廢啤酒酵母制取酵母抽提物的酶促工藝研究

吳滿(mǎn)剛雷姝敏卞君杰費(fèi)立天于　海葛慶豐姜　虹周平凡

(1. 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州　225127；2. 常州市菜根香生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，江蘇 常州　213000)

?

廢啤酒酵母制取酵母抽提物的酶促工藝研究

吳滿(mǎn)剛1雷姝敏1卞君杰1費(fèi)立天1于海1葛慶豐1姜虹1周平凡2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225127；2. 常州市菜根香生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，江蘇 常州213000)

為了獲得廢啤酒酵母制取酵母抽提物的最佳工藝條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)獲得外加酶法制取酵母抽提物的最佳工藝條件，并比較其與傳統(tǒng)工藝條件的效果；使用GC—MS對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行風(fēng)味分析。通過(guò)優(yōu)化得到最佳工藝條件為添加中性蛋白酶，外加酶0.20%，pH 6.0，酶促溶時(shí)間36 h，得到的該抽提物中含有多種酸類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)等物質(zhì)。研究表明，外加中性蛋白酶法是開(kāi)發(fā)利用啤酒廢酵母制備酵母提取物的較好方法，得到的產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)豐富。

啤酒；酵母；抽提物；蛋白酶；酶解；風(fēng)味

廢啤酒酵母泥在本質(zhì)上就是啤酒酵母，是在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)主發(fā)酵和后發(fā)酵釀造工藝后產(chǎn)生的[1]。酵母泥中富含蛋白質(zhì)、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。中國(guó)是世界啤酒生產(chǎn)大國(guó)，每年生產(chǎn)約50萬(wàn)t啤酒廢酵母，除很少部分被用作飼料外，大部分被排放，并未得到合理利用[3]。目前，中國(guó)對(duì)制取酵母抽提物工藝的研究主要有自溶法[3]、擴(kuò)培法[4]、復(fù)合促溶法[5]和外加酶解法[6-7]等。由于外加酶法可以提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲得率，縮短提取時(shí)間，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[8]。

隨著生物酶技術(shù)的快速發(fā)展，啤酒廢酵母的加工利用向著精深加工方向發(fā)展。提高產(chǎn)品的科技含量，進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及各類(lèi)直接或間接生物產(chǎn)品轉(zhuǎn)化，注重產(chǎn)品的高附加值是目前研究的重點(diǎn)。本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶這3種成本較低，應(yīng)用廣泛，大生產(chǎn)發(fā)展較優(yōu)[8-10]的單種酶進(jìn)行對(duì)比研究，對(duì)酵母抽提物酶促工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期通過(guò)控制多種指標(biāo)得到高得率、高呈味核苷酸含量的酵母抽提物產(chǎn)品。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

木瓜蛋白酶(8.0×104U/g)、胰蛋白酶(1.1×105U/g)、中性蛋白酶(3.5×104U/g)、酪素：生化純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醛、氫氧化鈉(片狀)、碳酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酚酞、乙醇、福林酚試劑等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：J-26XPI型，尤尼科(上海)儀器有限公司；

高壓均質(zhì)機(jī)：Ultra-turrax型，上海智光儀器儀表有限公司；

恒溫水浴鍋：HH型，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；

冷凍離心機(jī)：Sorvall ST 16R型，賽默飛世爾科技公司；

酸度計(jì)：S20K型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：ZXRD-7230型，上海智城分析儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SY200型，上海亞榮生化儀器廠；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：DSQⅡ型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程

廢啤酒酵母→脫苦→調(diào)配(蒸餾水∶酵母泥質(zhì)量比為9∶1)→高壓均質(zhì)(45 MPa處理2次)→酶解(50 ℃，恒溫自溶36 h)→滅酶(90 ℃，10 min)→冷卻(至室溫)→離心(常溫，3 000×g，10 min)→上清液→減壓濃縮(55 ℃)→醬狀酵母抽提物

1.2.2廢啤酒酵母脫苦取啤酒廢酵母離心(5 000×g，10 min)去上清液，2倍體積0.5% NaHCO3振蕩30 min，100目篩子篩分，2倍體積蒸餾水和0.5% NaHCO3分別洗滌，最終采用2倍體積蒸餾水離心洗滌2次[11]。

1.2.3酶促工藝條件的優(yōu)化文獻(xiàn)[12～13]和[14]40都指出，酶促溶的最適溫度均在50 ℃左右，因此本試驗(yàn)確定酶促溫度為50 ℃。

(1) 酶添加量對(duì)酶促溶影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，酶促溶時(shí)間30 h，pH 6.0，以氨基酸態(tài)氮得率和固形物得率為指標(biāo)，考察酶添加量(0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 g/100 mL，酶活以104U/g數(shù)量級(jí)計(jì))對(duì)酶促溶影響。

(2) pH對(duì)酶促溶的影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，基于前述研究所得酶添加量，酶促溶時(shí)間30 h，以氨基酸態(tài)氮得率和固形物得率為指標(biāo)，考察pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)對(duì)酶促溶影響。

(3) 酶促溶時(shí)間對(duì)酶促溶的影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，基于前述研究所得酶添加量、pH，以氨基酸態(tài)氮得率和固形物得率為指標(biāo)，考察酶促溶時(shí)間(12，18，24，30，36，42 h)對(duì)酶促溶影響。

1.2.4優(yōu)化工藝條件與傳統(tǒng)工藝條件的對(duì)比以得到的3種酶的優(yōu)化工藝條件與傳統(tǒng)的醇溶和鹽溶工藝進(jìn)行對(duì)比研究。控制相同條件為：選取80 mL濃度為10 g/100 g的酵母懸濁液，酵母溶液45 MPa均質(zhì)2次，自溶時(shí)溫度為50 ℃。

(1) 空白組[14]41：溶液pH 6.0，自溶時(shí)間36 h。

(2) 醇溶組[5]：添加1.0 mL/100 mL乙醇，溶液pH 6.5，自溶時(shí)間48 h。

(3) 鹽溶組[14]41-43：添加2.0 g/100 g氯化鈉，溶液pH 6.0，自溶時(shí)間36 h。

1.2.5測(cè)定方法

(1) 蛋白酶活力：福林法[15]。

(2) 游離氨基氮得率：甲醇滴定法[16]。游離氨基氮得率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

yA——游離氨基氮得率，%；

m1——自溶后上清液氨基氮質(zhì)量，g；

m2——自溶前酵母干重，g。

(3) 固形物得率：根據(jù)文獻(xiàn)[17]，固形物得率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

ys——固形物得率，%；

m3——自溶后上清液總質(zhì)量，g；

w1——上清液固形物含量，%；

m4——外加物質(zhì)干重，g；

m2——自溶前酵母干重，g。

(4) 揮發(fā)性成分鑒定：稱(chēng)取8 g最佳工藝條件獲得的酵母抽提物，裝入250 mL錐形瓶中鋪平，密封；50 ℃水浴平衡20 min；然后將固相微萃取針頭插入平衡后的錐形瓶中，推動(dòng)手柄探出纖維頭，使纖維頭吸附40 min。

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為He(色譜純)；恒定流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度設(shè)為250 ℃；初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

離子源：電子電離源(EI)；電子能量70 eV；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；溶劑延遲3 min；質(zhì)譜掃描40～600 u。

根據(jù)得到的圖譜，參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行定性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1酶促工藝條件的優(yōu)化

2.1.1酶添加量對(duì)酶促溶影響酵母的自溶過(guò)程主要是糖類(lèi)物質(zhì)和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在酶的水解作用下不斷降解的過(guò)程。蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致游離氨基氮得率和固形物得率增加[6]。由圖1可知，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)降解速率從迅速逐漸變緩。這是由于起初底物濃度遠(yuǎn)大于酶濃度，增加酶量，酶與底物結(jié)合效率增加，蛋白質(zhì)降解速率加快；其后，酶濃度逐漸飽和，蛋白質(zhì)降解速率趨于平穩(wěn)，最終再增加酶量已無(wú)法有效提高酶解效率[7]。綜合考慮，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為0.4%，中性蛋白酶添加量為0.2%，胰蛋白酶添加量為0.025%時(shí)，游離氨基氮得率和固形物得率最高，即為3種酶最適宜添加量。

2.1.2pH對(duì)酶促溶的影響晏志云[14]39在研究中發(fā)現(xiàn)，酵母自溶時(shí)其pH變化趨勢(shì)是先緩慢上升然后再逐步下降。因而，研究中只需要在自溶開(kāi)始時(shí)調(diào)節(jié)到適宜蛋白酶作用的pH，從而保證酶的活性和酶促反應(yīng)速度。酶的催化能力與pH緊密相關(guān)，體系中pH變化，酶分子的構(gòu)象、與底物分子的解離狀態(tài)等也隨之發(fā)生變化，從而影響酶與底物的結(jié)合[19]。當(dāng)pH為酶適宜反應(yīng)pH時(shí)，則促進(jìn)酶的活性和酶促反應(yīng)速度，酶解效果較好，固形物得率和游離氨基酸得率相對(duì)較高；反之，遠(yuǎn)離該pH則起抑制效果。由圖2可知，

圖1　酶添加量對(duì)酶促溶的影響

pH 5.5，6.0，5.0分別是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶促溶的理想酸堿度。

2.1.3酶促溶時(shí)間對(duì)酶促溶的影響由圖3可知：隨著酶促溶時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母抽提產(chǎn)品得率不斷增加，其風(fēng)味也不斷改善，而后產(chǎn)品得率趨于穩(wěn)定，風(fēng)味將變得醇厚，最終產(chǎn)品得率幾乎不再增加。其中，木瓜蛋白酶的最佳酶促溶時(shí)間為36 h，與蔣雪薇等[5]的研究結(jié)果一致，而中性蛋白酶的為36 h，胰蛋白酶的為30 h。

終上所述，木瓜蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.4%，pH 5.5，自溶時(shí)間36 h，與陳軍[12]得到的結(jié)論相近；中性蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.2%，pH 6.0，自溶時(shí)間36 h；胰蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.025%，pH 5.0，自溶時(shí)間30 h。

2.2優(yōu)化工藝條件與傳統(tǒng)工藝條件的對(duì)比

由圖4可知，添加蛋白酶的三組游離氨基酸得率和固形物得率均高于鹽溶組和空白組。其中，中性蛋白酶組的游離氨基酸得率達(dá)到4.34%，固形物得率達(dá)到62.02%，結(jié)果明顯優(yōu)于胰蛋白酶組與木瓜蛋白酶組。因此，最優(yōu)酶促工藝條件為：采用中性蛋白酶，蛋白酶酶量0.2%，溶液的pH 6.0，酶促溫度50 ℃，酶促溶時(shí)間36 h。

2.3揮發(fā)性成分鑒定

經(jīng)GC—MS分析鑒定，所得酵母抽提物中揮發(fā)性化合物的GC色譜見(jiàn)圖5，各種化合物相對(duì)百分比含量比較見(jiàn)表1。

由表1可知，制得的酵母抽提物中測(cè)定出的揮發(fā)性化合物，主要有酸類(lèi)(占15.34%)、酯類(lèi)(占9.29%)、醇類(lèi)(占1.99%)、醚類(lèi)(占1.50%)和其他類(lèi)(占9.13%)，是酵母抽提物的主要風(fēng)味來(lái)源。

3　結(jié)論

綜合比較酶解和傳統(tǒng)工藝條件，得出當(dāng)添加0.20%中性蛋白酶，pH 6.0，自溶36 h，50 ℃下促溶效果最佳。同時(shí)，得到的酵母抽提物富含多種風(fēng)味物質(zhì)。試驗(yàn)中木瓜蛋白酶研究部分與前人[12]相似，同時(shí)在前人基礎(chǔ)上比較了更適用于大生產(chǎn)的工藝條件的優(yōu)劣，為酶促提取酵母抽提物的大生產(chǎn)化作了一定理論補(bǔ)充。但并未在提高產(chǎn)品附加值方面進(jìn)行更深入的研究，后續(xù)需著眼于附加值研究進(jìn)行進(jìn)一步探討。

表1　鑒定結(jié)果?

?酸類(lèi)15.34%，酯類(lèi)9.29%，其他9.13%，醇類(lèi)1.99%，醛類(lèi)1.50%。

圖3　酶促溶時(shí)間對(duì)酶促溶的影響

圖4　不同工藝條件處理效果的對(duì)比

圖5　風(fēng)味分析圖譜

[1] FERREIRA I M P L V O, PINHO O, VIEIRA E, et al. Brewer’s Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications[J]. Trend Food Sci Technol, 2010(21): 77-84.

[2] 李科德, 曾慶孝. 啤酒廢酵母泥綜合利用的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(2): 63.

[3] 羅依雨, 羅維, 劉峻熙, 等. 啤酒廢酵母自溶提取物的制備及抗氧化活性研究[J]. 華南師范大學(xué)報(bào), 2016, 48(1): 89-93.

[4] 陳志穎, 張子健, 焦瑞杰, 等. 利用啤酒廢酵母擴(kuò)培物制備富含谷胱甘肽酵母抽提物[J]. 中國(guó)釀造, 2015, 34(11): 61-65.

[5] 蔣雪薇, 羅曉明, 劉永樂(lè). 啤酒廢酵母復(fù)合促溶劑促溶效果的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2003(2): 15-17.

[6] 蔡奕文. 酵母抽提物生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2003(3): 16-18.

[7] 梁天姣, 葉盛權(quán). 響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒酵母粉酶解條件的研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2015, 6(3): 1 080-1 087.

[8] 郭永, 龐宏建. 酵母抽提物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2010, 35(12): 24-27, 34.

[9] 李君蘭. 牛羊胰臟提取、胰蛋白酶純化及其酶化學(xué)特性研究[D]. 甘肅: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011: 1-4.

[10] 肖懷秋. 高活力產(chǎn)中性蛋白酶細(xì)菌菌株的選育及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 湖南: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006: 10-13.

[11] 陳潔, 王璋, 肖剛. 啤酒廢酵母中酵母抽提物的制備[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 20(4): 356-362.

[12] 陳軍. 從啤酒廢酵母制備酵母抽提物的工藝研究[J]. 廣西輕工業(yè), 2011(4): 46-47, 62.

[13] 夏俊松, 閻淳泰, 葛向陽(yáng). 利用活性干酵母制備酵母抽提物的工藝研究[J]. 中國(guó)釀造, 2010(4): 83-88.

[14] 晏志云. 酵母抽提物的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 1999.

[15] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SB/T 1031—1999蛋白酶活力測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1999.

[16] MORESI M, ORBAN K. Effect of enzymes industry[M]. New York: The Nature Press, 1979: 21-23.

[17] 謝曉航, 韓宏明, 盧國(guó)偉. 啤酒酵母復(fù)合酶法生產(chǎn)酵母抽提物工藝的研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2012, 38(5): 62-67.

[18] 林美麗, 許倩倩, 宋煥祿, 等. 酵母抽提物香氣活性化合物的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(8): 259-262.

[19] 孫偉峰. 酵母活性肽制備及其抗氧化活性研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009: 19, 24.

Study on the preparation of beer yeast extract from its waste residue

WU Man-gang1LEIShu-min1BIANJun-jie1FEILi-tian1YUHai1GEQing-feng1JIANGHong1ZHOUPing-fan2

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225127,China;2.ChangzhouCaigenEcologicalAgricultureCo.,Ltd.,Changzhou,Jiangsu213000,China)

In order to acquire optimum conditions of preparation of yeast extract from its waste residue, single factor experiments were conducted to a good condition of adding external enzymes, and also it was compare with the traditional process. And then the GC—MS was used to analyze the flavor of the yeast extract for determining the best stratagem. Through optimization, the best optimum condition is that it adding 0.20% neutral protease and reacting for 36 h at pH 6.0. The final extract contained a variety of acids, esters, alcohols and other substances. The neutral protease method is shown a better way to acquire yeast extract. Moreover, the products obtained were with rich nutriment.

beer; yeasts; extract; protease; enzymatic hydrolysis; flavor

常州市科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(編號(hào)：CE20142020)；揚(yáng)州大學(xué)中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助

吳滿(mǎn)剛(1977-)，男，揚(yáng)州大學(xué)副教授，博士。

E-mail: mgwu@yzu.edu.cn

2016-03-26

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.039