作物改良領(lǐng)域人工核酸酶技術(shù)全球?qū)＠季址治?/h1>

2016-10-10 08:40:41何湘瓊趙永江譚永華田文文潘衛(wèi)東

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)訂閱 2016年23期 收藏

關(guān)鍵詞：核酸酶轉(zhuǎn)基因基因組

何湘瓊，趙永江，譚永華，田 野，田文文，朱 寧，潘衛(wèi)東*

(1.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作湖北中心，湖北武漢 430070；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002)

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作物改良領(lǐng)域人工核酸酶技術(shù)全球?qū)＠季址治?/p>

何湘瓊1，趙永江1，譚永華2，田 野1，田文文1，朱 寧1，潘衛(wèi)東2*

(1.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作湖北中心，湖北武漢 430070；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002)

利用德溫特世界專利索引數(shù)據(jù)庫(DWPI)，分析作物改良領(lǐng)域人工核酸酶技術(shù)專利布局，揭示關(guān)鍵技術(shù)發(fā)展方向和趨勢、技術(shù)分布區(qū)域、專利申請人情況、競爭對手情況以及各技術(shù)方向?qū)?yīng)的技術(shù)功效分布，以期為我國研究者的技術(shù)研發(fā)和專利布局提供參考。

人工核酸酶；基因編輯技術(shù)；作物改良；專利；布局

對高等生物基因組進(jìn)行高效、精確的定點改造是科學(xué)家多年來的研究目標(biāo)，在該過程中發(fā)展出了多種提高基因組定點編輯效率的策略[1-2]。然而，只有在鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)代表的人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)出現(xiàn)后，基因編輯技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域才有了實質(zhì)性發(fā)展[3]。2015年8月，達(dá)沃斯世界經(jīng)濟(jì)論壇發(fā)布了2015年度十大新興技術(shù)，其中包含了基因編輯技術(shù)，認(rèn)為其是能夠改善農(nóng)作物質(zhì)量、減少各方爭議的突破性技術(shù)。人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是當(dāng)前發(fā)展的熱點，包括：ZFN、大范圍核酸酶 (Meganuclease，MGN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和基于成簇的規(guī)律間隔的短回重復(fù)序列的基因組編輯技術(shù)(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)[4]。

在產(chǎn)業(yè)方面，TALEN技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)推進(jìn)了基因編輯技術(shù)在作物改良領(lǐng)域的快速應(yīng)用(鑒于使用基因編輯技術(shù)產(chǎn)生的作物是否為轉(zhuǎn)基因作物業(yè)界尚有爭議，該文將該應(yīng)用領(lǐng)域統(tǒng)稱“作物改良”)[5-6]。美國公司Calyxt(原Cellectis Plant Science)利用TALEN技術(shù)研發(fā)了耐冷藏土豆和改善油品質(zhì)的大豆，2015年11月，Calyxt宣布完成了改善油品質(zhì)大豆的第2次田間試驗，以及耐冷藏土豆的第1次田間試驗。在TALEN技術(shù)發(fā)展的短短5年時間內(nèi)取得如此成就，展現(xiàn)了基因編輯技術(shù)在作物改良方面的高效率。

基于對德溫特世界專利索引數(shù)據(jù)庫(Derwent world patents index database，DWPI)人工核酸酶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的應(yīng)用專利樣本進(jìn)行的檢索(檢索截止日期為2015年8月24日，樣本數(shù)量為429項專利申請文獻(xiàn))，該文分析了全球范圍內(nèi)人工核酸酶技術(shù)在作物改良領(lǐng)域的專利申請情況，揭示全球范圍內(nèi)技術(shù)發(fā)展的趨勢、技術(shù)分布的區(qū)域、各技術(shù)方向發(fā)展的趨勢、主要申請人的專利布局情況，以及各技術(shù)方向?qū)?yīng)的技術(shù)功效分布，以期為我國研究者的技術(shù)研發(fā)和專利布局提供參考。

1　時間趨勢

人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯作為一種安全、高效的基因編輯工具受到了國際農(nóng)業(yè)組織、國際大型農(nóng)業(yè)科技公司的重視，各大組織和公司在基因組學(xué)研究、作物遺傳改良等項目計劃中皆布局了不同技術(shù)方向的研究。

由圖1可知，在作物改良領(lǐng)域，人工核酸酶技術(shù)的應(yīng)用呈現(xiàn)振蕩上升的趨勢，近年來在新技術(shù)的推動下發(fā)展尤為迅速。自20世紀(jì)末鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)和ZFN技術(shù)發(fā)展以來，該技術(shù)即在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域產(chǎn)生了一定的影響，形成了1999年的峰值，該階段的主要研發(fā)方向集中在新的ZFP蛋白發(fā)現(xiàn)、ZFP設(shè)計與篩選以及利用ZFP進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，但ZFN的設(shè)計與實現(xiàn)也在該時間段作出；自2004年Dana Carroll展示了ZFN技術(shù)在生物體應(yīng)用后，其又在生物體內(nèi)基因的原位編輯(NHEJ途徑)以及基因精確突變等方面掀起了新的增長，會同大范圍核酸酶在這一時期的發(fā)展促成了2004年后的增長趨勢；2010年之后，TALEN技術(shù)和CRISPR技術(shù)迅速崛起，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了較大關(guān)注，因此該領(lǐng)域申請量近年來迅速增長。

圖1　人工核酸酶技術(shù)全球時間趨勢Fig.1　The global temporal trend of designer nuclease technology

2　區(qū)域趨勢

2.1技術(shù)研發(fā)國分布在技術(shù)區(qū)域分布上，美國、中國和歐洲分列前3位。其中，ZFN、大范圍核酸酶以及TALEN技術(shù)的基礎(chǔ)突破分別由英國、法國和德國科學(xué)家完成，而CRISPR技術(shù)的基礎(chǔ)突破由歐洲科學(xué)家和美國科學(xué)家共同完成，可以看出歐洲在生物學(xué)的基礎(chǔ)研究上有著深厚的積淀。而上述四個技術(shù)方向應(yīng)用方面的突破，除了大范圍核酸酶技術(shù)外，皆由美國科學(xué)家實現(xiàn)并由美國公司主導(dǎo)市場，反映出美國在技術(shù)產(chǎn)業(yè)化方面所具有的優(yōu)勢。

2.2目標(biāo)市場國分布由圖3可知，在人工核酸酶技術(shù)的目標(biāo)市場國中，通過專利合作協(xié)定(Patent cooperation treaty,PCT)途徑和歐洲專利局(European patent office,EPO)途徑提出的分別排名第1和第3，表明這些申請進(jìn)入多個國家，尋求區(qū)域全面性保護(hù)的需求，由于該技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)原創(chuàng)國主要是美國，因此體現(xiàn)了美國在人工核酸酶領(lǐng)域的“圈地運動”；而美國、歐洲、澳大利亞、中國和加拿大皆是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)較為關(guān)注的傳統(tǒng)市場。

圖2　全球人工核酸酶技術(shù)的區(qū)域分布Fig.2　The global distribution of designer nuclease technology

圖3　人工核酸酶技術(shù)全球目標(biāo)市場國分布Fig.3　The global target market countries distribution of designer nuclease technology

3　技術(shù)分布及專利申請人情況分析

3.1技術(shù)方向分析由圖4可知，從各技術(shù)分支來看，大范圍核酸酶技術(shù)(MGN)發(fā)展最早，在1992年(最早優(yōu)先權(quán)日)法國巴斯德研究所的申請即公開了大范圍核酸酶誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂的方法，可在供體DNA存在下通過同源重組途徑修復(fù)，并且指出了該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的應(yīng)用前景，但該技術(shù)長期以來一直都未得到足夠重視，直至Cellectis公司成立，進(jìn)一步在基因治療等領(lǐng)域深入發(fā)展該技術(shù)，使該技術(shù)在2007年達(dá)到高峰，但是大范圍核酸酶與其他人工核酸酶不同，其識別域和切割域并非分離的功能單元，存在設(shè)計和篩選困難的問題，因此在ZFN技術(shù)的壓制及TALEN技術(shù)和CRISPR技術(shù)的迅速發(fā)展下，近年來呈現(xiàn)下滑的趨勢。事實上，許多文獻(xiàn)未將該技術(shù)列入人工核酸酶領(lǐng)域，但其在人工核酸酶研究和產(chǎn)業(yè)方面有著重要的意義。

圖4　人工核酸酶技術(shù)分支發(fā)展時間趨勢Fig.4　The time trend of the branch development of designer nuclease technology

ZFN技術(shù)于1995年前后開始發(fā)展，此后由于3個方面的原因迅速發(fā)展：①大量鋅指蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)；②MRC與SCRIPPS研究院等機(jī)構(gòu)對鋅指蛋白設(shè)計與篩選方法的廣泛研究；③ZFN-FokI嵌合酶結(jié)構(gòu)的提出。此后，由于Sangamo公司對該技術(shù)的壟斷，導(dǎo)致申請量有了一定下滑，但在Dana Carroll實現(xiàn)了該技術(shù)在生物體的應(yīng)用后，ZFN技術(shù)又有了進(jìn)一步的發(fā)展；由于Sangamo公司的壟斷、設(shè)計/篩選的難度以及新技術(shù)的興起，近年來也呈現(xiàn)了下降的趨勢，但在總量上依然處于優(yōu)勢地位。

大范圍核酸酶技術(shù)由法國公司Cellectis推向市場，該公司1999年的成立得益于法國政府的支持。1999年，巴黎議會通過了新的“創(chuàng)新法案”，通過放松司法限制以及提供財務(wù)和稅務(wù)激勵等，鼓勵法國科學(xué)家創(chuàng)建起步公司。該法案涉及預(yù)算9.95億法郎(1.62億美元)，其中3.95億用于生命科學(xué)，包括生物技術(shù)[7]。受產(chǎn)業(yè)市場和資本市場的吸引，Cellectis公司在美國先后成立了Calyxt，Inc.(原Cellectis Plant Science)和Cellectis，Inc.兩個分支機(jī)構(gòu)，前者專注于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，并對TALEN技術(shù)有所涉及，而后者主要專注基因治療。

TALEN技術(shù)發(fā)展于德國馬丁·路德大學(xué)(Martin-Luther University)的細(xì)菌學(xué)家烏拉·伯納斯(Ulla Bonas)對TAL效應(yīng)因子(TAL effector，TALE)編碼的解析，Dan Voytas迅速將TAL識別域和FokI切割域嵌合形成人工核酸酶，并將其引入轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域。由于其識別域TALE在設(shè)計篩選方面相比ZFP的明顯優(yōu)點，因此自2010年后其熱度呈指數(shù)上升。Dan Voytas參與創(chuàng)立的Calyxt公司已經(jīng)完成經(jīng)TALEN技術(shù)改良的大豆和馬鈴薯的田間試驗。

RNA介導(dǎo)的、基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列和Cas蛋白的DNA核酸內(nèi)切酶(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas)基因組編輯技術(shù)正式誕生于2012年，之后便迅速成為基因組編輯技術(shù)的代名詞，Dan Voytas迅速將其帶入轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域，我國轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的研究人員對此也表現(xiàn)出濃厚的興趣。

3.2重要申請人分析由圖5可知，排名第1和第2的公司分別是致力于發(fā)展基因編輯技術(shù)的Cellectis和Sangamo，前者主要專注大范圍核酸酶技術(shù)開發(fā)，近年來在TALEN技術(shù)方向上發(fā)展迅速，而Sangamo公司則壟斷了ZFN技術(shù)。排名第1的Cellectis公司由André Choulika在法國研究部的資助下于1999年創(chuàng)立，致力于基于基因編輯的基因治療技術(shù)。其核心技術(shù)包括TALENTM產(chǎn)品和大范圍核酸酶技術(shù)，André Choulika最早發(fā)展了基于大范圍核酸酶對復(fù)雜基因組進(jìn)行編輯的技術(shù)。Cellectis的子公司Calyxt，Inc.成立于2010年，位于明尼蘇達(dá)州。公司發(fā)展了用于提高作物質(zhì)量的技術(shù)平臺，并與各大公司形成合作網(wǎng)，其中包括農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的拜爾、孟山都以及SESVanderhave等，制藥領(lǐng)域的Medicago公司和一些食品公司。排名第2的Sangamo公司致力于ZFN技術(shù)，其對ZFN技術(shù)的專利壟斷在產(chǎn)業(yè)界和科研界飽受爭議。

各大轉(zhuǎn)基因巨頭在人工核酸酶技術(shù)領(lǐng)域也皆有布局，但是在數(shù)量上并不突出，申請量最大的DOW公司也未超過30件。各公司專注的方向差異較大，DOW公司從Sangamo公司獲得ZFN獨家許可，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了研發(fā)平臺；而Monsanto公司、BASF公司等從Cellectis公司和Precision公司獲得大范圍核酸酶技術(shù)的許可，在該技術(shù)方向上進(jìn)行了一些布局。由表1可知，各大公司的技術(shù)方向布局，DOW公司對ZFN技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的獨占許可表明了Sangamo公司對于ZFN技術(shù)的壟斷。

圖5　人工核酸酶技術(shù)主要申請人分析Fig.5　The analysis of principal applicants of designer nuclease technical

技術(shù)分類TechniquedistributionDOWBASFDUPONTMonsantoBayerSYNGENTAZFP1118207ZFN2700000MGN055062TALEN000220CRISPR001000

我國申請人創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因公司和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分別排名第7和第10，表明我國產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界已經(jīng)開始關(guān)注人工核酸酶技術(shù)方向，創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因公司主要關(guān)注的方向是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，尚未真正進(jìn)入人工核酸酶介導(dǎo)基因組編輯的領(lǐng)域；而安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在TALEN技術(shù)與CRISPR技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)方面進(jìn)行了很多有益的嘗試，主要工作是針對植物的內(nèi)源基因進(jìn)行靶向剪切，引發(fā)內(nèi)源基因的NHEJ修復(fù)機(jī)制，造成內(nèi)源基因的剪切從而敲除該基因，并獲得性狀改變的作物，植物的很多性狀受內(nèi)源基因負(fù)向調(diào)節(jié)，因此該方法對開發(fā)新性狀的植物具有重要的意義。

3.3技術(shù)功效分析人工核酸酶可造成基因組在特異的位點產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂，從而激活非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)等DNA 修復(fù)機(jī)制。借此可對基因組DNA進(jìn)行遺傳定點修飾，主要的方式有：NHEJ途徑介導(dǎo)的精確突變、同源重組介導(dǎo)的突變或插、區(qū)段刪除、連鎖疊加、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]。人工核酸酶的另外一個應(yīng)用是利用序列特異性，通過靶向轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點或產(chǎn)生合成轉(zhuǎn)錄因子的方法，調(diào)控內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。

表2　各技術(shù)方向?qū)虻牟僮鞣绞?/p>

從表2可知，最早發(fā)展的ZFN技術(shù)和MGN技術(shù)已經(jīng)在基因操作的多個方面得到了應(yīng)用，但NHEJ途徑仍然占據(jù)主導(dǎo)地位，而TALEN技術(shù)和CRISPR技術(shù)則主要集中在NHEJ途徑。事實上，目前4種人工核酸酶皆被大量用于通過NHEJ途徑對作物進(jìn)行突變，該途徑雖然只能實現(xiàn)基因的敲除，但是對作物開發(fā)具有重要的意義。

對于較為復(fù)雜的精確基因編輯操作，例如HR突變、插入以及連鎖疊加方面，專利數(shù)量較少，表明在植物體內(nèi)實現(xiàn)同源重組依然較為困難；區(qū)段刪除由于需要在植物體內(nèi)同時表達(dá)至少兩組人工核酸酶，因此技術(shù)難度較大，目前能夠?qū)崿F(xiàn)的作物和目標(biāo)基因也較少。

鋅指蛋白和TALE被大量用于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，與其分子結(jié)構(gòu)的天然性質(zhì)有關(guān)；對于ZFP而言，所涉及的大量申請為鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白的發(fā)現(xiàn)及其序列解析，例如我國申請人創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)的申請皆是該類型。

4　結(jié)語

4.1人工核酸酶技術(shù)在作物改良領(lǐng)域發(fā)展迅速該技術(shù)領(lǐng)域近年來發(fā)展迅速，許可活動密集，其中使用TALEN技術(shù)開發(fā)的作物已經(jīng)完成田間試驗，并且其有望在全球范圍內(nèi)取得寬松的監(jiān)管，因此基因編輯是作物品種改良領(lǐng)域高效、安全技術(shù)的最新方向。

4.2人工核酸酶技術(shù)的發(fā)展方向TALEN技術(shù)與CRISPR技術(shù)是人工核酸酶技術(shù)的發(fā)展趨勢，在作物領(lǐng)域的應(yīng)用也處于迅速發(fā)展期，我國轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的研發(fā)人員已經(jīng)在TALEN與CRISPR技術(shù)應(yīng)用方面取得一定突破，然而在專利布局層面卻沒有取得轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域基礎(chǔ)應(yīng)用的專利。

4.3作物改良領(lǐng)域的布局方向TALEN與CRISPR 在轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用目前集中于NHEJ途徑的基因敲除操作，在基因靶向突變或替換、基因插入以及基因刪除等方面仍然有大量可以布局的方向；此外，由于植物為多倍體，基因操作較為困難，因此提高操作效率的基因操作方法(包括獲取轉(zhuǎn)基因植株的方法)以及載體等工具方面也可以進(jìn)行研發(fā)和布局。

4.4人工核酸酶的研發(fā)方向人工核酸酶的四個技術(shù)方向皆是基于對生物化學(xué)特定機(jī)制進(jìn)行揭示和解析后獲得工具和方法，結(jié)構(gòu)生物學(xué)在其中起著重要的作用，我國結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入世界前沿，并且參與了人工核酸酶的發(fā)展，我國科學(xué)家應(yīng)在深入基礎(chǔ)研究的同時，兼顧應(yīng)用研究，發(fā)展最新的工具和方法；此外，應(yīng)大力發(fā)展國際合作和人才引進(jìn)，使得基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究能夠把握最新的技術(shù)方向。

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Layout and Analysis of Worldwide Patents on the Designer Nuclease Technology of Crops Improvement

HE Xiang-qiong1, ZHAO Yong-jiang1, TAN Yong-hua2, PAN Wei-dong2*et al

(1. Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office, SIPO, Wuhan, Hubei 430070; 2. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang, Guizhou 550002)

Based on the Derwent World Patents Index database (DWPI), the layout of worldwide patents on the designer nuclease technology of crops improvement was analyzed. The development trend of key technology, technique distribution area, situation about patent applicants and competitors, distribution of technical efficacy were revealed, so as to provide reference for technology research and development and patent layout of researchers in China.

Designer nuclease; Genome editing technique; Crop improvement; Patent; Layout

貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(黔科合人才[2016]4037)。

何湘瓊(1976- )，男，湖北鄂州人，副研究員，碩士，從事發(fā)明專利審查研究。*通訊作者，研究員，博士，從事天然農(nóng)藥研究。

2016-06-17

N 18

A

0517-6611(2016)23-072-04

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——以江蘇省泰州市為例

光澤縣中藥材產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀調(diào)研及發(fā)展對策