舌鱗狀細(xì)胞癌不同浸潤方式增殖性研究

高志彪，呼海燕，王原明，白振西，楊　蘭

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

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舌鱗狀細(xì)胞癌不同浸潤方式增殖性研究

高志彪1，呼海燕1，王原明1，白振西1，楊蘭2

(1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

目的探討舌鱗狀細(xì)胞癌(下稱舌癌)不同浸潤方式增殖性差異及臨床意義。方法將43例舌癌蠟塊進(jìn)行浸潤方式分型,以Ki67表達(dá)、S期細(xì)胞比例(SPF)等反映腫瘤細(xì)胞增殖活性為觀察指標(biāo)，分別采用免疫組化SP法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測舌癌不同浸潤方式Ki67的表達(dá)情況和細(xì)胞周期中不同S期細(xì)胞比例。結(jié)果Ki67的表達(dá)與腫瘤的浸潤方式有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式的舌癌細(xì)胞Ki67表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ型(P均<0.05)，且臨床上易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；舌癌不同浸潤方式SPF各不相同，隨著浸潤分型的進(jìn)展SPF逐漸上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Ki67表達(dá)和SPF與浸潤方式有關(guān)，浸潤分型越高，Ki67表達(dá)越強(qiáng)，SPF越高，即增殖性越強(qiáng)。浸潤方式可作為舌癌惡性程度的有效指標(biāo)之一，有助于判斷舌癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，為臨床治療方案設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

舌鱗狀細(xì)胞癌；浸潤方式；增殖性

舌癌在口腔癌發(fā)病率中占首位，轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因[1-2]，對(duì)早期轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的處理是提高患者生存率的關(guān)鍵。一直以來，組織病理分級(jí)是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的，是腫瘤惡性程度判斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其有較大的主觀性和不確定性受到臨床醫(yī)師質(zhì)疑[3-4]。1973年Jakobsson等[5]提出了半定量病理多因素分級(jí)系統(tǒng)，首次提出了頭頸部鱗癌4型浸潤方式概念。1987年Anneroth等[6]對(duì)該分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，強(qiáng)調(diào)了腫瘤與周圍組織交界面的關(guān)系，提出腫瘤浸潤方式在評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度和預(yù)測區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，主要包括腫瘤細(xì)胞的角化程度、核異型性、浸潤方式及結(jié)締組織中炎性細(xì)胞的浸潤情況等。本研究以舌癌為研究對(duì)象，按Anneroth等[6]介紹的方法作浸潤方式分型，分別采用免疫組化技術(shù)和FCM從宏觀和微觀兩個(gè)不同層面探討舌癌不同浸潤方式腫瘤細(xì)胞的增殖情況，并探討舌癌原發(fā)灶浸潤方式分型在預(yù)測腫瘤惡性度及腫瘤轉(zhuǎn)移中的價(jià)值。

1　研究資料

1.1一般資料收集臨床資料完整、病例診斷確切、病理切片能反映腫瘤-宿主交界情況的舌癌蠟塊43例，所有患者術(shù)前未行放化療。其中男28例，女15例；年齡34～72歲。實(shí)驗(yàn)所用蠟塊行5 μm厚組織切片，常規(guī)HE染色，雙盲法閱片，由2名高級(jí)職稱病理科醫(yī)師按Anneroth方法作原發(fā)灶浸潤方式分型和傳統(tǒng)腫瘤組織病理分級(jí)：Ⅰ型14例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10 例，Ⅳ型6例；病理分化程度：高分化23例，中分化6例，低分化14 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，未轉(zhuǎn)移26例。

1.2SP法免疫組化染色浸潤分型后所有蠟塊重做5 μm厚組織切片，SP法免疫組化染色。鼠抗人細(xì)胞核抗原Ki67單克隆抗體，SP通用型試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)公司。染色方法按試劑盒提供的說明進(jìn)行。以0.01 mol/L PBS代替一抗為空白對(duì)照。

1.3單細(xì)胞懸液DNA熒光染色及上機(jī)檢測浸潤分型后所有蠟塊再次行50 μm厚組織切片，依次二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，胃蛋白酶消化，過濾，離心，漂洗，75%乙醇固定后，離心、去上清、用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量熒光染色，避光反應(yīng)30 min后，用美國BECKMAN COULTE公司的Epics XL型流式細(xì)胞儀檢測，上機(jī)前儀器需校正，使其峰值的分辨率(CV值)<5%。以正常舌體組織單細(xì)胞懸液作對(duì)照。

1.4舌癌浸潤方式分型及組織病理分級(jí)浸潤方式按Anneroth等[6](1987)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型。Ⅰ型:腫瘤細(xì)胞呈“推擠狀”(pushing)生長，腫瘤與正常組織邊界清晰,；Ⅱ型:腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性條索或帶狀向周圍正常組織侵襲；Ⅲ型:腫瘤瘤細(xì)胞排列成較大細(xì)胞團(tuán)塊浸潤正常組織； Ⅳ型:腫瘤細(xì)胞呈小細(xì)胞團(tuán)塊或單細(xì)胞彌散于正常組織中。按WHO( 1997年)標(biāo)準(zhǔn)將口腔鱗狀細(xì)胞癌分為3級(jí)，高分化(一級(jí))：角化明顯，核分裂象少，非典型核分裂和多核細(xì)胞極少，胞核和細(xì)胞多形性不明顯；中度分化(二級(jí))：形態(tài)學(xué)介于高分化與低分化之間，角化較少，細(xì)胞及核多形性較明顯，核分裂象較多，可見異常核分裂象，細(xì)胞間橋不顯著；低度分化(三級(jí))：角化少見，細(xì)胞間橋幾乎不能發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞及核多形性明顯，多核細(xì)胞常見。

1.5Ki67陽性細(xì)胞數(shù)判定及計(jì)數(shù)Ki67表達(dá)陽性為腫瘤細(xì)胞核著色為棕黃色或棕褐色而背景不著色。每張切片由2名病理科醫(yī)生閱片，觀察5個(gè)有代表性且不重疊的高倍視野(10×40)，并計(jì)數(shù)每個(gè)視野中腫瘤細(xì)胞Ki67陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)計(jì)算Ki67陽性細(xì)胞百分率值(Label Index,LI)，即Ki67標(biāo)記指數(shù)(Ki67 LI)。

1.6FCM分析指標(biāo)用Mod Fit LT分析軟件分析細(xì)胞周期，測定S期細(xì)胞比例(SPF)，公式：SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)　　果

2.1Ki67免疫組化染色結(jié)果舌癌腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為Ki67表達(dá)陽性。Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式者癌巢周圍1～3層細(xì)胞Ki67呈陽性表達(dá)而癌巢中央不表達(dá)(見圖1及圖2)，Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式者腫瘤細(xì)胞Ki67陽性表達(dá)呈散在分布于整個(gè)癌巢，且著色深淺不一(見圖3及圖4)。

圖1Ⅰ型浸潤方式Ki67表達(dá)(SP，×100)

圖2Ⅱ型浸潤方式Ki67表達(dá)(SP，×100)

圖3Ⅲ型浸潤方式Ki67表達(dá)(SP，×100)

2.2浸潤方式與Ki67表達(dá)及SPF的關(guān)系隨著浸潤分型Ⅰ型向Ⅳ型的發(fā)展，Ki67標(biāo)記指數(shù)和SPF表達(dá)逐漸升高，舌癌各分型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖4Ⅳ型浸潤方式Ki67表達(dá)(SP，×100)

表1　浸潤方式與Ki67表達(dá)及SPF的關(guān)系，%)

2.3浸潤方式與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系43例舌癌病例中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，其中Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式27例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，陽性率為25.93%(7/27)；Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式16例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，陽性率為62.50%(10/16)。Ⅰ、Ⅱ型與Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式之間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4浸潤方式與組織病理分化程度關(guān)系Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式者高分化20例，中、低分化7例；Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式者高分化3例，中、低分化13例。Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式和Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式之間病理分化程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3　討　　論

腫瘤的大小、部位、生長模式和細(xì)胞分化程度一直被認(rèn)為是與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的因素。近年來的研究表明腫瘤的浸潤方式在其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色，是預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最好指標(biāo)[7]。事實(shí)上惡性腫瘤本身是由不同病理表現(xiàn)形式及生物學(xué)行為的亞細(xì)胞群組成，其浸潤過程極其復(fù)雜,腫瘤的異質(zhì)性可導(dǎo)致同一腫瘤實(shí)體內(nèi)細(xì)胞分化呈現(xiàn)多樣性，這種細(xì)胞學(xué)形成的特定表現(xiàn)完全可能與其浸潤及轉(zhuǎn)移能力間存在內(nèi)在聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，舌癌不同浸潤方式與舌癌病理分化程度(惡性度)有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ型浸潤者比Ⅰ、Ⅱ型浸潤者有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。

Ki67抗原是近年來一種反映細(xì)胞增殖活性的蛋白標(biāo)記，研究發(fā)現(xiàn)[8]Ki67作為一種細(xì)胞分裂增殖指標(biāo)可很好地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。Ki67蛋白除在細(xì)胞周期靜止期(G0期)表達(dá)缺失外，在活躍的細(xì)胞周期中都有表達(dá)，且在G2和M期表達(dá)至高峰[9]。檢測Ki67的表達(dá)可間接反映腫瘤細(xì)胞的增殖潛能。同樣在細(xì)胞DNA周期中S期細(xì)胞比例也是反映細(xì)胞增殖水平的重要指標(biāo), 據(jù)Collin等研究顯示頭頸部腫瘤S期細(xì)胞增殖率為4%～45%(平均19%)，并隨分化程度降低而呈現(xiàn)升高趨勢[10]。本研究發(fā)現(xiàn)舌癌不同浸潤方式的腫瘤細(xì)胞具有不同的增殖活性，浸潤邊緣為推擠狀或團(tuán)塊狀實(shí)體條索狀者(Ⅰ、Ⅱ型)Ki67表達(dá)較低，而以小細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞彌散狀侵襲者(Ⅲ、Ⅳ型)Ki67表達(dá)較高，且Ⅰ、Ⅱ型浸潤者比Ⅲ、Ⅳ型浸潤者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，另外浸潤分型越高者，腫瘤組織分化越低。同樣，不同浸潤方式舌癌SPF各不相同，Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這從另一個(gè)角度反映了浸潤分型高的舌癌組織具有較高的增殖活性，侵襲性更強(qiáng)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，與免疫組化試驗(yàn)相吻合，即舌癌浸潤分型越高，其癌細(xì)胞增殖性越強(qiáng)，提示舌癌浸潤前沿是癌細(xì)胞增殖最活躍、分化最差的部位。因此，舌癌不同浸潤方式的分型在一定程度上反映了腫瘤的惡性程度，能間接預(yù)測舌癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

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1008-8849(2016)27-3050-03

2016-01-22