前列癃閉通片的定性定量方法研究

管 燕 ,肖 遐

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科,湖南 長(zhǎng)沙 410005;2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

前列癃閉通片由前列癃閉通膠囊劑型改革而來(lái)[1]，由淫羊霍、黃芪、虎杖、枳殼、桃仁等十一味中藥組成。具有益氣溫陽(yáng)，活血利水功效。用于腎虛血瘀所致癃閉，癥見(jiàn)尿頻，排尿延緩、費(fèi)力，尿后余瀝，腰膝酸軟；前列腺增生見(jiàn)上述證候者。因膠囊制備用的提取物為浸膏，膠囊劑在使用、存放過(guò)程中容易吸濕。不利于藥效的發(fā)揮。故將其改為片劑后，采用薄膜包衣工藝，使產(chǎn)品的防潮性能大大提高，能有效地保障產(chǎn)品的療效，并可增加臨床用藥的選擇性，方中黃芪具有補(bǔ)氣，利尿，抗病原微生物的作用[2]；淫羊藿對(duì)病原微生物有殺滅或抑制作用，有促進(jìn)尿液分泌的作用[3]，為了更好的控制本片劑的質(zhì)量，本文采用薄層色譜法對(duì)方中黃芪、虎杖、枳殼進(jìn)行定性鑒別，用HPLC 法對(duì)淫羊霍中有效成分淫羊霍苷進(jìn)行含量測(cè)定，為該制劑建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC－10ATvp 高效液相色譜儀；HW2-000 色譜工作站。日本SHIMADZU CIV-240IPC 紫外分光光度計(jì)；BO211D 電子分析天平（西德Sartorious）。

試藥：前列癃閉通片（自制），各陰性對(duì)照品（自制），黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品、虎杖對(duì)照藥材柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；試劑：乙腈均為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 黃芪的薄層鑒別試驗(yàn)

取本品10 片，除去包衣后，研成細(xì)粉，加甲醇40mL，加熱回流2 小時(shí)，濾過(guò)，濾渣用10mL 甲醇洗滌，洗液并入濾液中，水浴濃縮至約10mL，置已處理好的中性氧化鋁柱中，用40%甲醇50mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0mL 使溶解，加水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20mL，合并正丁醇液，加氨試液振搖提取2 次，每次20mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為供試品溶液[4]。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL 含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取除黃芪外的其他處方量藥材，按制備工藝制成缺黃芪的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010 版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)[5]，吸取上述三種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置分層的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；缺黃芪的陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 虎杖的薄層鑒別試驗(yàn)

取本品10 片，除去包衣后，研成細(xì)粉，加乙醇30mL，浸漬2 小時(shí)，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)右掖?mL 使溶解，作為供試品溶液。另取虎杖對(duì)照藥材1g，加乙醇15mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010 版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正已烷-醋酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 枳殼的薄層鑒別試驗(yàn)

取本品5 片，除去包衣后，研成細(xì)粉，加水5mL濕潤(rùn)，加正丁醇30mL 超聲提取40 分鐘，濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為供試品溶液。另取，加甲醇制成每1mL 含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010 版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以醋酸乙酯-甲醇-水-二乙胺（10∶1 .7∶1.3∶0.3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 黃芪的薄層色譜

圖2 虎杖的薄層色譜

圖3 枳殼的薄層色譜

3 含量測(cè)定

本品中含淫羊藿，其功效為補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，其主要有效成分是淫羊藿苷，故參照中國(guó)藥典2010年版一部淫羊藿項(xiàng)下淫羊藿苷的含量測(cè)定方法，對(duì)本品中淫羊藿苷的含量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，缺淫羊藿的陰性溶液無(wú)干擾，且樣品分離效果好。經(jīng)方法學(xué)考察，本含量測(cè)定方法結(jié)果較好，方法可行。經(jīng)測(cè)定十批成品，其平均含量為0.45mg/片，故暫規(guī)定本品每片中含淫羊藿苷不得少于0.36 mg。

3.1 色譜條件

色譜柱：C18（Microsorb-MV 100-5 250mm×4.6mm，5μm）

流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（26：74）

檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm

流速：1.0mL/min。

在選定條件下，淫羊藿苷峰與樣品中其它組分色譜峰可達(dá)基線分離，且與其它相鄰色譜峰分離度大于1.5；按淫羊藿苷峰計(jì)算，理論板數(shù)在2000以上。

3.2 供試品溶液的制備

參照中國(guó)藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，本品用稀乙醇為提取溶媒進(jìn)行超聲提取，現(xiàn)對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行考察，方法如下。

取本品研成細(xì)粉，取三份各約0.4g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，分別精密加入稀乙醇20ml，稱(chēng)定重量，第一份超聲處理（120W，40KHz）15 分鐘、第二份超聲處理30 分鐘、第三份超聲處理45 分鐘，放冷，稱(chēng)定重量，加稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10μl，注入液相色譜儀中，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取時(shí)間考察結(jié)果

結(jié)果表明：超聲處理15 分鐘時(shí)，樣品中的淫羊藿苷提取不完全，超聲處理30 分鐘與45 分鐘時(shí)，其含量相當(dāng)，均可將樣品中的淫羊藿苷提取完全，因此確定超聲處理時(shí)間為30 分鐘。

供試品溶液制備方法：取本品10 片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取細(xì)粉0.4g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入稀乙醇20ml，稱(chēng)定重量，超聲處理（120W，40KHz）30 分鐘，放冷，稱(chēng)定重量，加稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

3.3 陰性樣品溶液的制備

取除淫羊藿外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺淫羊藿的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺淫羊藿的陰性樣品溶液。

3.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL 含0.025mg的溶液，即得。

3.5 專(zhuān)屬性考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液色譜中，在與淫羊藿苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上有相應(yīng)峰，而缺淫羊藿陰性溶液色譜中無(wú)此峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾，對(duì)照品、供試品、陰性樣品色譜圖分別見(jiàn)附圖。

圖4 淫羊藿苷對(duì)照品HPLC 色譜圖

圖5 前列癃閉通片HPLC 色譜圖

圖6 缺淫羊藿陰性樣品HPLC 色譜圖

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為0.1025mg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液（精密稱(chēng)取淫羊藿苷對(duì)照品10.25mg 置于100mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得）2、4、6、8、10mL，分別置25mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μL 進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積積分值，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A＝881410.98×C-1173.3，r＝0.9999。結(jié)果表明淫羊藿苷檢測(cè)濃度在0.08～0.41μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份（批號(hào)20111125）供試品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定。結(jié)果，RSD=0.86%(n=5)，表明本方法精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取同一份（批號(hào)20111125）供試品溶液10μl，于0、3、6、9、12 小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定。結(jié)果，RSD=0.86%(n=5)，表明供試品溶液在12 小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)20111125）五份，按上述條件，平行處理并測(cè)定（n=2）。結(jié)果，RSD=0.95%(n=5)，表明本方法重復(fù)性好。

3.10 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量為1.1373mg/g（批號(hào)20111125）樣品約0.2g，共六份，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品溶液（0.1025mg/mL）2mL，即0.2050mg，再加入稀乙醇18mL，按上述含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，本方法加樣回收率好（樣品進(jìn)樣量約為0.22μg，在線性范圍內(nèi)）。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

3.11 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品，分別按＂3.2＂項(xiàng)下方法制成供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，并計(jì)算淫羊藿苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=10）

4 討論

供試品溶液的制備，本品用稀乙醇為提取溶媒進(jìn)行超聲提取，現(xiàn)對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果表明：超聲處理15 分鐘時(shí)，樣品中的淫羊藿苷提取不完全，超聲處理30 分鐘與45 分鐘時(shí)，其含量相當(dāng)，均可將樣品中的淫羊藿苷提取完全，因此確定超聲處理時(shí)間為30 分鐘。參照中國(guó)藥典2010年版一部淫羊藿項(xiàng)下淫羊藿苷的含量測(cè)定方法，對(duì)本品中淫羊藿苷的含量進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，缺淫羊藿的陰性溶液無(wú)干擾，且樣品分離效果好。經(jīng)方法學(xué)考察，本含量測(cè)定方法結(jié)果較好，方法可行。經(jīng)測(cè)定十批成品，片重0.4 克，其淫羊藿苷平均含量約為0.45 mg/片，按約80%折算，暫規(guī)定本品每片中含淫羊藿苷不得少于0.36mg。

[1]國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編，內(nèi)科腎系分冊(cè)「S」.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：876.

[2]劉克敏，劉振玉.黃芪的藥理作用及其在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用「J」.現(xiàn) 代中 西 醫(yī) 結(jié) 合 雜 志,2005,14 (17)：2346-2347 -2349.

[3]陳營(yíng)鎊，劉峰.淫羊藿的研究進(jìn)展「J」.陜西中醫(yī),2001,22(10)：46.

[4]呂武清主編.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別「M」.人民衛(wèi)生出版社，1997：288,521.

[5]中華人民共和國(guó)藥典（2010 版），一部「S」.2010 ：附錄32.