秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化

李玉珍 肖懷秋

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲　412000)

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秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化

李玉珍 肖懷秋

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲412000)

為提高秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取效率，在Min-Run Res IV析因設(shè)計(jì)和爬陡坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面優(yōu)化方法研究堿液濃度、秈碎米粒度、固液比對(duì)大米蛋白質(zhì)提取的影響規(guī)律，并優(yōu)化其提取工藝條件。結(jié)果表明，秈碎米蛋白質(zhì)最優(yōu)堿法提取工藝為堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，堿提溫度50 ℃，堿提時(shí)間120 min。該條件下蛋白質(zhì)提取率為(82.25±2.53)%，大米蛋白質(zhì)產(chǎn)物純度為(91.68±1.26)%。

秈碎米；蛋白質(zhì)；堿法提取

由于現(xiàn)有碾米技術(shù)的限制，在大米加工中約產(chǎn)生10%～15%的碎米[1]，特別是秈米，由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性，加工過程中碎米率更高[2]。近幾年，隨著人們對(duì)大米優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源研究的深入和對(duì)大米蛋白低過敏性的認(rèn)同，大米蛋白質(zhì)逐漸成為研究的新熱點(diǎn)[3]。大米蛋白氨基酸配比合理，生物效價(jià)高，特別是賴氨酸含量是谷物中最高的，而且是唯一可免于過敏試驗(yàn)的谷物蛋白[4-5]，可作為嬰幼兒食品的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)基料[6]，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。大米蛋白質(zhì)主要為堿溶性的米谷蛋白，其在胚乳中與淀粉結(jié)合緊密，較難溶出。由于堿液能降低大米蛋白質(zhì)與淀粉的結(jié)合作用力，使極性基團(tuán)發(fā)生解離，并使大米蛋白質(zhì)分子表面帶負(fù)電荷，從而起到增溶作用，同時(shí)，也促使淀粉與蛋白質(zhì)的有效分離，因此堿法提取適合于秈米及碎米中蛋白質(zhì)的提取[7]。孫慶杰等[8]以0.09 mol/L NaOH為堿提溶劑進(jìn)行了大米中堿溶性米谷蛋白的堿法提取，優(yōu)化條件下蛋白質(zhì)提取率和純度分別為80.16%和90.10%；萬娟等[9]以秈碎米為原料，采用傳統(tǒng)堿法提取大米蛋白并優(yōu)化了大米堿溶性米谷蛋白提取工藝，優(yōu)化條件下蛋白提取率和純度分別為77.3%和80.5%；王威等[10]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.35%的NaOH進(jìn)行堿法提取大米蛋白，并對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化分析，優(yōu)化條件下蛋白質(zhì)提取率為80.4%。目前來看，有部分學(xué)者進(jìn)行了堿法提取米谷蛋白的試驗(yàn)研究，但局限于以單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，由于單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)化方法本身的不足，因素間交互作用考慮較少，而析因設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可以較好考慮各因素及因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面優(yōu)化是一種尋找多因素系統(tǒng)中最優(yōu)條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，主要用于受多個(gè)變量影響的復(fù)雜灰色體系的優(yōu)化分析，可用于多變量非線性復(fù)雜體系的優(yōu)化和考察交互作用影響，通過構(gòu)建全局函數(shù)關(guān)系可實(shí)現(xiàn)快速建模和縮短優(yōu)化時(shí)間并能提高應(yīng)用可信度，二次旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)是響應(yīng)面優(yōu)化方法的一種，具有試驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡(jiǎn)便、回歸系數(shù)間無相關(guān)性的優(yōu)點(diǎn)，并可利用旋轉(zhuǎn)性克服預(yù)測(cè)值方差對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)在因子空間位置的依賴性[11]，廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)條件的優(yōu)化[12]。雖然堿提工藝會(huì)對(duì)大米蛋白氨基酸及提取設(shè)備造成一定的影響，但該法提取效率高、成本低且適宜于工業(yè)化生產(chǎn)[13]。因此，本試驗(yàn)以秈碎米為研究對(duì)象，以低濃度堿液作為提取溶劑，在析因設(shè)計(jì)和爬陡坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化秈碎米蛋白質(zhì)的堿法提取工藝，旨在為秈碎米蛋白質(zhì)資源的綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

秈碎米：市售；其它試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器設(shè)備

冷凍干燥儀：LABCONCO型，美國(guó)labconco公司；

冷凍離心機(jī)：HERMLE Z323K型，德國(guó)Hermle公司；

電熱恒溫水浴箱：DK-98-11A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外可見分光度計(jì)：752型，上海舜宇恒平儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1秈碎米常規(guī)組分的分析蛋白質(zhì)測(cè)定采取凱氏定氮法、脂肪測(cè)定采取索氏抽提法、水分測(cè)定采取直接干燥法、灰分測(cè)定采取灼燒法進(jìn)行含量測(cè)定[14]。

1.2.2秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝

秈碎米→烘干(50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥24 h)→粉碎→堿提→過濾→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液→調(diào)pH(用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.2)→離心(4 000 r/min，20 min)→沉淀→水洗→調(diào)節(jié)沉淀pH至中性(用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0左右)→離心(4 000 r/min，20 min)→冷凍干燥(-83 ℃預(yù)冷，-53 ℃下冷凍干燥48 h)→大米蛋白質(zhì)

1.2.3秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化

(1) Min-Run Res IV析因設(shè)計(jì)：在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上擬考察堿液濃度、堿提溫度、堿提時(shí)間、秈碎米粒度和固液比對(duì)秈碎米蛋白質(zhì)提取的影響，因素編碼水平與實(shí)際水平見表1。

表1　析因設(shè)計(jì)編碼與實(shí)際水平

(2) 爬陡坡試驗(yàn)：由于響應(yīng)面優(yōu)化需在響應(yīng)值最優(yōu)鄰域才能充分近似真實(shí)條件[15]，因此，各因素同時(shí)逼近其最優(yōu)鄰域時(shí)可表征各因素的真實(shí)影響。同時(shí)，基于析因設(shè)計(jì)方差分析與因素顯著性分析設(shè)置因素變化方向及步長(zhǎng)。

(3) 響應(yīng)面優(yōu)化：采用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)分析堿液濃度、秈碎米粒度和固液比對(duì)秈碎米蛋白質(zhì)提取的影響。利用Design Expert 8.0.6進(jìn)行三因素五水平旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)，共17次試驗(yàn)(中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)點(diǎn)為3個(gè))。

1.2.4蛋白質(zhì)提取率與蛋白質(zhì)純度的測(cè)定固體蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定(轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.95[13])，溶液蛋白質(zhì)含量采用考馬氏亮蘭法[16]測(cè)定。蛋白質(zhì)提取率與蛋白質(zhì)純度分別按式(1)和(2)計(jì)算：

(1)

(2)

2　結(jié)果與分析

2.1秈碎米常規(guī)組分分析結(jié)果

對(duì)秈碎米的主要組分含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2　秈碎米主要常規(guī)成分含量

2.2Min-Run Res IV析因設(shè)計(jì)

堿液濃度、堿提溫度、堿提時(shí)間、秈碎米粒度和固液比對(duì)秈碎米蛋白質(zhì)提取率的影響見表3。

利用Design expert 8.0.6對(duì)表3進(jìn)行線性回歸擬合得到回歸方程為：

y=27.02+2.65X1+0.90X2+1.40X3+7.35X4+15.67X5。

(3)

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析與因素顯著性分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，模型顯著性分析為顯著(P<0.05)，模型信噪比(signal to noise ratio，SNR)為6.795(>4)，說明模型精度符合要求。當(dāng)模型存在因素間交互作用時(shí)，不能用回歸系數(shù)絕對(duì)值進(jìn)行主效因素的篩選，宜用因子百分貢獻(xiàn)率進(jìn)行比較[17]，其中X1、X4和X5百分貢獻(xiàn)率分別為1.54%，11.88%，50.70%，三因素累積貢獻(xiàn)率之和為64.12%，為主效因子且均為正效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步增加這些因素的取值水平。

表3　析因設(shè)計(jì)因素水平與結(jié)果

表4　析因設(shè)計(jì)方差分析與因素顯著性分析?

?**表示影響極顯著(P<0.01)；*表示影響顯著(P<0.05)；ns表示影響不顯著(P>0.05)。

2.3爬陡坡試驗(yàn)

基于析因設(shè)計(jì)結(jié)果設(shè)定因素爬坡方向及步長(zhǎng)，見表5。

由表5可知，鄰優(yōu)區(qū)域在2號(hào)，提取率最高。因此，以該條件為中心組合設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

對(duì)堿液濃度、秈碎米粒度和固液比進(jìn)行中心組合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，因素編碼與實(shí)際水平見表6。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案與結(jié)果見表7。為減少試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)隨機(jī)安排。

表5　爬陡坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果?

?ΔX1=+0.02 mol/L；ΔX2=20目；ΔX3=1∶2(g/mL)。

2.4.1模型序貫分析與數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建模型序貫分析(model sequential analysis，MSA)是響應(yīng)面模型構(gòu)建的重要依據(jù)，各階模型序貫分析結(jié)果見表8。

由表8可知，一階線性模型顯著性分析為不顯著(P>0.05)，失擬項(xiàng)極顯著(P<0.01)。失擬項(xiàng)顯著表示此階數(shù)值模型數(shù)據(jù)擬合效果較差，需用更高階模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[18]；二因素交互關(guān)系模型失擬項(xiàng)極顯著(P<0.01)，也不宜對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；二階模型顯著性分析為極顯著(P<0.01)，R2= 0.960 7，Adj.R2=0.910 3，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，因此，用二階模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合其精度是符合要求的。三階模型的模型顯著性分析和失擬項(xiàng)顯著性分析均不顯著(P>0.05)，不宜對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，而且所擬合回歸方程相對(duì)復(fù)雜，應(yīng)用不便，因此，本試驗(yàn)宜用二階模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合。擬合回歸方程為：

表6　響應(yīng)面優(yōu)化因素編碼與實(shí)際水平

表7　響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表8　響應(yīng)面模型構(gòu)建序貫分析?

?**表示影響極顯著(P<0.01)；*表示影響顯著(P <0.05)；ns表示影響不顯著(P >0.05)。

(4)

2.4.2模型方差分析與回歸分析從模型方差分析和回歸分析結(jié)果(表9)可看出，回歸模型極顯著(P<0.01)，R2=0.960 7，Adj.R2= 0.910 3，說明該模型能解釋總變異的91.03%。模型失擬項(xiàng)不顯著(P>0.5)表明用該模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)不會(huì)造成數(shù)值失真。變異系數(shù)(CV)是衡量模型精密度和可靠性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，數(shù)值越小，模型越可靠[18]，模型CV為8.53%。模型SNR為14.107(>4)，說明該模型可很好的應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析和結(jié)果預(yù)測(cè)。

2.4.3模型降維分析(交互作用分析)當(dāng)其它因素為零水平時(shí)，可觀察某兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并得到交互作用項(xiàng)的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖1)。響應(yīng)曲面坡度比較平緩時(shí)表明交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不大，若非常陡，則表明交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著。等高線圖呈橢圓形且排列致密說明交互作用項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響顯著，若呈圓形則此時(shí)交互效應(yīng)可忽略[9]。由圖1可知，交互作用項(xiàng)X1X2和X1X3對(duì)響應(yīng)值影響較弱，而交互項(xiàng)X2X3影響則較強(qiáng)。

表9　回歸模型方差分析與回歸分析?

?**表示影響極顯著(P <0.01)；*表示影響顯著(P<0.05)；ns表示影響不顯著(P>0.05)；模型確定系數(shù)R2=0.960 7，模型調(diào)整確定系數(shù)Adj.R2=0.910 3。

圖1　因素交互作用響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2.4.4模型最優(yōu)解及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)響應(yīng)變量分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)并令結(jié)果為零，聯(lián)立得到三元一次方程組，解逆矩陣得到響應(yīng)面函數(shù)駐點(diǎn)(最優(yōu)解)，即X1=0.085 8 mol/L，X2=78.8目，X3=1∶13.32(g/mL)。為操作方便，將結(jié)果修約為堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比為1∶13.5(g/mL)，優(yōu)化條件下大米蛋白質(zhì)提取率為(82.25±2.53)%(n=3)，比表7中第2組試驗(yàn)結(jié)果稍低，可能是試驗(yàn)誤差造成的，比模型預(yù)測(cè)值84.655 1%稍低，偏差為-0.48%。制備得到的大米蛋白純度為(91.68±1.26)%(n=3)。

3　結(jié)論

因大米蛋白堿提效率受堿液濃度、堿提溫度、堿提時(shí)間、秈碎米粒度和固液比等多因素綜合影響，是一個(gè)復(fù)雜的灰色體系，為解析各因素的影響規(guī)律，本試驗(yàn)在析因設(shè)計(jì)和爬陡坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面優(yōu)化方法研究了堿液濃度、秈碎米粒度和固液比的影響規(guī)律并獲得優(yōu)化條件，即堿液濃度0.09 mol/L，秈碎米粒度80目，固液比1∶13.5(g/mL)，堿提溫度50 ℃，堿提時(shí)間120 min。優(yōu)化條件下大米蛋白質(zhì)提取率和純度分別為82.25%和91.68%。結(jié)果表明，析因設(shè)計(jì)與響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)聯(lián)用可很好用于秈碎米蛋白質(zhì)堿法提取工藝的優(yōu)化分析。

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Optimizating the alkaline extraction technology of broken long-grain rice protein

LI Yu-ZhenXIAOHuai-Qiu

(PharmaceuticalandBioengineeringSchool,HunanVocationalTechnicalCollegeofChemicalandIndustrialTechnology,Zhuzhou,Hunan412000,China)

To improve the efficiency of protein extraction from broken long-grain rice, a quadratic rotatable central composite response surface methodology (qrCCD-RSM) was utilized to investigate the affecting mechanism of alkali concentrations, broken long-grain rice particle sizes and solid-liquid ratios (SLR), based on the results of Min-Run Res IV factorial design and steep accent experiments (SAE). The optimal extraction condition was obtained, i.e. 80 mesh of broken long-grain rice was used to extrat proteins, soluting in 0.09 mol/L of NaOH buffer, with the SLR 1 g∶13.5 mL at 50 ℃ for 120 min. Under this optimized condition, the protein extraction rate and its purity was found to be (82.25±2.53)% and (91.68±1.26)%, respectively.

broken long-grain rice; protein; alkaline extraction

湖南省高?？蒲许?xiàng)目(編號(hào)：12C1049)；國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31050012)；湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)課題(編號(hào)：HNHY2015002)

李玉珍，女，湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，碩士。

肖懷秋(1981—)，男，湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院副教授，碩士。E-mail:xiaohuaiqiu@163.com

2015—12—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.042