赤芍提取物中兩種主要成分在Caco-2細(xì)胞中的攝取特性研究

胡建春,侯　佳,李月婷,3,鞏仔鵬,3，蘭燕宇,3，王永林,3，王愛民

(貴州醫(yī)科大學(xué)1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3.藥學(xué)院，4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng)　550004)

?

赤芍提取物中兩種主要成分在Caco-2細(xì)胞中的攝取特性研究

胡建春1，3，4,侯佳1,李月婷1,3,鞏仔鵬1,3，蘭燕宇1,3，王永林1,3，王愛民2,3

(貴州醫(yī)科大學(xué)1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，3.藥學(xué)院，4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng)550004)

赤芍；攝取；Caco-2細(xì)胞模型；超高效液相-雙重四極桿質(zhì)譜；芍藥苷；苯甲酰芍藥苷

赤芍為毛莫科植物川赤芍PaeoninveitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散癖止痛等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，赤芍具有擴(kuò)張血管、解熱解痙、抗血栓形成等藥理作用。芍藥苷是芍藥總苷的主要成分[1]，具有赤芍上述的藥理功效，但研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷的胃腸吸收很差，生物利用度低[2]，限制了其臨床應(yīng)用。本研究利用 Caco-2 細(xì)胞模型[3-4]對(duì)赤芍主要成分芍藥苷、苯甲酰芍藥苷進(jìn)行體外吸收特性的初步研究，旨在為赤芍的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與試藥超高液相色譜色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備總廠)；illicell-ERS電位儀(美國(guó)Millipore公司)；功能酶標(biāo)儀(Thermo3001 VARIOSKAN FLASH)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)。

苯甲酰芍藥苷(批號(hào)：20120315)、芍藥苷(批號(hào)：S12-100819)、葛根素(批號(hào)：110752-200912)；赤芍提取物，自制(批號(hào)：20120615)；Hank’s緩沖溶液(HBSS, Gibco)；胰蛋白酶(trypsin，Sigma)；考馬斯亮藍(lán)(批號(hào)：20130523，南京建成生物工程研究所)。

1.2細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞株(上海中科院)，實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞傳代數(shù)在50代以內(nèi)。

2　方法

2.1色譜條件Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：45℃，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～2 min: 5%～25%，2～3 min：25%～95%，4 min:5%；流速為0.35 mL·min-1；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)；離子源溫度：120 ℃；毛細(xì)管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：350 ℃；碰撞氣為Ar(0.16 mL·min-1)；去溶劑氣為N2(650 L·h-1)；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)。苯甲酰芍藥苷：m/z 583.3、芍藥苷：m/z 525.2及葛根素：m/z 417.0。

2.3樣品處理參照文獻(xiàn)[2]，取250 μL細(xì)胞懸液加入400 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 μL進(jìn)樣分析；另取10 μL細(xì)胞懸液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。攝取量以 mg(藥物)·g-1(蛋白)表示。

2.4細(xì)胞的毒性研究(MTT法)參照文獻(xiàn)[5]，進(jìn)行Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)。正常對(duì)照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)液；考察組分別加入100 μL不同濃度的空白溶劑DMSO(2.5、5、10、20、30)、HBSS緩沖溶液(pH 4、6、7.4)、不同濃度的赤芍提取物(0.1、1、5、15、30 mg·L-1)及P-gp抑制劑維拉帕米(25、50、100、200、400 mg·L-1)和環(huán)孢菌素A(5、25、50、100、200 mg·L-1)，考察受試物的細(xì)胞毒性。

2.5赤芍提取物的細(xì)胞攝取特性研究參照文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞攝取影響因素考察實(shí)驗(yàn)，分別考察培養(yǎng)時(shí)間(15、30、60、90、120、180 min )、不同赤芍提取物濃度(0.2、1、2.5、5、7.5 g·L-1)、培養(yǎng)介質(zhì)不同pH(4.0、6.0、7.4)、P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米、頭孢菌素A)及不同溫度(4 ℃、25 ℃、37 ℃)對(duì)赤芍提取物中兩種有效成分在Caco-2細(xì)胞中攝取的影響。

3　結(jié)果

3.1Caco-2細(xì)胞毒性研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)各受試物對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)無不良影響。

3.2濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn)在0.6～7.5 g·L-1內(nèi)芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取量與濃度呈線性關(guān)系，回歸方程分別為為Y=0.1267X-0.1556，r2=0.9745；Y=0.0285X-0.0622，r2=0.8978；表明芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的攝取主要表現(xiàn)為被動(dòng)擴(kuò)散，見Tab 1。

Tab 1　Concentration-dependent effect of extracts on uptake in Caco-2 monolayer

3.3不同時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響在不同的攝取時(shí)間下，芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取量都隨著時(shí)間的增加而增加。

3.4pH值對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響在pH 4.0、6.0、7.4條件下，芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取量隨pH增加而降低。其中苯甲酰芍藥苷在pH 7.4條件下藥物的細(xì)胞攝取量明顯低于pH 6.0(P<0.05)，表明堿性環(huán)境相對(duì)不利芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的吸收，見Tab 2。

Tab 2　pH-dependent effect of extracts on intake in Caco-2 monolayer

*P<0.05vspH 6

3.5不同溫度對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取量都隨著溫度的增加而增加，且苯甲酰芍藥苷的攝取隨溫度(4 ℃與37 ℃)增加，差異有顯著性(P<0.05)，見Tab 3。

3.6抑制劑對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響采用SPSS 18.0軟件，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示抑制劑對(duì)芍藥苷及苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取無明顯影響。

Tab 3　Temperature-dependent effect of extracts on intake in Caco-2 monolayer

*P<0.05vs4 ℃

4　討論

本實(shí)驗(yàn)研究標(biāo)明，在0.2～7.5 g·L-1范圍內(nèi)，芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的細(xì)胞攝取表現(xiàn)出一級(jí)速率過程的特征，表明赤芍提取物的攝取機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。藥物攝取受時(shí)間、濃度、pH的影響。在中性、偏堿性條件下，藥物的攝取明顯降低，可能是由于中性、偏堿性條件下二者分子中的酯基水解，導(dǎo)致膜滲透性降低。環(huán)孢菌素A和維拉帕米對(duì)二者在Caco-2細(xì)胞中的攝取量沒有明顯增加作用，提示芍藥苷和苯甲酰芍藥苷可能不是P-gp底物。

[1]黃勇，王永林,蘭燕宇,等.注射用辛芍對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和對(duì)腦微循環(huán)血流量的影響[J].中國(guó)新藥雜志, 2008,17(2):119-123.

[1]Huang Y, Wang Y L, Lan Y Y, et al. Effect of Xinshao injection on cerebral ischemia-reperfusion injury and regional cerebral blood flow in rats[J].ChinJNewDrug,2008,17(2):119-23.

[2]楊祖貽，裴瑾，劉榮敏,等.溫里藥配伍提高赤芍效應(yīng)成分芍藥苷生物利用度的研究[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2005,25(9):822-4.

[2]Yang Z Y, Pei J, Liu R M, et al. Study on enhancing bioavailability of Paeoniflorin by combined use with Chinese herbs for inner-warming[J].ChinJIntegrTradWestMed, 2005,25(9):822-4.

[3]Allen R H, Rober t A C, Philip S B. Caco-2 cell mo nolayers as a model for drugt ransport across the intestinal mucosa[J].PharmRes, 1990, 7(9):902.

[4]李曉軍，王素軍，王廣基,等. HPLC-MS法測(cè)定關(guān)附甲素及其在Caco-2細(xì)胞上的攝取性[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013,29(2):286-9.

[4]Li X J, Wang S J, Wang G J. HPLC-MS determination of GFA and its uptake in Caco-2 Cells[J].ChinPharmacolBull,2013,29(2):286-9.

[5]藍(lán)燕宇，劉躍，曹旭,等. 杜仲中4種主要成分在Caco-2細(xì)胞的攝取特性研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014,30(9):1306-11.

[5]Lan Y Y, Liu Y, Cao X, et al. Uptake of Eucommia ulmoides extract in Caco-2 cell monolayer[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(9):1306-11.

[6]楊秀偉，張鵬，吳琦. 羌活中二氫呋喃類香豆素在人源腸Caco-2細(xì)胞單層模型的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究[J]. 中草藥，2009，40

(5):748.

[6]Yang X W, Zhang P, Wu Q. Absorption and transportation characteristic of dihydrofurocoumarins from Rhizome et Radix Notoperygii in a model of Caco-2 cell monolayer[J].ChinTraditHerbDrugs, 2009，40(5) :748.

[7]沙先誼，方曉玲，吳云娟. 9-硝基喜樹堿在Caco-2 細(xì)胞模型中的體外攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及外排動(dòng)力學(xué)[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(10) :839.

[7]Sha X Y, Fang X L, Wu Y J. Theinvitrokinetics of uptake, transport and efflux of 9-nitrocamptothecin in Caco-2 cell model[J].ActaPharmSin, 2004，39(10) :839.

Uptake characteristics of two components fromPaeoniaLactifloraPall.in Caco-2 cell monolayer model

HU Jian-chun1，3，4, HOU Jia1, LI Yue-ting1,3, GONG Zi-peng1,3, LAN-Yanyu1,3, WANG Yong-lin1,3, WANG Ai-ming2,3

(1.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China；3.CollegeofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,4.NationalEngineeringResearchCenterofMiaoMedicine,Guiyang550004,China)

PaeoninLactiflora; uptake characteristics;Caco-2 cell monolayer model; HPLC-MS/MS; paeoniflorin; benzoylpaeoniflorin

2016-02-15，

2016-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81260636); 貴州省科學(xué)技術(shù)基金(No 黔科合J字[2013]2035號(hào));貴州省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目(No 黔科合重G字[2013]4001) ;貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(No QZZY-2015-080)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)資金(No 黔科合人字[2015]11號(hào))

胡建春(1989-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)、新工藝研究與新藥研發(fā)， Tel: 0851-6908468, E-mail:jianchun89@163.com；

王永林(1954- )，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)，通訊作者,Tel：0851-6908899，E-mail：gywyl@gmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.029

A

1001-1978(2016)09-1329-03

R-282.71;R284.1;R322.45;R329.24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.058.html