補(bǔ)腎化瘀方對(duì)PCOS模型大鼠中TNF-α表達(dá)的影響

張瑞瑞，馮麗萍，雍志強(qiáng)，康開(kāi)彪，潘　文*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 甘肅 蘭州　73000；2.甘肅中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州　730050 )

?

補(bǔ)腎化瘀方對(duì)PCOS模型大鼠中TNF-α表達(dá)的影響

張瑞瑞1，馮麗萍1，雍志強(qiáng)1，康開(kāi)彪2，潘文2*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 甘肅 蘭州73000；2.甘肅中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州730050 )

多囊卵巢綜合征;腫瘤壞死因子α;補(bǔ)腎化瘀方;免疫印跡;肝臟;卵巢;脂肪

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種常見(jiàn)的疾病，估計(jì)影響5.6%生殖期中國(guó)女性[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療PCOS多采用生活方式干預(yù)和藥物治療，存在不良反應(yīng)及用藥后易復(fù)發(fā)的弊端[2]，隨著中醫(yī)對(duì) PCOS 研究的不斷深入，認(rèn)識(shí)到腎虛血瘀是PCOS的基本病機(jī)[3]。補(bǔ)腎化瘀方為甘肅省中醫(yī)院婦科經(jīng)驗(yàn)方。臨床觀察表明補(bǔ)腎化瘀方對(duì)多囊卵巢綜合征病例有顯著療效。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究促炎因子TNF-α變化來(lái)闡述補(bǔ)腎化瘀方對(duì)多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SD ♀大鼠120只(體質(zhì)量180 g±20 g)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，批號(hào)：SYXK(甘)2011-0001-62001000000039，SPF級(jí)。

1.2主要試劑補(bǔ)腎化瘀方由甘肅省中醫(yī)院藥劑室制成水煎劑，4℃保存?zhèn)溆?。二甲雙胍片(H20080697)；TNF-α抗體(ab6671)。依據(jù)人與大鼠之間用藥劑量換算，將補(bǔ)腎化瘀方配成等容量溶液，中藥含量分別為1.98 g·mL-1(高劑量)、0.989 g·mL-1(中劑量)、0.495 g·mL-1(低劑量)，二甲雙胍組4.498 g·L-1。

1.3PCOS大鼠模型制備和取材120只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，對(duì)照組，中藥低、中、高劑量組6組，各20只，按參考文獻(xiàn)[4]以來(lái)曲唑法連續(xù)灌胃24 d制作模型，并進(jìn)行模型鑒定。鑒定成功后按照等容量灌胃，正常組和模型組予生理鹽水1 mL·kg-1·d-1灌胃，對(duì)照組予4.498 mg·kg-1·d-1二甲雙胍灌胃，補(bǔ)腎化瘀方予高劑量1.98 g·kg-1·d-1、中劑量0.989 g·kg-1·d-1、低劑量0.495 g·kg-1·d-1灌胃，持續(xù)14 d。大鼠于80 d齡左右，行腹主動(dòng)脈取血后脫臼處死，取大鼠卵巢、肝臟、脂肪，置于液氮中2 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

2　方法

2.1Western blot檢測(cè)大鼠肝臟、卵巢、脂肪蛋白表達(dá)TNF-α蛋白在肝臟、卵巢、脂肪表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot方法，取各組肝臟、卵巢、脂肪組織各100 mg用組織裂解液裂解并勻漿，4℃離心0.5 h，上清液作標(biāo)本。電泳分離、封閉、結(jié)合一抗(1 ∶1 000)，洗滌、結(jié)合稀釋好的二抗(抗兔 Ig G)孵育，洗膜后用ECL顯像曝光，應(yīng)用光密度掃描儀測(cè)各條帶密度，同時(shí)以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。

3　結(jié)果

模型組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達(dá)明顯高于正常組(均P<0.01)。與模型組相比，對(duì)照組和中藥各劑量組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.01)。中藥各劑量組肝臟、卵巢、脂肪組織中TNF-α蛋白表達(dá)相比較，中藥中劑量組為最優(yōu)劑量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥中劑量組優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Tab 1。

Tab 1　Comparison of tissue TNF-α levels in liver, ovary and adipose in ±s,n=3)

pcos：**P<0.01vsnormal；△△P<0.01vsmodel；#P<0.05vscontrol；▲P<0.05vsBushen huayu lower dose；□P<0.05vsBushen huayu middle dose

4　討論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了許多相關(guān)機(jī)制學(xué)說(shuō)，其中炎癥學(xué)說(shuō)是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)。TNF-α影響卵泡發(fā)育和類固醇生成[5]，近年來(lái)有學(xué)者[6]提出PCOS是一種慢性炎癥性疾病，Mattyasovszky等[7]研究發(fā)現(xiàn)PCOS經(jīng)常遭受慢性炎癥的特別是促炎細(xì)胞因子TNF-α影響，且TNF-α影響卵泡生長(zhǎng)、排卵和黃體衰退。通過(guò)Thathapudi等[8]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者與健康組相比，血清中TNF-α、雄激素明顯升高，表明TNF-α可能是導(dǎo)致PCOS的發(fā)病原因，目前臨床治療 PCOS 多采用生活方式干預(yù)輔以西藥藥物治療[9]，存在諸多不良反應(yīng)和用藥后易復(fù)發(fā)的弊端。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：TNF-α和PCOS形成關(guān)系密切，同時(shí)補(bǔ)腎化瘀方能降低組織中炎癥因子TNF-α，減緩PCOS的形成。補(bǔ)腎化瘀方組療效與二甲雙胍對(duì)照組療效進(jìn)行對(duì)比，補(bǔ)腎化瘀方有效降低TNF-α表達(dá)水平。補(bǔ)腎化瘀方通過(guò)抑制TNF-α治療PCOS，這可能是其有效防治PCOS的機(jī)制之一。但是，由于小樣本分析，此結(jié)果仍需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證?？傮w而言，促炎癥因子TNF-α升高能夠形成PCOS，而補(bǔ)腎化瘀方通過(guò)益腎精，化瘀滯，降低TNF-α水平，進(jìn)而證明其能起到預(yù)防和治療多囊卵巢綜合征的作用，為預(yù)防和治療多囊卵巢綜合征提供一種新選擇。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室完成，在此深表感謝！)

[1]Li R,Zhang Q,Yang D, Li S,et al.Prevalence of polycystic ovary syndromein women in China:a large community-based study[J].HumReprod,2013,7(9):1-8.

[2]陶金紅,董莉.補(bǔ)腎活血方對(duì)腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(7):58-61.

[2]Tao J H, Dong L. Effect of bushen huoxue decoction on polycystic ovarian syndrome-inhibin activin-follistatin system[J].ShanghaiJTradChinMed,2014,48(7):58-61.

[3]閆朋宣,胡淼波,杜寶俊.杜寶俊教授治療多囊卵巢綜合征經(jīng)驗(yàn)[J].新中醫(yī),2013,45(6):193-4.

[3]Yan P X, Hu M B, Du B J. Professor Du Baojun’s experience in the treatment of polycystic ovary syndrome[J].NewTradChinMed, 2013,45(6):193-4.

[4]曾蕾,羅頌平.多囊卵巢綜合征高雄激素模型與孕激素聯(lián)合HCG模型的比較[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2008,34(5)115-7.

[4]Zeng L, Luo S P. Polycystic ovary syndrome Kaohsiung hormone model combined with progesterone comparison of HCG model[J].ChinaHerMed, 2008,34(5): 115-7.

[5]Choi Y S,Yang H I,Cho S,et al.Serum asymmetric dimethylarginine, apelin,and tumor necrosis factor-alpha levels in non-obese women with polycystic ovary syndrome[J].Steroids,2012, 77(13):1352-8.

[6]Bornstein S R,Allolio B,Arlt W,et al.Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome:An endocrine society clinical practice guideline[J].JClinEndocrinolMetab,2016,101(2):364-89.

[7]Mattyasovszky S G,Hofmann A, Brochhausen C,et al.The effect of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor-alpha on human joint capsule myofibroblasts[J].ArthritisResTher, 2010,12(1):R4.

[8]Thathapudi S,Kodati V,Erukkambattu J,et al.Tumor necrosis factor-alpha and polycystic ovarian syndrome:A clinical, biochemical,and molecular genetic study[J].GenetTestMolBiomarkers,2014,18(9):605-9.

[9]陳梅，劉潤(rùn)俠. 二甲雙胍對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠血清抑制素B、激活素A、卵泡抑素水平的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(10)：1370-3.

[9]Chen M, Liu R X. Metformin for polycystic ovary syndrome model in rat effect of serum inhibin B, activin A, follistatin levels[J].ChinPharmacolBull, 2009,25(10):1370-3.

Effects of Bushen huayu recipe on TNF-α expression in PCOS rat model

ZHANG Rui-rui1,FENG Li-ping1,YONG Zhi-qiang1,KANG Kai-biao2,PAN Wen2

(1.GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2.GansuProvincialInstituteofTCM,Lanzhou730050,China)

PCOS;TNF-α;Bushen huayu recipe;Western blot;liver;ovary;adipose

2016-04-07，

2016-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81360604)；甘肅省教育廳碩士生導(dǎo)師項(xiàng)目(No 1206-07)；甘肅省技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(No 1305TCYA029)；甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計(jì)劃管理項(xiàng)目(No GWGL2013-3)

張瑞瑞(1989-)，女，碩士生，研究方向：婦科血瘀證的實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：zhangruirui_vip@163.com；

潘文(1963-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：不孕癥的中西醫(yī)結(jié)合治療，通訊作者，E-mail：panwen25@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.030

A

1001-1978(2016)09-1331-02

R-332； R256.5；R289.5 ；R711.75；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.060.html