中國臨床球形孢子絲菌菌絲相藥物敏感性分析

賀羽　黃宜進(jìn)　趙秘密　周汛,3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶 400016;2.四川省南部縣人民醫(yī)院，南充 637300；3.重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶 400021)

?

·論著·

中國臨床球形孢子絲菌菌絲相藥物敏感性分析

賀羽1黃宜進(jìn)2趙秘密1周汛1,3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶 400016;2.四川省南部縣人民醫(yī)院，南充 637300；3.重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶 400021)

目的檢測我國臨床球形孢子絲菌菌絲相對5種抗真菌藥物的體外敏感性，同時(shí)對比我國不同地區(qū)菌株藥物敏感性的差異。方法將重慶、吉林、北京地區(qū)既往基因鑒定為球形孢子絲菌的100株臨床菌株接種于2%馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d獲得菌絲相。依據(jù)美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)制定的M38-A2方案，采用微量液基稀釋法檢測菌絲相對碘化鉀、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、兩性霉素B的體外最低抑菌濃度(MIC)。質(zhì)控菌株為近平滑念菌ATCC22019。結(jié)果碘化鉀體外無抗真菌活性，特比萘芬MIC幾何均值為0.14 μg/mL，伊曲康唑和兩性霉素B MIC幾何均值分別為0.79 μg/mL和0.63 μg/mL，氟康唑MIC幾何均值為45.89 μg/mL。發(fā)現(xiàn)7株對伊曲康唑耐藥菌株，吉林地區(qū)相對較多，但不同地區(qū)菌株的藥物MIC值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論碘化鉀無體外抗真菌活性，我國臨床球形孢子絲菌對特比萘芬最敏感，其次為伊曲康唑和兩性霉素B，對氟康唑敏感性最差，不同地區(qū)菌株對抗真菌藥物的敏感性沒有明顯差異。

球形孢子絲菌；菌絲相；藥敏實(shí)驗(yàn)；微量液基稀釋法

[Chin J Mycol，2016，11(4):209-212]

孢子絲菌病是孢子絲菌復(fù)合體感染人或動(dòng)物引起的深部真菌病,該復(fù)合體包括6個(gè)菌種,不同菌種在地理分布、毒力、抗真菌藥物敏感性上存在差異[1-2]，我國致病菌種以球形孢子絲菌為主[3-4]。碘化鉀是傳統(tǒng)有效的首選藥物，研究表明其在體外并沒有抗真菌活性,其作用機(jī)制可能是通過機(jī)體內(nèi)的髓過氧化物酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成碘，而起到抑制真菌細(xì)胞形成和破壞其超微結(jié)構(gòu)的滅菌作用[5]。目前美國感染病協(xié)會(huì)(Infectious Diseases Society of America,IDSA)推薦伊曲康唑?yàn)楣潭ㄐ秃土馨凸苄玩咦咏z菌病的首選藥物[5]，然而耐藥的報(bào)道逐年增多[6-7],并且因禁忌癥、副作用等不能使用時(shí)，碘化鉀、特比萘芬或氟康唑?yàn)橥扑]的次選藥物。兩性霉素B是治療播散型孢子絲菌病的首選藥物[8]。為了解碘化鉀(Potassium iodide,KI)、特比萘芬(Terbinafin,TRB)、伊曲康唑(Itraconazole,ITC)、氟康唑(Fluconazole,FLC)、兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)對我國臨床球形孢子絲菌的體外抗菌活性，同時(shí)對比我國不同地區(qū)菌株藥物敏感性的差異，從而為臨床用藥提供依據(jù)，本研究對既往經(jīng)基因鑒定為球形孢子絲菌的100株臨床菌株進(jìn)行藥物敏感性測定。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

100株孢子絲菌分離自孢子絲菌病患者皮損處。37株來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，編號(hào)C01-C37；47株來自吉林大學(xué)第二醫(yī)院，編號(hào)J1-J47；16株來自北京大學(xué)附屬醫(yī)院，編號(hào)B01-B16。所有菌株既往經(jīng)基因鑒定為球形孢子絲菌。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019。

1.2抗真菌藥物

KI(Sigma公司)、TRB(中國鴻兵有限公司)、ITC(Adamas公司)、FLC(中國鴻兵有限公司)、AmB(重慶鼎國生物技術(shù)有限公司)。FLC、KI用無菌蒸餾水分別溶解為1 280 μg/mL、5 000 μg/mL，其余藥物用二甲基亞楓(DMSO)溶解為1 600 μg/mL，d=0.22 μm無菌濾器濾過除菌后-70℃儲(chǔ)存。使用前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至兩倍工作濃度。KI工作濃度為0.98～500 μg/mL，F(xiàn)LC為0.125～64 μg/mL，其余藥物為0.031 3～16 μg/mL。

1.3菌懸液制備

菌株接種于2%馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d獲得菌絲相。試管中加入8.5 g/L無菌生理鹽水3 mL，無菌移液管輕輕刮取菌落表面，反復(fù)吹打后靜置15 min，取上層均質(zhì)溶液至無菌EP管中,漩渦振蕩器混勻，酶標(biāo)儀在530 nm下調(diào)整A值為0.09～0.11，再用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋50倍獲得兩倍終濃度菌懸液(終濃度0.4×104～5×104CFU/mL)[9-10]，同時(shí)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.4真菌藥敏實(shí)驗(yàn)

96孔板每行第1～10孔分別依次加入不同濃度的同種藥液100 μL和菌懸液100 μL，第11孔加入100 μL菌懸液和100 μL RPMI1640培養(yǎng)基作為陽性對照，第12孔加入200 μL RPMI1640培養(yǎng)基作為陰性對照。28℃靜置培養(yǎng)46～50 h后，酶標(biāo)儀530 nm下測定吸光光度值，與陽性對照孔相比下降100%對應(yīng)的藥物濃度為ITC、AmB、KI的MIC值，下降80%為TRB的MIC值，下降50%為FLC的MIC值[9]。質(zhì)控菌株ATCC22019的藥物MIC值在質(zhì)控范圍內(nèi)認(rèn)為實(shí)驗(yàn)方法可靠。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

記錄MIC值，計(jì)算幾何均數(shù)(GM)、MIC50、MIC90，使用SPSS 17.0軟件對MIC值進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

KI對所有菌株無體外抗菌活性，梯度濃度范圍內(nèi)所有測試孔及陽性對照孔均有菌生長。TRB的MIC范圍為0.03～0.5 μg/mL，MIC50為0.13 μg/mL，MIC90為0.5 μg/mL，GM為0.14 μg/mL；ITC的MIC范圍為0.13～16 μg/mL，MIC50為1.0 μg/mL，MIC90為2.0 μg/mL，GM為0.79 μg/mL；AmB的MIC范圍為0.13～4 μg/mL，MIC50為1.0 μg/mL，MIC90為2.0 μg/mL，GM為0.63 μg/mL；FLC的MIC范圍為4～>64 μg/mL，MIC50為64 μg/mL，MIC90為64 μg/mL，GM為45.89 μg/mL(見表1)。不同藥物MIC值進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，多重比較顯示ITC與AmB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069>0.05)，其余藥物兩兩比較顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，可見TRB最敏感，其次為ITC和AmB，F(xiàn)LC敏感性最差。

對重慶(n=37)、吉林(n=47)、北京(n=16)地區(qū)菌株的MIC值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，TRB、ITC、AmB、FLC對不同地區(qū)球形孢子絲菌的MIC值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.485、0.118、0.863、0.953，均>0.05)。

3　討　　論

孢子絲菌是雙相型真菌，酵母相和菌絲相的藥物MIC值存在差異，研究發(fā)現(xiàn)菌絲相普遍高于酵母相[11-12]，導(dǎo)致這種差異的機(jī)制并不明確，哪種時(shí)相的藥敏結(jié)果能更準(zhǔn)確反應(yīng)臨床療效仍需要深入研究[12]。雙相型孢子絲菌的藥敏實(shí)驗(yàn)方法包括微量稀釋法、E-test法、紙片擴(kuò)散法等。紙片擴(kuò)散法主要推薦用于酵母相的藥物敏感性檢測。報(bào)道稱E-test法與微量稀釋法一致性較好，準(zhǔn)確性高[13]，但價(jià)格偏貴，而酵母相體外培養(yǎng)不易獲得，因此本實(shí)驗(yàn)依據(jù)CLSI的M38-A2方案，采用微量液基稀釋法檢測我國臨床球形孢子絲菌菌絲相對5種抗真菌藥物的敏感性。

表1球形孢子絲菌菌絲相微量液基稀釋法MIC測定結(jié)果(n=100)

Tab.1Susceptibility testing results of mycelium phase of 100 Sporothrix globosa isolates according to microdilution broth method(n=100)

地區(qū)MIC(μg/mL)TRBITCAmBFLC重慶Range0.03～0.50.13～80.13～48～>64(n=37)MIC500.130.50.564MIC900.252164GM0.120.640.5847.42吉林Range0.03～0.50.25～160.25～44～>64(n=47)MIC500.1310.564MIC900.52264GM0.150.880.6744.92北京Range0.03～0.50.25～40.13～28～>64(n=16)MIC500.1310.564MIC900.52264GM0.140.960.6245.25總計(jì)Range0.03～0.50.13～160.13～44～>64(n=100)MIC500.131164MIC900.52264GM0.140.790.6345.89

研究發(fā)現(xiàn)特比萘芬在體外具有最低MIC值(GM=0.14,見表1)，抗菌活性最強(qiáng)，前期報(bào)道也表明其體外抗菌活性高于伊曲康唑和兩性霉素B[6,14]，本研究結(jié)果顯示特比萘芬可推薦為孢子絲菌病的一線藥物，而該藥主要用于固定型和淋巴管型的治療[15]，對于播散型的治療效果欠佳[16]，因此臨床用藥需考慮體外藥敏與體內(nèi)療效的符合率問題。伊曲康唑和兩性霉素B分別是IDSA推薦用于固定型和播散型孢子絲菌病的首選治療藥物，本實(shí)驗(yàn)中顯示了較好的MIC值。目前孢子絲菌的藥敏MIC終點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)沒有確立，M38-A2方案認(rèn)為伊曲康唑MIC≥4.0 μg/mL應(yīng)考慮為耐藥[6]，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)7%(7/100)菌株包括吉林4株、重慶2株、北京1株對伊曲康唑耐藥，與Ottonelli Stopiglia試驗(yàn)中報(bào)道的5.9%耐藥率相近[6]，吉林耐藥株相對較多,可能與該地區(qū)孢子絲菌最流行[17]，菌株發(fā)生變異有關(guān)，總體來說伊曲康唑的抗菌活性地區(qū)間未見明顯差異。根據(jù)Silveira等提出的兩性霉素B藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn)[18]，本實(shí)驗(yàn)中該藥對10%(MIC>1 μg/mL)的菌株顯示出較低的抗菌活性，明顯低于其報(bào)道的79%，可見我國球形孢子絲菌對兩性霉素B較為敏感。氟康唑MIC值總體較高，顯示出較低的體外抗菌活性，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[16,19]，而氟康唑是治療孢子絲菌病的二線藥物，具有很好的臨床療效[20-21]，這種體外藥敏和體內(nèi)療效的差異可能與藥物體內(nèi)代謝等多種因素有關(guān)。碘化鉀是治療固定型孢子絲菌病的傳統(tǒng)有效藥物，而孢子絲菌與10%飽和碘化鉀體外培養(yǎng)可存活表明其并沒有體外抗菌活性[22-23]，其作用機(jī)制尚不明確，Coskun等認(rèn)為真菌暴露于機(jī)體防御系統(tǒng)時(shí)，碘化鉀通過免疫或非免疫機(jī)制來抑制真菌肉芽腫的形成，但此過程機(jī)體中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量并沒有增加。也有研究認(rèn)為碘化鉀是通過機(jī)體內(nèi)的髓過氧化物酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成碘，而起到抑制真菌細(xì)胞形成和破壞其超微結(jié)構(gòu)的滅菌作用，故沒有體外抗菌活性[5,23]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有球形孢子絲菌對碘化鉀均不敏感，再次證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

綜上可見我國臨床球形孢子絲菌與孢子絲菌復(fù)合體各隱含種的藥物敏感性基本一致[6]。此外通過對比我國吉林、北京、重慶地區(qū)臨床菌株對抗真菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)吉林地區(qū)耐藥菌株分布相對較多，但總體來說對5種試驗(yàn)藥物的敏感性沒有明顯地區(qū)差異，這可能由基因型決定。雖然體外藥敏結(jié)果和臨床療效受多方面因素的影響，前者不能完全指導(dǎo)臨床用藥，但仍有重要的參考意義。

[1]Tellez MD,Batista-Duharte A,Portuondo D,et al.Sporothrix schenckii complex biology:environment and fungal pathogenicity[J].Microbiology,2014,160(11):2352-2365.

[2]Marimon R,Gene J,Cano J,et al.Molecular phylogeny of Sporothrix schenckii[J].J Clin Microbiol,2006,44(9):3251-3256.

[3]譚靜文,劉偉,萬喆,等.來自中國北方部分地區(qū)33株孢子絲菌菌株的表型和基因型鑒定[J].菌物學(xué)報(bào),2013,32(2):161-167.

[4]Yu X,Wan Z,Zhang Z,et al.Phenotypic and molecular identification of Sporothrix isolates of clinical origin in Northeast China[J].Mycopathologia,2013,176(1-2):67-74.

[5]Mahajan VK.Sporotrichosis:an overview and therapeutic options[J].Dermatol Res Pract,2014,2014(2013):272376.

[6]Ottonelli Stopiglia CD,Magagnin CM,Castrillon MR,et al.Antifungal susceptibilities and identification of species of the Sporothrix schenckii complex isolated in Brazil[J].Med Mycol,2014,52(1):56-64.

[7]王潤超,王愛平,萬喆,等.特比萘芬聯(lián)合伊曲康唑治療孢子絲菌病失敗1例[J].中國真菌學(xué)雜志,2013,8(5):294-296.

[8]Kauffman CA,Bustamante B,Chapman SW et al,Clinical practice guidelines for the management of sporotrichosis:2007 update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2007,45(10):1255-1265.

[9]Stopiglia,CD,Marchese DP,Heidrich D,et al,Comparison between two culture media for in vitro evaluation of antifungal susceptibility of the Sporothrix schenckii complex[J].An Bras Dermatol,2012,87(4):561-565.

[10]劉錦燕,項(xiàng)明潔.抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].中國感染與化療雜志,2009,24(12):927-931.

[11]Kohler LM,Soares BM,de Assis Santos D,et al.In vitro susceptibility of isolates of Sporothrix schenckii to amphotericin B,itraconazole,and terbinafine:comparison of yeast and mycelial forms[J].Can J Microbiol,2006,52(9):843-847.

[12]薛汝增,張靜,黃懷球.申克孢子絲菌體外藥敏試驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國真菌學(xué)雜志,2008,3(06):372-374.

[13]張曉冬,張艷,徐莉.E-test法和Rosco紙片法檢測申克孢子絲菌對伊曲康唑和氟康唑的敏感性試驗(yàn)[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(11):992-993.

[14]Borba-Santos LP,Rodrigues AM,Gagini TB,et al.Susceptibility of Sporothrix brasiliensis isolates to amphotericin B,azoles,and terbinafine[J].Med Mycol,2015,53(2):178-188.

[15]Chapman SW,Pappas P,Kauffmann C,et al.Comparative evaluation of the efficacy and safety of two doses of terbinafine(500 and 1000 mg day(-1)) in the treatment of cutaneous or lymphocutaneous sporotrichosis[J].Mycoses,2004,47(1-2):62-68.

[16]Marimon R,Gene J,Cano J,et al.In vitro antifungal susceptibilities of five species of Sporothrix[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(2):732-734.

[17]Song Y,Li SS,Zhong SX,et al.Report of 457 sporotrichosis cases from Jilin province,northeast China,a serious endemic region[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27(3):313-318.

[18]Silveira CP,Torres-Rodriguez JM,Alvarado-Ramirez,et al,MICs and minimum fungicidal concentrations of amphotericin B,itraconazole,posaconazole and terbinafine in Sporothrix schenckii[J].J Med Microbiol,2009,58(12):1607-1610.

[19]Trilles L,Fernandez-Torres B,Wanke B,et al.In vitro antifungal susceptibilities of Sporothrix schenckii in two growth phases[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(9):3952-3954.

[20]Crothers SL,White SD,Ihrke PJ,et al.Sporotrichosis:a retrospective evaluation of 23 cases seen in northern California(1987-2007)[J].Vet Dermatol,2009,20(4):249-259.

[21]張曉冬,徐莉,張莉敏.氟康唑治療孢子絲菌病的臨床療效及體外抗真菌藥敏試驗(yàn)研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(2):129-130.

[22]Coskun B,Saral Y,Akpolat N,et al.Sporotrichosis successfully treated with terbinafine and potassium iodide:case report and review of the literature[J].Mycopathologia,2004,158(1):53-56.

[23]Hiruma M,Kagawa S.Ultrastructure of Sporothrix schenckii treated with iodine-potassium iodide solution[J].Mycopathologia,1987,97(2):121-127.

[本文編輯]施慧

In vitro antifungal susceptibilities of mycelium phase of Sporothrix globosa in China

HE Yu1,HUANG Yi-jin2,ZHAO Mi-mi1,ZHOU Xun1,3

(1.Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China；2.People's Hospital of Nanbu Prefecture of Sichuan,Nanchong 637300,China；3.Department of Dermatology and Cosmetology,Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing 400021,China)

ObjectiveTo investigate the activities of five antifungal agents on mycelia form of Sporothrix globosa and compare the differences in antifungal susceptibilities in different areas of China.MethodsTotal 100 isolates which were identified as Sporothrix globosa by molecular identification from Chongqing,Beijing and Jilin were subcultured on 2% potato-dextrose agar plates at 25℃ for 7 d.Then according to modified CLSI microdilution method M38-A2,MICS were measured to evaluate the antifungal activities of potassium iodide(KI),itraconazole(ITC),terbinafin(TRB),fluconazole(FLC),amphotericin B(AmB) to these isolates in vitro.Candida parapsilosis ATCC22019 was used as quality control.ResultsPotassium iodide showed no antifungal activity against any Sporothrix globosa isolates.TRB gave the lowest geometric mean(GM=0.14 μg/mL) MIC.ITC and AmB showed almost the same activity against all strains tested and the GM was 0.79 μg/mL and 0.63 μg/mL respectively.FLC gave the highest GM MIC(45.89 μg/mL).Seven isolates(four from Jilin,two from Chongqing,one from beijing) were found to be itraconazole-resistant,There was no difference in susceptibility according to the geographical source of the isolates(P>0.05).ConclusionPotassium iodide showed no antifungal activities in vitro.TRB was the most active drug,followed by the ITC and AmB.FLC was the least effective drug.There was no difference in antifungal susceptibilities in different areas of China.

Sporothrix globosa;mycelium phase;antifungal susceptibility test;micro-broth dilution method

國家自然科學(xué)基金(31270062)

賀羽，女(漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:15123825300@163.com

周汛,E-mail:zhouxun123@sina.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0209-04

2015-09-29