葉合生胡琦楊粵軍
    關(guān)鍵詞:核仁黑發(fā)核糖體

    唐 文,吳安花,向玲麗,葉合生,胡琦,楊粵軍

    (湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410013)

    1975年,Goodpasture和Howell 等應(yīng)用銀氨法特異地染色核仁形成區(qū),證實銀染的位置是染色體上核糖體基因(rDNA)的位置。此后進一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA,也不是rRNA,而可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì),即和rRNA 轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白(Ag-NORs)是一種酸性非組蛋白C23,在rDNA 轉(zhuǎn)錄活性中起重要調(diào)控作用。核仁組成區(qū)銀染強度反映了rDNA 轉(zhuǎn)錄活性水平,與細胞增殖活性密切相關(guān)[1],已被不少學(xué)者用于腫瘤的分級和癌前病變的診斷檢測,對于良惡性病變的鑒別診斷價值很大[2],有人用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白這個技術(shù)對比檢測良、惡性骨腫瘤細胞進行檢測[3],也有實驗室用此技術(shù)測量眼組織的活性[4];還有醫(yī)生以核仁形成區(qū)銀染蛋白的指標評價腫瘤患者免疫狀況[5]。我們的實驗是采用不同人群的毛囊細胞,用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白檢測活性,找到他們之間的差異。為進一步研究毛囊細胞活性與毛發(fā)的生長的關(guān)系提供基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 標本選擇

    年輕男女,小孩,老年男女各50人帶毛囊細胞的毛發(fā)。

    1.2 染色液的制備

    2%的白明膠液:取2g 明膠溶于1%甲酸水溶液100mL中混勻。50%硝酸銀水溶液。

    1.3 方法

    用鑷子取毛囊細胞的頭發(fā)2~3 根置載玻片中央,加2~3 滴40%醋酸液,室溫放置10 分鐘左右,使毛囊軟化,用刀片刮下毛囊細胞,棄去頭發(fā),用刀尖或針尖將毛囊細胞分散并均勻涂于載玻片中央,在酒精燈上遠火干燥;加2~3 滴固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),固定15 分鐘,自然干燥;加5N 鹽酸2~3滴,靜置10 分鐘;用蒸餾水沖去蓋玻片及多余染液,自然晾干;將玻片標本置入下鋪潮濕吸水紙的容器中,容器放入37℃水浴箱;在標本上加染色液2 滴,用洗耳球吹勻,蓋下水浴箱蓋,37℃15 分鐘(此步一定要避光)。

    取出標本用蒸餾水充分沖洗,干燥后,即可鏡檢觀察。觀察分析:在顯微鏡下可見間期核和中期分裂相的染色體被染成黃色,核仁被染成黑色,某些染色體上有銀染黑點,即核仁形成區(qū)。AgNOR 計數(shù) 按Crocker 推薦方法[6]油鏡下隨機數(shù)1100 個毛囊細胞,計數(shù)每個細胞核內(nèi)AgNOR 顆粒數(shù),求出平均值。

    2 結(jié)果

    結(jié)果顯示,不同年齡,不同性別,以及頭發(fā)的黑白不同AgNORs 顆粒數(shù)量不同,而且分布也不相同。通過大量實驗大量圖片的比較發(fā)現(xiàn),黑發(fā)毛囊細胞中核仁銀染著色比白發(fā)毛囊細胞中核仁銀染顏色要深;而部分老年白發(fā)毛囊細胞中可無銀染核仁;成人毛囊細胞中核仁體積較小孩毛囊細胞中核仁體積小。

    AgNOR 顆粒計數(shù):男性組每個細胞核內(nèi)通常只見1~2 個圓形的黑色銀染小顆粒,可見3 個,平均1.28±0.47。女性組細胞核內(nèi)銀染顆粒數(shù)目較多,常為2 個,可見3~4 個,平均1.88±0.33。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理每個細胞核內(nèi)AgNOR 顆粒平均數(shù)在男女老少及白發(fā)與黑發(fā)之間,見圖1。統(tǒng)計的毛囊細胞銀染核仁數(shù)見表1。

    3 討論

    Howell 認為NOR的銀可染性反映了rRNA 基因的活性。只有有轉(zhuǎn)錄活性或已經(jīng)轉(zhuǎn)錄過的,并且其上仍有殘余的與RNA 相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的核仁形成區(qū)才能被銀染色。沒有銀染粒的NOR 可能意味著rDNA 順反子不轉(zhuǎn)錄rRNA,即這些位點沒有與rRNA 相聯(lián)系的銀可染的蛋白質(zhì)。銀染法是目前表征rDNA 基因功能的一個準確的方法。人類核糖體RNA 基因位于5 對近端著絲點染色體短臂的次縊痕處,即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中不是所有核仁形成區(qū)均被銀染,其范圍大約4-10 個。應(yīng)用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA 基因的活動。因此,應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)(Ag-NOR)技術(shù),可以分析有活性的rRNA 基因的動態(tài)變化。

    圖1 發(fā)毛囊細胞核中AgNOR 顆粒

    表1 不同人群毛囊細胞活性統(tǒng)計表

    本文觀察到,老年白發(fā)毛囊細胞的活性最低,年輕男女的毛囊細胞活性最強,年輕男女之間活性差別不大。各個不同人群毛囊細胞活性比較分別是:年輕女黑發(fā)>年輕男黑發(fā)>年輕男白發(fā)>老年黑發(fā)>年輕女白發(fā)>小孩黑發(fā)>老年白發(fā)。

    Ag-NORs 是位于某些染色體上特殊部位的核糖體基因rDNA,通過其轉(zhuǎn)錄而形成核糖體RNA,在蛋白質(zhì)合成中起極其重要的作用。研究表明,Ag-NORs 可能就是調(diào)節(jié)rDNA 轉(zhuǎn)錄的聚合酶Ⅰ的亞單位,起保持rDNA 鏈伸展的作用,對核糖體的形成及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要,可作為rDNA轉(zhuǎn)錄活性的標志及蛋白質(zhì)合成的活躍狀態(tài),來反映核仁結(jié)構(gòu)和功能的變化[7]。Ag-NORs 數(shù)目與細胞動力學(xué)、染色體核型中帶有NORs 數(shù)目及細胞周期有著密切的關(guān)系[8]。

    毛囊細胞是決定頭發(fā)生長、濃密程度的關(guān)鍵。普通人的毛發(fā)每28~30天為一個更新周期,受外環(huán)境及年齡等因素的影響,毛囊非常容易壞死萎縮,導(dǎo)致嚴重的脫發(fā)問題。科學(xué)家經(jīng)過多年的研究,發(fā)現(xiàn)只要再次激活萎縮受損的毛囊,頭發(fā)就能得到重生。而我們用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白(Ag-NORs),測量男女老少之間、白發(fā)與黑發(fā)之間的毛囊細胞活性,發(fā)現(xiàn)不同人群之間毛囊細胞活性的變化,為進一步研究毛發(fā)的生長提供基礎(chǔ)。

    [1]plotton D,Menger M,Jeannesson P.Improvement in the staining visuacization of the argyrophilic proteins of nuceloar organizer regions at the optical level [J].Histochem J,1986,18:5-14.

    [2]林其焯,陳立奇,吳衛(wèi).外周淋巴細胞脫氧核糖核酸蛋白體轉(zhuǎn)錄活性分析[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志,1996,19 (4),220-222.

    [3]齊繼峰,海涌,馬華松.核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白對良、惡性骨腫瘤檢測的臨床意義[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2001,4,400.

    [4]鐘一聲,王康孫.眼組織AgNOR 染色及其意義[J].眼科新進展,2000,03,181-183.

    [5]孫巍,萬文徽,朱軍,楊江穎,金山.以核仁形成區(qū)銀染蛋白等指標評價腫瘤患者免疫狀況的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2003(23),4,270-274.

    [6]How should we count AgNORs Proposale for a standarized approach,Crocher J,Boldy DA,Egan MJ.[J].J Pathol,1989,158(3):185.

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    [8]Underwood JCE,Giri DD.Nucleolar organizer region as diagnostic discrimonants for malignancy [J].J pathol,1988,155(2):95-96.

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