補腎解毒方影響輻射小鼠TLR4信號通路下游炎性因子表達的機制研究*

李延暉　張　蓉　楊云霜　楊利丹

中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院(北京100088)

?

補腎解毒方影響輻射小鼠TLR4信號通路下游炎性因子表達的機制研究*

李延暉張蓉△楊云霜楊利丹

中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院(北京100088)

目的：觀察補腎解毒方對60Co γ射線輻射后小鼠TLR4(Toll like receptor-4)信號轉(zhuǎn)導通路下游相關(guān)炎性因子表達的影響并探討其作用機制。方法：將背景為C57BL/10J的小鼠(TLR4+/+)完全隨機分為TLR4+/+空白對照組、TLR4+/+輻射模型組、TLR4+/+中藥組，同等背景下TLR4基因敲除小鼠(TLR4-/-)完全隨機分為TLR4-/-空白對照組、TLR4-/-輻射模型組、TLR4-/-中藥組。除TLR4+/+空白對照組、TLR4-/-空白對照組外，其余四組小鼠均一次性接受60Co γ射線6Gy劑量的全身照射，觀察存活情況；記錄各組小鼠輻射后第1、14、30天脾臟IL-6、IL-10、IL-17、IL-18、IFN-γ、TGF-β1的數(shù)值。結(jié)果：TLR4+/+輻射模型組小鼠的脾臟IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ在輻射后第1d、第14d與空白對照組相比均有不同程度的增加，而TLR4+/+輻射模型組小鼠的IL-10和TGF-β1與空白對照組相比則有明顯減少。TLR4+/+中藥組小鼠的IL-6和IL-10在輻射后第1d均較模型組明顯恢復，IL-17、IL-18在第14d部分恢復，TGF-β1在第14d明顯恢復。TLR4-/-輻射模型組小鼠的各炎性細胞因子相對空白對照組亦有不同程度的變化，但TLR4-/-中藥組小鼠的炎性細胞因子表達相對輻射模型組無明顯統(tǒng)計學意義。結(jié)論：補腎解毒方通過TLR4信號途徑能顯著減輕核輻射損傷，影響各炎性細胞因子的表達。

主題詞輻射炎性因子信號通路

ABSTRACT

Objective: To observe the effect of Bushen Jiedu decoction on the expression of inflammatory factors in the downstream of TLR4 (like receptor-4 Toll) signal transduction pathway in mice after radiation of 60Co-γray and to explore its mechanism. Methods: The C57BL/ 10J background mice (TLR4+/+) were randomly divided into TLR4+/+blank control group, TLR4+/+radiation model group, TLR4+/+TCM group,under the same background TLR4 gene knockout mice (TLR4-/-) were randomly divided into TLR4-/-blank control group, TLR4-/-radiation model group, TLR4-/-TCM group. In addition to the two control groups, the rest of the four groups of mice were one-time accepted 6 Gy 60Co γ-ray dose total body irradiation. The survival of mice after radiation in each group was observed, and the values of IL-6、IL-10、IL-17、IL-18、IFN-γ、TGF-β1 in the spleen at 1 , 14and 30days were recorded.Results:IL-6, IL-17, IL-18, IFN-γof the TLR4+/+radiation model group mice increased in different degrees(P<0.01) and IL-10和TGF-β1 significantly decreased compared with the blank control group at 1 , 14and 30days after irradiation. Compared with the model group, IL-6 and IL-10 of the TLR4+/+TCM group restored obviously at 1 day, IL-17、IL-18 restored partially and TGF-β1 restored obviousl at 14 days. Inflammatory cytokines of the TLR4-/-radiation model group were changed in different degree compared with the blank control group. Inflammatory cytokines had no statistical significance between the TLR4-/-TCM group and the radiation model group. Conclusion: Bushen Jiedu decoction can significantly reduce the radiation injury and affect the expression of inflammatory cytokines through the TLR4 signal pathway. It has an ideal radiation protection function.

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，核能的應用越來越廣泛。在造福人類的同時，核能也給人類的健康與安全帶來嚴峻挑戰(zhàn)。各種核設(shè)施產(chǎn)生的輻射及其泄露的放射性物質(zhì)，嚴重影響到人類的健康與生命。輻射導致的多臟器放射性損傷至今仍是臨床上亟待解決的問題[1]。因此，探索輻射損傷相關(guān)分子機制、開發(fā)輻射防護藥物，對于國防和民用都具有不可忽略的意義[2]。中藥復方的優(yōu)點是低毒、高效、防治結(jié)合，這也使其成為新型核輻射防護劑的研究熱點，但中藥復方防護核輻射損傷的機制及作用靶點尚不明確，限制了其推廣及應用[3]。本研究組前期研究[4]結(jié)果顯示，六味地黃丸能夠顯著降低輻射損傷并保護重要臟器。我們將六味地黃丸進行優(yōu)化組合，在原方基礎(chǔ)上熟地黃用量減半，加冬蟲夏草、白花蛇舌草形成了補腎解毒方，擬從TLR4信號轉(zhuǎn)導途徑對補腎解毒方抗輻射作用機制及靶點進行研究。

1材料1.1動物SPF級健康雄性小鼠[合格證號SCXK(蘇)2010-0001]276只，由南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院提供。其中138只C57BL/10SCNJ TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠20±2g為南京大學—南京生物醫(yī)藥研究院直接提供，另外138只C57BL/10J (TLR4+/+)小鼠繁育出的子代小鼠20±2g為南京大學模式動物研究所從美國JAX公司代購的。

1.2藥品及試劑補腎解毒方組成：熟地黃、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮、白花蛇舌草各10g，山萸肉12g，冬蟲夏草3g，由康仁堂藥業(yè)有限公司配置成中藥顆粒，中藥顆粒加無菌水配成濃度為1.38g/ml的混合液。

1.3儀器電子天平(型號00000246)；γ輻照裝置(北京師范大學化學學院)。

2實驗方法2.1模型建立及分組采用隨機數(shù)字表法將138只TLR4+/+小鼠分為空白對照組(18只)、輻射模型組(60只)、中藥組(60只)。138只TLR4-/-小鼠分為空白對照組(18只)、輻射模型組(60只)、中藥組(60只)。除TLR4-/-和TLR4+/+空白對照組外，其余各組均一次性接受γ輻照裝置放射的60Co γ射線，由于實驗動物品系的不同，在前期研究[4]基礎(chǔ)上分別給予小鼠5Gy、6Gy、7Gy輻射劑量進行預實驗處理，發(fā)現(xiàn)6Gy是本實驗最為合適的劑量，總時長5min，劑量率1.2Gy/min。

2.2給藥方法對所有實驗小鼠適應性喂養(yǎng)7d后，每天08:00 TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白對照組、輻射模型組給予0.2ml生理鹽水， TLR4-/-和TLR4+/+小鼠中藥組給予補腎解毒方13.50g/(kg·d)，連續(xù)灌胃10d，第11天進行1次性60Co γ射線照射，照射后第2天開始繼續(xù)灌胃14d。

2.3觀察指標及方法實驗期間觀察小鼠一般狀況，包括精神、毛色、體重、飲食、活動等情況。TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白對照組分別于輻射后第1、14、30天各取材6只； TLR4-/-和TLR4+/+小鼠輻射模型組、中藥組分別于輻射后第1天取材7只，第14天取材每組存活小鼠數(shù)量的1/2，第30天取材每組剩余存活的小鼠。處死小鼠后，取脾臟制作脾臟單細胞懸液，Elisa法測定各組小鼠炎性細胞因子。

2.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用平均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05作為有統(tǒng)計學差異。

3結(jié)果3.1一般情況觀察TLR4-/-和TLR4+/+小鼠空白對照組在整個實驗階段一般情況良好，毛色光亮，體重、飲食均正常。其余各組小鼠輻射后第1天均出現(xiàn)狂躁、易驚恐不安、飲食下降、體重減輕等情況；第2天后開始出現(xiàn)精神萎靡，毛色晦暗甚至片狀脫毛，飲食量下降明顯，體重普遍減輕。對自然死亡的小鼠進行解剖后發(fā)現(xiàn)，普遍存在出血現(xiàn)象，且部分小鼠出現(xiàn)肝腫大、肝脾小結(jié)節(jié)、腹水，肝臟、腎臟表面有成片點狀膿腫，胃黏膜損傷，腸梗阻、腸脹氣，還發(fā)現(xiàn)個別小鼠出現(xiàn)甲狀腺腫大、生殖器瘀血等現(xiàn)象。

3.2各組小鼠死亡情況輻射前TLR4+/+小鼠輻射模型組小鼠57只，中藥組55只；TLR4-/-小鼠模型組、中藥組各58只。TLR4+/+小鼠輻射模型組在輻射后第2天出現(xiàn)死亡，至第14天共死亡41只，中藥組輻射后第7天出現(xiàn)死亡小鼠，至第10天共死亡15只；TLR4-/-小鼠輻射模型組輻射后第5天出現(xiàn)死亡，至第13天共死亡39只，中藥組在輻射后第4天出現(xiàn)死亡小鼠，至第13天共死亡38只。

3.3各組小鼠炎性細胞因子表達情況TLR4+/+輻射模型組小鼠的脾臟IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ在輻射后第1d、第14d與空白對照組相比均有不同程度的增加(P<0.01)，而TLR4+/+輻射模型組小鼠的IL-10和TGF-β1與空白對照組相比則有明顯減少(P<0.01)。TLR4+/+中藥組小鼠的IL-6和IL-10在輻射后第1d均較模型組明顯恢復(P<0.01)，IL-17、IL-18在第14d部分恢復(P<0.05)，TGF-β1在第14d明顯恢復(P<0.01)。TLR4-/-輻射模型組小鼠的各炎性細胞因子相對空白對照組亦有不同程度的變化，但TLR4-/-中藥組小鼠的炎性細胞因子表達相對輻射模型組無明顯統(tǒng)計學意義，見表1-6。

表1　輻射后各組小鼠IL-6的表達變化

表2　輻射后各組小鼠IL-10的表達變化

表3　輻射后各組小鼠IL-17的表達變化

表4　輻射后各組小鼠IL-18的表達變化

表5　輻射后各組小鼠IFN-γ的表達變化

表6　輻射后各組小鼠TGF-β1的表達變化

4討論既往研究表明，電離輻射可導致多個細胞和組織損傷，誘導機體產(chǎn)生一系列特異性和非特異性免疫應答以及炎癥反應[5]。其中，近70%的傷害是間接引起強烈的氧化應激反應[6]。而中醫(yī)理論認為，高能射線是一種火邪、熱毒，其毒邪兼具火熱邪氣的特點，熱毒蘊于體內(nèi)，充斥三焦[7]。補腎解毒方是由滋陰補腎代表方六味地黃丸優(yōu)化組合而來，在原方基礎(chǔ)上熟地用量減至10g，加冬蟲夏草3g、白花蛇舌草10g，在滋陰補腎的同時亦有補益氣血、固護正氣、清熱解毒之效，達到標本同治的目的。

有研究顯示TLR4信號轉(zhuǎn)導通路是輻射免疫損傷的重要途徑，TLR4信號通路受到基因的干預，通過觀察該通路下游炎性因子的表達變化能夠反應補腎解毒方在輻射損傷中起到的炎癥防護作用[8]。既往研究表明，電離輻射會引起機體炎性因子IL-1β升高,產(chǎn)生氧化應激反應[2]，且IL-1β是放射性腦損傷的重要炎癥介質(zhì)之一[9]。IL-6、IL-17、TGF-β1是放射性肺損傷的炎性表達因子，其中，IL-17通過抑制 p53蛋白的表達，從而抑制輻射引發(fā)的細胞凋亡[10]。IFN-γ和IL-10在蛋白 ZO-1上的表達分別促進和減少腸上皮細胞凋亡[11]。IL-18的水平升高亦能反映輻射劑量和輻射損傷的嚴重程度[12]。

本研究結(jié)果顯示，TLR4+/+輻射模型組小鼠的炎性細胞因子在輻射后第1天、第14天與空白對照組相比均有不同程度的變化。TLR4+/+中藥組小鼠的IL-6和IL-10在輻射后第1天均較模型組明顯恢復，IL-17、IL-18 、TGF-β1在第14d部分或明顯恢復。但TLR4-/-中藥組小鼠的炎性細胞因子表達相對輻射模型組無明顯統(tǒng)計學意義。此研究結(jié)果表明，TLR4通路在補腎解毒方對輻射小鼠輻射防護中起到的信號轉(zhuǎn)導作用確切，補腎解毒方可通過TLR4信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮輻射防護作用，延長存活時間，抑制輻射損傷導致的氧化應激反應，及早清除系統(tǒng)無法修復的組織、細胞，保持基因組的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮免疫抑制作用，這為今后我們進一步優(yōu)化補腎解毒方等輻射防護劑提供一種新的思路及理論基礎(chǔ)。

[1]Tajima G, Delisle AJ, Hoang K, et al. Immune system phenotyping of radiation and radiation combined injury in outbred mice [J].Radiat Res,2013,179(1):101-112.

[2]付岳.白藜蘆醇抑制輻射誘導的NLRP3炎癥蛋白復合體激活的機理研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院,2014.

[3]黃黎明,石鵬,張琳靜，等.抗輻射復方中藥對輻射損傷小鼠的防護作用研究[J].中國藥事,2011,25:132-134.

[4]李延暉,張蓉,鄒練，等.八珍湯、六味地黃丸、自擬扶正解毒方劑對60Coγ-射線致大鼠生殖系統(tǒng)損傷的防治作用[J].山東醫(yī)藥,2014,54(43):31-33.

[5]楊曉云,馬瓊,潘秀頡，等.6Gyγ射線對小鼠Th17細胞含量和血清IL-17A含量的影響[J].感染、炎癥、修復,2013,14(1):19-21.

[6]Anuranjani, Bala M.Concerted action of Nrf2-ARE pathway, MRN complex, HMGB1 and inflammatory cytokines - implication in modification of radiation damage[J].Redox Biol,2014,28 (2):832-846.

[7]張蓉,駱斌,李峰，等.從毒邪致病論電離輻射損傷的中醫(yī)病機[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2007,30(9):595-596.

[8]Riehl TE,Foster L,Stenson WF. Hyaluronic acid is radioprotective in the intestine through a TLR4 and COX-2-mediated mechanism[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2012,302(3): 309-316.

[9]Tong F, Zhang J, Liu L,et al. Corilagin Attenuates Radiation-Induced Brain Injury in Mice[J].Mol Neurobiol, 2015 Dec 15.

[10]Li Q, Xu X, Zhong W, et al. IL-17 induces radiation resistance of B lymphoma cells by suppressing p53 expression and thereby inhibiting irradiation-triggered apoptosis[J].Cell Mol Immunol, 2015,12(3):366-372

[11]Wang H, Sun RT, Li Y, et al. HGF Gene Modification in Mesenchymal Stem Cells Reduces adiation-Induced Intestinal Injury by Modulating Immunity[J].PLoS One, 2015,10(5):e0124420.

[12]Ha CT, Li XH, Fu D, et al.Circulating interleukin-18 as a biomarker of total-body radiation exposure in mice, minipigs, and nonhuman primates (NHP)[J].PLoS One, 2014,9(10):e109249.

(收稿2016-03-17；修回2016-05-20)

Mechanism study on the expression of inflammatory factors in the downstream of TLR4 signaling pathway in mice with Bushen Jiedu decoction

Chinese People’s Liberation Army Rocket Army General Hospital(Beijing 100088)

Li Yanhui Zhang Rong Yang Yunshuang et al

RadiationInflammatory factorSignaling pathway

*國家自然科學基金資助項目(81202637)

R114.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.09.071