綬草萃取物體外抗氧化活性及其總酚含量比較

嚴(yán)　鑫 王　委 劉　量

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州　225009)

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綬草萃取物體外抗氧化活性及其總酚含量比較

嚴(yán)鑫 王委 劉量

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州225009)

采用DPPH法、ABTS法測(cè)定綬草不同有機(jī)溶劑萃取物的體外抗氧化活性，并用福林酚法測(cè)定其總酚含量。結(jié)果表明：綬草各溶劑萃取物均有明顯的體外抗氧化活性，且呈劑量依賴性；各溶劑萃取物的抗氧化活性強(qiáng)弱及總酚含量大小順序均為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。說(shuō)明綬草不同萃取物體外抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)，其中乙酸乙酯萃取物的清除DPPH·及ABTS+·的IC50值分別為(45.270±0.005)，(75.420±0.015) μg/mL，總酚含量為(13.861±0.002)%。

綬草；萃取物；抗氧化活性；總酚

綬草(Spiranthessinensis(Pers.)Ames)為蘭科綬草屬植物，又名盤龍參、盤龍草、清明草等，生于草叢、濕草地或山坡中，中國(guó)各地均有分布[1-2]。綬草為藥食同源植物，常用來(lái)制作藥膳，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身的作用[3]。綬草還是涼茶植物，用來(lái)制作夏季的消暑飲品，具有滋陰清熱，化痰止咳的功效[4]。已有報(bào)道[5-7]顯示綬草主要成分為包括二氫菲類、黃酮類、苯丙素類等在內(nèi)的酚類成分，具有開發(fā)抗氧化劑的前景。但綬草不同萃取物抗氧化活性和總酚含量是否有差異還未見報(bào)道。

本研究擬采用DPPH法、ABTS法測(cè)定綬草各有機(jī)溶劑萃取物的抗氧化活性，采用福林酚法測(cè)定各萃取物的總酚含量，并比較兩者的相關(guān)性，旨在為綬草后續(xù)化學(xué)成分的深入研究及抗氧化劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)原料

綬草：采購(gòu)于安徽毫州，由揚(yáng)州大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院金銀根教授鑒定為蘭科綬草屬植物綬草S.sinensis，藥用部位為帶根全草。

1.1.2試劑

水溶性VE(Trolox)：純度97%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：純度99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：純度98%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

福林酚試液(Folin-Ciocalteu)：1 mol/L，合肥博美生物公司；

沒(méi)食子酸對(duì)照品：純度98%，上海金穗生物科技有限公司；

甲醇、無(wú)水乙醇、碳酸鈉、二甲亞砜(DMSO)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

萬(wàn)分之一電子天平：BS124S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW80型，天津市泰斯特有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(III)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，上海江星儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Synergy2型，美國(guó)博騰儀器有限公司；

紫外可見紅外分光光度計(jì)：U-3900型，日本日立公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-9600型，北京瑞利分析儀器公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原料處理綬草干燥帶根全草650 g，粉碎，用95%乙醇于85 ℃下回流提取2 h，重復(fù)提取5次，減壓濃縮得總浸膏。將總浸膏自然揮干至無(wú)醇味，加入10倍蒸餾水分散，再分別用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，減壓濃縮并揮干試劑得相應(yīng)的粉末，備用。

1.2.2抗氧化活性試驗(yàn)溶液配制

(1) DPPH溶液配制：精密稱取DPPH試劑40.0 mg，無(wú)水乙醇定容于100 mL容量瓶中，再?gòu)闹形?0 mL定容于100 mL的容量瓶中，備用。

(2) ABTS溶液配制：精密稱取ABTS試劑200.0 mg，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，再精密稱取35.0 mg過(guò)硫酸鉀，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，搖勻后與ABTS水溶液混合，在室溫黑暗處反應(yīng)12～16 h，產(chǎn)生ABTS陽(yáng)離子自由基。從中吸取20 mL再定容于100 mL的容量瓶中，備用。

(3) 待測(cè)樣品和陽(yáng)性對(duì)照溶液配制：精密稱取綬草3個(gè)萃取物粉末及水溶性VE各20.0 mg，用1 mL DMSO溶解，再加無(wú)水乙醇將樣品稀釋成終濃度為1.000，0.500，0.400，0.200，0.100，0.050，0.025 mg/mL的溶液，備用。

1.2.3抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除：DPPH是以氮原子為中心的一種穩(wěn)定自由基，有強(qiáng)氧化性，易被抗氧化劑還原[8]。往DPPH溶液中加入抗氧化劑時(shí)，由于其自由基的清除作用，DPPH溶液顏色消退，使得吸收光譜強(qiáng)度隨加入的抗氧化劑的量的增加而減小，通過(guò)加入抗氧化劑前后吸光度的線性變化來(lái)計(jì)算自由基清除率[9-10]。

在96孔板中加入準(zhǔn)備好的樣品溶液100 μL，每個(gè)樣品平行做3個(gè)，于517 nm紫外下測(cè)定吸光度Aj，再向其中加入DPPH試劑100 μL，37 ℃遮光放置反應(yīng)30 min后，測(cè)量吸光度Ai。空白對(duì)照(溶解樣品的試劑)與陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定方法相同，且需同批次測(cè)定并每批次測(cè)定一次，分別記錄。根據(jù)式(1)計(jì)算清除率：

(1)

式中：

SR——DPPH自由基清除率，%；

Ai——加入DPPH后樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度；

Aj——未加入DPPH時(shí)樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度；

Ac——加入DPPH后空白對(duì)照的吸光度。

由于中藥樣品在高濃度時(shí)本身具有顏色，DPPH自由基清除后顏色也為黃色，會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，故計(jì)算中需要扣除樣品背景影響即Aj，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(2) ABTS自由基清除：ABTS法是以ABTS為顯色劑，經(jīng)活性氧氧化后生成陽(yáng)離子自由基ABTS+·，呈穩(wěn)定的藍(lán)綠色溶液；若向其中加入抗氧化物質(zhì)，則會(huì)與ABTS+·反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在734 nm處檢測(cè)溶液吸光度，以此來(lái)衡量該物質(zhì)的抗氧化能力[11]。

在96孔板的各個(gè)孔中加入準(zhǔn)備好的樣品溶液100 μL，每個(gè)樣品平行做3個(gè)，再往里加入ABTS試劑100 μL，常溫反應(yīng)5 min后，于734 nm紫外下測(cè)定吸光度As。由于ABTS+·清除后顏色為無(wú)色，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果幾乎無(wú)影響，故此時(shí)不需要測(cè)樣品本身吸光度。根據(jù)式(2)計(jì)算清除率：

(2)

式中：

SR——ABTS自由基清除，%；

Ac——加入ABTS+·后空白對(duì)照的吸光度；

As——加入ABTS+·后樣品或陽(yáng)性對(duì)照的吸光度。

1.2.4多酚含量測(cè)定溶液配制采用福林酚法。參照文獻(xiàn)[12]，修改如下：各稱取一定量的綬草萃取物溶于甲醇中，超聲輔助溶解，并用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾溶解液，得供試品溶液。

(1) 對(duì)照品溶液的配制：精密稱取沒(méi)食子酸10.0 mg，置250 mL量瓶中，以適量甲醇溶解，定容，精密量取50 mL，采用倍半稀釋法依次配制成質(zhì)量濃度為40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5 μg/mL的沒(méi)食子酸甲醇溶液備用。

(2) 樣品溶液的配制：精密稱取綬草3個(gè)萃取物各10.0 mg，置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/mL的樣品溶液。

1.2.5測(cè)定條件的優(yōu)化及方法學(xué)考察

(1) 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：取適量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，加入10%福林酚試劑2.5 mL，再加入20%碳酸鈉溶液150 μL，30 ℃下反應(yīng)一段時(shí)間，在500～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度。

(2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取適量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，于上述條件下操作，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)后不同時(shí)間點(diǎn)(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h)的吸光度。

(3) 精密度試驗(yàn)：精確吸取2.5 mL的對(duì)照品溶液，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，重復(fù)6次，計(jì)算變異系數(shù)(RSD)，評(píng)價(jià)該方法的精密度。

(4) 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取綬草乙醇總提取物適量，按供試品溶液的配制方法，平行配制6份供試品溶液，于上述條件下操作，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

(5) 加樣回收率試驗(yàn)：分別稱取綬草乙醇總提取物6份，每份精確加入一定量的沒(méi)食子酸溶液，按上述條件操作，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算沒(méi)食子酸回收率。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密量取各濃度沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液適量，按1.2.5優(yōu)化的條件操作，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，按濃度與吸光度相關(guān)關(guān)系求回歸方程。

1.2.7樣品總酚含量的測(cè)定精密量取樣品溶液2.5 mL，按1.2.5優(yōu)化的條件操作，在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品溶液中總酚含量。

1.2.8數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0、Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并運(yùn)用GraphPad Prism 5 繪制圖表，計(jì)算IC50值。

2　結(jié)果與討論

2.1抗氧化活性測(cè)定

本試驗(yàn)以水溶性VE(Trolox)為陽(yáng)性對(duì)照，分析綬草乙醇提取物各萃取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力，以IC50值評(píng)價(jià)其抗氧化活性，IC50值越小，其抗氧化活性越強(qiáng)。由圖1、2可知，綬草的石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取物均具有清除DPPH和ABTS自由基的能力。各萃取物在濃度0.025～1.000 mg/mL時(shí)，清除DPPH及ABTS自由基的能力隨濃度增加而增大；在相同濃度下，各萃取物清除DPPH自由基的能力較ABTS自由基強(qiáng)。

圖1　綬草不同萃取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖2　綬草不同萃取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

由表1可知，乙酸乙酯萃取物清除兩種自由基的IC50值最低，其次為正丁醇萃取物，石油醚萃取物IC50值最大，表明綬草不同萃取物體外氧化活性由強(qiáng)到弱依次為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。乙酸乙酯萃取物抗氧化活性略弱于陽(yáng)性對(duì)照VE。

表1　綬草不同萃取物抗氧化活性

2.2多酚含量的測(cè)定

2.2.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇由圖3可知，在500～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸的最大吸收波長(zhǎng)為765 nm，因此選定765 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)由圖4可知，溶液在2 h后吸光度基本維持穩(wěn)定，考慮到試驗(yàn)的效率，選擇反應(yīng)2 h后測(cè)定溶液的吸光度。

圖3　沒(méi)食子酸紫外吸收光譜圖

圖4　反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.2.3精密度試驗(yàn)按1.2.5的條件操作，在765 nm波長(zhǎng)下，對(duì)福林酚法測(cè)定一定濃度的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn)，重復(fù)6次，求得吸光度平均值為0.125，RSD為0.53%，表明儀器精密度良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)6次測(cè)定一定量綬草乙醇提取物中多酚的含量，求得平均含量為6.83%，RSD為0.79%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率試驗(yàn)由表2可知，用福林酚法測(cè)得沒(méi)食子酸的加樣回收率為95.05%～108.91%，平均回收率為100.99%，RSD為6.23%，上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性，可用于綬草不同萃取物多酚含量的測(cè)定。

表2　沒(méi)食子酸加樣回收率結(jié)果

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)不同濃度的沒(méi)食子酸在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5)，得到線性回歸方程為Y=0.048 7x+0.010 3，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8。表明沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.312 5～40.000 0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖5　沒(méi)食子酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4綬草不同萃取物總酚含量測(cè)定

用上述建立的方法，測(cè)定綬草3個(gè)不同萃取物的總酚含量。由圖6可知，總酚含量分別為石油醚萃取物(5.67±0.005)%，乙酸乙酯萃取物(13.861±0.002)%；正丁醇萃取物(13.717±0.002)%。說(shuō)明乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物總酚含量相當(dāng)，都高于石油醚萃取物；三者總酚含量由高到低依次為：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>石油醚萃取物。結(jié)合2.1抗氧化活性結(jié)果，表明綬草不同萃取物抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)。

圖6　綬草不同萃取物總酚含量

3　結(jié)論

本研究通過(guò)DPPH法、ABTS法評(píng)價(jià)了綬草不同萃取物體外抗氧化活性；建立了綬草不同萃取物總酚含量的測(cè)定方法，并經(jīng)過(guò)了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，綬草不同萃取物體外抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)?；谇叭薣5-7]關(guān)于綬草化學(xué)成分的研究結(jié)果，推測(cè)綬草乙酸乙酯萃取物總酚含量較高、抗氧化活性較強(qiáng)可能與其中含有較多的菲類、黃酮類等酚類成分有關(guān)。提示在后續(xù)進(jìn)行化學(xué)成分研究時(shí)，可將重點(diǎn)鎖定在乙酸乙酯萃取物；通過(guò)活性導(dǎo)向分離的方法，實(shí)現(xiàn)該萃取物中抗氧化成分的快速靶向分離，并通過(guò)對(duì)分離所得單體成分的抗氧化活性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步闡明綬草抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，為從綬草中尋找天然來(lái)源的抗氧化劑的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

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Comparisons of antioxidant activities and contents of total phenols of different extraction parts from Spiranthes sinensis

YAN XinWANGWeiLIULiang

(SchoolofMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225009,China)

Theinvitroantioxidant activities of different extractions ofSpiranthessinensis(Pers.)Ames were evaluated through DPPH and ABTS assays, and the total phenols contents were determined by Folin-Ciocalteu method. It was shown that all the different extraction parts ofS.sinensishad significantinvitroantioxidant activities in a dose-dependent manner; The antioxidant activities and total phenols contents were both ordered as follows: ethyl acetate extraction>n-butanol extraction> petroleum ether extraction. The results showed that theinvitroantioxidant activities were positively correlated with the total phenols contents of different extraction parts ofS.sinensis, theIC50values of scavenging DPPH· and ABTS+· of ethyl acetate extraction part were (45.270±0.005) and (75.420±0.015) μg/mL, respectively, its total phenols content was (13.861±0.002)%.

Spiranthessinensis(Pers.)Ames; extraction; antioxidant activity; total phenols content

揚(yáng)州市自然科學(xué)基金青年科技人才項(xiàng)目(編號(hào)：YZ2014022)；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(編號(hào)：x2016790)

嚴(yán)鑫，男，揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀碩士研究生。

劉量(1980-)，女，揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院講師，博士。

E-mail: enjoyyz@163.com

2015-12-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.035