小鼠骨髓樹突狀細胞對白念珠菌吞噬、殺傷作用的研究

王瓊　史冬梅　劉維達

(1.中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京 210042;2.濟寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟寧 272011)

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·論著·

小鼠骨髓樹突狀細胞對白念珠菌吞噬、殺傷作用的研究

王瓊1史冬梅2劉維達1

(1.中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京 210042;2.濟寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟寧 272011)

目的體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)并與白念珠菌共同孵育，研究不同濃度的DC對白念珠菌的吞噬、殺傷作用，并研究隨著共孵育時間的延長DC表型的變化及其吞噬、殺傷白念珠菌能力的變化。方法無菌條件下分離培養(yǎng)C57小鼠骨髓DC；倒置顯微鏡下觀察DC的形態(tài)；Cellometer Mini細胞計數(shù)儀測定DC生長曲線及細胞直徑變化；流式細胞儀檢測DC及白念珠菌刺激后DC表面標志物CD11c及其表面分子MHCⅡ、CD40、CD80及CD86的表達；光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀測定DC對白念珠菌的吞噬及殺傷作用。結(jié)果體外培養(yǎng)10 d小鼠骨髓DC，倒置顯微鏡觀察可見典型DC形態(tài)；隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸增大，培養(yǎng)第10天時，細胞直徑分布最多的為10.2 μm；生長曲線顯示，DC呈倍數(shù)增長，第2～9天為細胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達到頂峰。培養(yǎng)第10天，未經(jīng)白念珠菌刺激的DC表面CD11c分子及CD80分子高水平表達，CD40、CD86及MHCⅡ低表達；經(jīng)白念珠菌刺激后，DC表面CD11c分子、CD80、CD40、CD86及MHCⅡ均高表達，呈成熟DC表型。激光共聚焦(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)及流式細胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測DC對白念珠菌吞噬作用，當DC與白念珠菌的比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min～1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)；當DC與白念珠菌比例為2∶1、1∶2及1∶4，隨著DC細胞所占比例的減小，DC細胞吞噬作用增強，當比例為1∶4時，DC吞噬作用最強，且隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min～1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)。顯微鏡檢測DC對白念珠菌殺傷率，可見隨著時間的延長，各實驗組的殺傷率下降(P=0.000)；當DC∶白念珠菌=1∶1時，較2∶1時，殺傷率明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)論小鼠骨髓細胞體外經(jīng)GM-CSF誘導可培養(yǎng)DC具有較高的純度，呈未成熟細胞表型；且每只C57小鼠可獲得3×107總數(shù)的細胞，可滿足一些實驗的DC用量。經(jīng)白念珠菌刺激后DC表型成熟；在一定的比率范圍內(nèi)，DC對白念珠菌有較強的吞噬及殺傷作用，其吞噬作用隨著DC與白念珠菌比例的減小而增強。且隨著兩者作用時間的延長，DC對白念珠菌的吞噬作用逐漸增強而殺傷作用逐漸減弱。

骨髓；樹突狀細胞；白念珠菌；吞噬；殺傷

[Chin J Mycol，2016，11(4):193-200]

白念珠菌是一種寄生在健康宿主消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜的機會性致病真菌。一旦機體免疫力下降或者正常菌群平衡被破壞，它就會在黏膜表面大量繁殖并形成菌絲、侵入深層組織、引起念珠菌系統(tǒng)性感染，且這種感染常常是致命性的。白念珠菌入侵人體的第一道防線即是樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)，DC是連接天然免疫和適應性免疫的橋梁，負責監(jiān)查機體中各種抗原成分并提呈抗原至下游免疫反應，在抗真菌免疫應答中起關鍵作用[1-3]。本研究通過原代分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC，檢測不同比例下其對白念珠菌吞噬及殺傷作用，為臨床進一步研究與應用DC進行白念珠菌病的免疫治療提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級C57小鼠，雌性，6～8周，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供(動物合格證編號SCXK(蘇2012-0004))提供。白念珠菌標準菌株(ATCC5314)，由中國醫(yī)學真菌保藏管理中心保藏。重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，Propetech公司)、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、PBS緩沖液(實驗室自配)、75%乙醇(實驗室自配)、胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、FITC(sigma公司)、抗鼠CD11c、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ熒光抗體(eBioscience公司)。

1.2小鼠骨髓來源DC的培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

取C57小鼠，頸椎脫臼處死，立即浸入75%乙醇中5～10 min；在超凈工作臺中，無菌手術取出脛骨及股骨，盡量將肌肉和結(jié)締組織去除干凈。放于PBS緩沖液中，剪掉骨的兩端，用1 mL無菌注射器反復沖洗骨髓腔，直至骨變白，將沖洗液收入15 mL離心管中，離心(800×g，5 min)棄上清，收集沉淀的骨髓細胞。以含10% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，并加入200 U/mL GM-CSF細胞因子，將細胞搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天第2天加入等量含有200 U/mL GM-CSF的完全培養(yǎng)基；第6天、第8天半量換液。每天觀察DC形態(tài)變化、大小、數(shù)量、分布及細胞集落生長狀況，于培養(yǎng)后第1、3、5、7、10天拍照并用Cellometer Mini細胞計數(shù)儀記錄細胞生長直徑變化。

1.3小鼠骨髓來源DC生長曲線

取原代分離小鼠骨髓DC，將細胞懸液按照2×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板，12 h后開始計數(shù)，每天取3個孔，用Cellometer Mini細胞計數(shù)儀分別計數(shù)，計算平均值，共計10 d。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.4流式細胞儀檢測DC表面分子的表達

收集培養(yǎng)第10天的DC，分為處理組和對照組。處理組與白念珠菌共培養(yǎng)1 h，對照組不加白念珠菌，流式細胞術檢測處理組及對照組的DC表型。將培養(yǎng)第7天的細胞用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。加入FITC標記的抗鼠CD11c熒光抗體，PE標記的抗鼠CD40、CD80、CD86、MHCⅡ熒光抗體，室溫避光孵育20 min，洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2.5 mL，去除游離的熒光抗體，再用2%的多聚甲醛固定液500 μL重懸細胞，流式細胞儀檢測CD11c 、CD40、CD80、CD86、MHCⅡ分子的表達，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.5激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用[4]

白念珠菌培養(yǎng)及染色白念珠菌于沙堡弱培養(yǎng)基(1%蛋白胨，2%瓊脂，4%麥芽糖)培養(yǎng)48 h，挑取沙堡弱培養(yǎng)基上的白念珠菌轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物)，30℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)8 h。取上述培養(yǎng)好的白念珠菌，離心(1 500×g，5 min)，PBS洗2遍，調(diào)整菌液濃度至5×105/mL，倒掉上清后，加入200 μL FITC溶液(1.25 mmol/L FITC溶于含0.5% DMSO的0.1 mmol/L NaHCO3溶液中，PH9.0)標記，37℃，避光振搖染色1.5 h，PBS沖洗2遍，備用。

DC細胞與白念珠菌共培養(yǎng)取培養(yǎng)第10天的DC，每個培養(yǎng)皿接種5×105個細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。分別按DC∶白念珠菌2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的比例加入FITC熒光標記的白念珠菌作為試驗組，同時按相同比例加入未染色白念珠菌作為對照組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)1 h；將共培養(yǎng)物加入離心管中，PBS洗滌2次，棄掉上清液，后按照PKH26染液說明書進行后續(xù)染色操作：向上述沉淀中加入少量的稀釋液C重懸細胞，后加入事先準備好的PKH26染液(用稀釋液C稀釋)，立即用吸管均勻快速混合樣品，室溫孵育4 min(期間輕輕顛倒離心管混勻使染色充分)，加入等量血清終止染色反應，孵育1 min，用等量含血清培養(yǎng)基稀釋中止的反應液，800 g離心10 min，去上清，PBS清洗3次，制片，激光共聚焦檢測。

1.6流式細胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬作用

按照“DC細胞與白念珠菌共培養(yǎng)”的步驟，DC細胞和FITC染色的白念珠菌分別共培養(yǎng)30 min、1 h、1.5 h后，每孔加入100 μL臺盼藍(250 mg/mL)，室溫放置1 min以淬滅熒光，PBS洗滌2遍，再用2%的多聚甲醛固定液500 μL重懸，流式細胞儀檢測FITC熒光的表達，同時設DC細胞和未染色的白念珠菌做陰性對照。

1.7DC對白念珠菌的殺傷作用[5]

收集第10天的DC，按每孔4×104的密度接種于96孔板，每孔加入100 μL含10% FCS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，并加入200 U/mL GM-CSF細胞因子，將細胞搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。之后實驗組分別按DC∶白念珠菌2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的比例加入新鮮振搖過夜的白念珠菌，后每孔1∶6倍比稀釋；對照組中不加細胞，白念珠菌接種比例同實驗組。所有組均設3個復孔。分別于共培養(yǎng)后24 h、48 h用顯微鏡計數(shù)96孔板中的菌落數(shù)，從左至右菌落數(shù)逐漸減少，觀察可清楚計數(shù)的孔(比如第6列可清楚計數(shù)則乘以依次的稀釋倍數(shù)65，即為第一列的菌落數(shù))。DC對白念珠菌殺傷比率=(1-實驗組菌落數(shù)/對照組菌落數(shù))×100%。所有組均設3個復孔。

1.8統(tǒng)計學方法

2　結(jié)　　果

2.1倒置顯微鏡觀察小鼠骨髓來源DC形態(tài)

從倒置顯微鏡下可以看出，新鮮分離的小鼠骨髓來源DC呈圓形、透亮、體積??；第3天后，在細胞因子的刺激下細胞數(shù)量明顯增多、體積增大、形狀不規(guī)則，可見細胞向各個方向伸展細小偽足、大小不一、有細胞聚集現(xiàn)象、呈集落樣生長；培養(yǎng)5天后，細胞成簇生長，細胞核呈圓形或橢圓形較小，細胞周邊可見明顯的細胞毛刺狀突起，大部分細胞呈半懸浮狀態(tài)，細胞體積較以前增大；培養(yǎng)10 d后，多數(shù)細胞具有毛刺狀突起(見圖1)。

2.2小鼠骨髓來源DC直徑變化

Cellometer Mini細胞計數(shù)儀記錄DC生長直徑變化(見圖2)，培養(yǎng)第1天，DC細胞直徑較小，分布最多的直徑約為5.7 μm；培養(yǎng)第3天，DC直徑分布最多的增加到7.9 μm；第5天，增加到8.3 μm；培養(yǎng)到第7天，直徑增加到8.6 μm；到第10天時，細胞直徑增加到10.2 μm。由直徑變化可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸增大，此結(jié)果與顯微鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)果一致。

2.3小鼠骨髓來源DC生長曲線

通過10 d連續(xù)計數(shù)，其生長曲線顯示(見圖3)，DC呈倍數(shù)增長，DC在培養(yǎng)第2～9天為細胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達到頂峰，停止生長，進入平臺期。

2.4流式細胞儀檢測DC表面分子的表達

對照組DC表面高水平表達CD11c分子及CD80分子，分別占93.85.67%±2.90%及84.83%±0.31%，CD40、CD86及MHCⅡ低表達，分別為36.4%±0.82%、44.87%±2.44%及33.2%±0.75%；經(jīng)白念珠菌刺激后，DC表面CD11c、CD80、CD40、CD86及MHCⅡ均高表達，分別為92.4%±0.62%、98.27%±0.71%、92.17%±0.76%、90.73%±0.35%及95.7%±0.46%，見圖4。

2.5熒光顯微鏡檢測白念珠菌染色效果

熒光顯微鏡下觀察FITC染色白念珠菌，可見鏡下白念珠菌呈綠色，明顯可見真菌形態(tài)，孢子可見，染色效率可達98%以上(見圖5)，可以進行后續(xù)實驗。

2.6激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用

PKH26是一種對細胞膜脂質(zhì)非常敏感的紅色熒光染料，熒光顯微鏡下可見標記PKH26的DC，染料在細胞膜上分布均勻一致，細胞呈紅色熒光，標記效率達100%。通過激光共聚焦掃描成像可以準確地觀察到單個DC細胞吞噬白念珠菌的情況(見圖6)。由圖6可見，隨著DC∶白念珠菌比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細胞吞噬作用增強，圖6e顯示DC∶白念珠菌的比例為1∶4時，DC吞噬作用最強，每個DC細胞內(nèi)可見多個白念珠菌，最多可見9個。

2.7流式細胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬作用

用流式細胞儀檢測不同時間DC對白念珠菌吞噬率，結(jié)果見表1?？梢娫谙嗤墓才囵B(yǎng)時間，隨著DC∶白念比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細胞吞噬作用增強，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000；P=0.000)；當DC∶白念的比例為1∶4時，DC吞噬作用最強，分別為8.32±0.29、11.73±0.23、11.9±1.22(見表1)，此結(jié)果與激光共聚焦觀察結(jié)果一致。DC∶白念珠菌的比例為2∶1、1∶2及1∶4時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)；當DC∶白念珠菌的比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)。

2.8DC對白念珠菌殺傷作用

培養(yǎng)后24 h，在顯微鏡下可觀察到白念珠菌菌落，分枝呈樹枝狀，見圖7。分別于共培養(yǎng)后24 h及48 h，在顯微鏡下計數(shù)白念珠菌形成菌落(見表2)，可見隨著時間的延長，各實驗組的殺傷率下降(P=0.000)；當DC∶白念珠菌=1∶1時，與2∶1相比，DC殺傷作用明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷作用明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

3　討　　論

DC是目前已知的唯一可以活化Th細胞的專職抗原提呈細胞，也是連接固有免疫和獲得性免疫應答的樞紐[6-7]。白念珠菌是一種自然界最常見的分布于多種組織器官的機會性致病菌[8]，包括皮膚、口腔、胃腸道、陰道等。隨著白念珠菌對各種抗真菌藥物的耐藥性逐年增加，給臨床治療帶來一定的困難。機體通過識別白念珠菌細胞壁及其代謝產(chǎn)物進行不同的免疫應答，由于T細胞在免疫反應中處于核心地位，而DC作為目前已知的唯一可以活化初始輔助性T細胞的專職抗原提呈細胞，研究DC對白念珠菌的抗感染免疫顯得尤為重要。

DC起源于骨髓CD34+造血干細胞[9]，是1973年由Steinman和Cohn[10]首先由小鼠脾臟組織中分離發(fā)現(xiàn)。DC細胞表面具有典型的樹突狀突起，在體內(nèi)分布廣泛。DC是機體抵御病原菌及毒素等有害物質(zhì)的第一道防線，當機體受到抗原刺激后，DC可以有效地攝取抗原，并通過抗原肽/MHC分子復合物的形式，將抗原有效提呈給T0細胞，刺激生成Tc細胞，從而啟動機體相應的免疫反應。DC的鑒定一般要結(jié)合形態(tài)、分子表達及其功能3方面進行。本研究從C57小鼠骨髓中分離樹突狀細胞，并對其進行形態(tài)觀察和鑒定，經(jīng)過10 d的體外培養(yǎng)，可達到93%，細胞數(shù)量為3×107/只，基本上滿足后續(xù)實驗的要求。本研究通過倒置顯微鏡觀察，細胞由貼壁生長逐漸到半懸浮生長，細胞由圓形逐漸變?yōu)椴灰?guī)則，數(shù)量明顯增多，體積增大，表面出現(xiàn)大量不規(guī)則的樹突樣突起，有細胞聚集現(xiàn)象，呈集落樣典型樹突狀細胞形態(tài)。通過對DC連續(xù)10 d計數(shù)發(fā)現(xiàn)，DC呈倍數(shù)增長，DC在培養(yǎng)第2～9天為細胞對數(shù)生長期，第9天左右增殖曲線達到頂峰，停止生長，進入平臺期。DC表面有多種表面標志，包括CD11c、CD83、CD86、MHCⅡ、體內(nèi)大部分DC處于非成熟狀態(tài)，通常少量分布于與外界接觸的皮膚(黏膜)部位，主要為皮膚和鼻腔、肺、胃與腸的內(nèi)層，血液中也可發(fā)現(xiàn)他們的未成熟型，低水平表達的共刺激因子和黏附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細胞增殖反應的能力較低，但未成熟DC具有極強的抗原吞噬能力。作為人體的第一道防線，DC表達多種模式的識別受體，如甘露糖受體、Toll樣受體等，可單獨或協(xié)同識別多種病原微生物(細菌、真菌等)，通過胞飲作用、吞噬作用等攝取抗原進而殺傷之，從而行使固有免疫應答。宿主的天然免疫狀況決定了對白念珠菌致病的易感性，白念珠菌的酵母、菌絲能被DC介導的固有免疫系統(tǒng)識別，通過不同的機制啟動不同的免疫效應。因此檢測DC對真菌細胞的吞噬作用及殺傷作用，可以為今后抗感染領域尤其是抗真菌感染領域加強以DC為基礎的免疫、基因治療提供基礎。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著DC∶白念珠菌比例的減小(由2∶1到1∶4)，DC細胞吞噬作用增強，當比例為1∶4時，DC吞噬作用最強，此結(jié)果與激光共聚焦觀察結(jié)果一致。DC∶白念珠菌的比例為2∶1、1∶2及1∶4時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率也明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003；P=0.002；P=0.002)；然當進一步增加白念珠菌的比例，DC與白念珠菌比例為1∶1時，隨著共培養(yǎng)時間的延長(30 min到1.5 h)，吞噬率無明顯變化(P=0.063)。顯微鏡檢測DC對白念珠菌殺傷率，可見隨著時間的延長，各實驗組的殺傷率下降(P=0.000)；當DC∶白念珠菌=1∶1時，較2∶1時，殺傷率明顯下降，但隨著白念珠菌比例在一定范圍內(nèi)的增高(從1∶1到1∶4)，殺傷率明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。這提示當體內(nèi)白念珠菌量較大時，而體內(nèi)DC量固定，DC不能有效殺傷白念珠菌，這可能是造成白念珠菌菌局部感染甚至系統(tǒng)性白念珠菌感染的原因之一。

圖1倒置顯微鏡觀察小鼠骨髓DC形態(tài)學變化：A.第1天(原始放大倍數(shù)×20)；B.第3天(×20)；C.第5天(×20)；D.第7天(×20)；E.第10天(×20)；F.第1天(×40)；G.第3天(×40)；H.第5天(×40)；I.第7天(×40)；J.第10天(×40)圖2小鼠骨髓DC平均直徑變化圖圖3小鼠骨髓來源DC生長曲線圖4DC細胞表面分子表達

Fig.1The morphological of DC were observed by optical microscope：A.1 d(original magnification 20×)；B.3 d(original magnification 20×)；C.5 d(original magnification 20×)；D.7 d(original magnification 20×)；E.10 d(original magnification 20×)；F.1 d(original magnification 40×)；G.3 d(original magnification 40×)；H.5 d(original magnification 40×)；I.7 d(original magnification 40×)；J.10 d(original magnification 40×)Fig.2The average diameter changes of DCFig.3The growth curve of mouse bone marrow-derived dendritic cellsFig.4The positive expression rates of DC

圖5熒光顯微鏡下觀察白念珠菌染色(×10，A.白光；B.熒光)圖6激光共聚焦檢測DC對白念珠菌吞噬作用(×10)：A.陰性對照；B.DC∶白念珠菌=2∶1；C.DC∶白念珠菌=1∶1；D.DC∶白念珠菌=1∶2；E.DC∶白念珠菌=1∶4圖724 h顯微鏡下觀察白念珠菌形成的菌落(×4)

Fig.5The stainedCandida albicans detected by fluorescence microscope(original magnification 10×，A.white light，B.fluorescence)Fig.6 The phagocytosis of DC against Candida albicans detected by LSCM：A.Negative control;B.DC∶Candida albicans=2∶1;C.DC∶Candida albicans=1∶1;D.DC∶Candida albicans=1∶2;E.DC∶Candida albicans=1∶4Fig.7The colony of Candida albicans detected by microscope after 24 h(original magnification 4×)

表1流式細胞儀檢測DC對白念珠菌吞噬率(%)

Tab.1The phagocytosis of DC against Candida albicans detected by flow cytometry

共培養(yǎng)時間2∶11∶11∶21∶4FP30min2.29±0.244.09±0.635.85±1.038.32±0.2938.1430.0001h2.87±0.164.91±0.855.33±1.1511.73±0.2398.7500.0001.5h3.20±0.185.61±0.149.71±0.3411.90±1.22120.9660.000F17.3464.52220.46722.680P0.0030.0630.0020.002

表2顯微鏡下計數(shù)DC對白念珠菌菌落殺傷率(%)

Tab.2The killing rates of DC against Candida albicans detected by microscope

2∶11∶11∶21∶4χ2P24h78.98±5.8123.65±9.0659.69±14.6788.87±3.14107500.00048h70.17±10.597.76±4.1838.40±14.9183.06±20.321398000.000χ2541.3345149485609P0.0000.0000.0000.000

綜上所述，本實驗自C57小鼠骨髓細胞體外單純經(jīng)GM-CSF誘導可培養(yǎng)DC具有較高的純度及數(shù)量，且呈未成熟DC表型，可滿足后續(xù)實驗的DC用量。通過以上實驗證實，經(jīng)過白念珠菌刺激后DC表型成熟；DC對白念珠菌有較強的吞噬及殺傷作用，其吞噬作用隨著DC與白念珠菌比例的減小而增強。且隨著兩者作用時間的延長，DC對白念珠菌的吞噬作用逐漸增強而殺傷作用逐漸減弱。初步揭示了DC與白念珠菌量之間比例變化可能在白念珠菌的發(fā)病中起到關鍵性作用；DC對白念珠菌吞噬及殺傷作用的探討在白念珠感染性疾病治療中具有積極的意義。

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[本文編輯]王飛

The study of mouse bone marrow-derived dendritic cells phagocytosis and cytotoxicity against Candida albicans in vitro

WANG Qiong1,SHI Dong-mei2,LIU Wei-da1

(1.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Nanjing 210042,China;2.Department of Dermatology,Jining No.1 People’s Hospital,Jining 272011,China)

ObjectiveMouse bone marrow-derived dendritic cells were isolated and cultured in vitro and co-incubated with Candida albicans,in order to study the phenotype,phagocytosis and cytotoxicity of which against Candida albicans under different concentration and time.MethodsDendritic cells from C57 mouse bone marrow were isolated and cultured under aseptic conditions.The morphological and the growth curve and cell diameter of DC were observed by optical microscope and Cellometer Mini cell counter.The expression levels of CD11c,MHCII,CD40,CD80 and CD86 of DC were measured by flow cytometer.The phagocytosis and cytotoxicity of DC against Candida albicans were detected by microscope,Laser Scanning Confocal Microscope(LSCM) and flow cytometry.ResultsTypical morphology of DC cells was observed under inverted microscope 10 days after culture.10.2 μm was the most widely distributed diameter of DC as illustrated and the size of DC increased with the extension of incubation time.The growth curve showed that DC increased multiply.After inoculation,2-9 days were logarithmic phase and stagnate phase was from 9 days.The result of immunological phenotype detected by FCM showed that the CD11c and CD80 were highly expressed and MHCII,CD40,CD86 were lower expressed in control group.After stimulated by Candida albicans,the DC were appeared mature phenotype and CD11c,CD80,CD40,CD86 and MHCⅡ were all highly expressed.As the ratio(DC∶Candida albicans) reduced(from 2∶1 to 1∶4),the phagocytosis effects of DC enhanced and the strongest effect appeared when the ratio was 1∶4.When the ratio was 1∶1，the phagocytosis effects of DC was no significant change(P=0.063) with the extension of co-incubation time(30 min to 1.5 h).But when the ratio were 2∶1,1∶2 and 1∶4,the phagocytosis effects of DC were obviously rised with the extension of co-incubation time(30 min to 1.5 h),a statistically significant difference(P=0.003,P=0.002,P=0.002).When co-incubation time was prolonged,the cytotoxicity of DC was dramatic descend(P=0.000) detected by microscope.When the ratio(DC∶Candida albicans) was 1∶1,compared with the 2∶1 group,the cytotoxicity effects of DC was dramatic declined.But when the ratio of Candida albicans increased within limits(from 1∶1 to 1∶4),the cytotoxicity was significantly increased(P=0.000),with statistical significance.Conclusion Dendritic cells isolated from mouse bone marrow had high purity and immature cell phenotype.We could obtain 3×107cells per C57 mouse DC which could meet the requirements of experiments very well.After stimulated by Candida albicans,mature DCs were obvious increased.DC had strong phagocytosis and cytotoxicity against Candida albicans,and the effects of phagocytosis and cytotoxicity enhanced with the ratio(DC∶Candida albicans) reduced.When co-incubation time was prolonged,the phagocytosis of DC against Candida albicans was increased and the cytotoxicity was decreased.

bone marrow;dendritic cells;Candida albicans；phagocytosis;cytotoxicity

973計劃項目(2013CB531605)；國家自然科學基金(81401653)；山東省自然科學基金(ZR2015HL127)；濟寧市醫(yī)學科學計劃(2014jnnk13)

王瓊，女(漢族)，碩士，主管技師.E-mail:chongziqiong@163.com

史冬梅,E-mail:shidongmei28@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0193-08

2016-01-20