DSF-Cu通過影響線粒體功能和細(xì)胞骨架誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡

楊亞萍，汪亞帷，李夢佳，張可凡，孫曉雪，梁志紅，陳麗新，王立偉，楊海峰，朱林燕

(暨南大學(xué) 1.分析測試中心, 2.醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,3.醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州　510632；4.廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州　510120)

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◇論著◇

DSF-Cu通過影響線粒體功能和細(xì)胞骨架誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡

楊亞萍1，汪亞帷2，李夢佳2，張可凡2，孫曉雪2，梁志紅1，陳麗新2，王立偉3，楊海峰4，朱林燕2

(暨南大學(xué) 1.分析測試中心, 2.醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系,3.醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東廣州510632；4.廣東省中醫(yī)院病理科，廣東 廣州510120)

目的探測雙硫侖(disulfiram，DSF) 螯合氯化銅(DSF-Cu)通過影響線粒體功能和細(xì)胞骨架誘導(dǎo)人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、凋亡率、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成以及線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改變。AFM探測細(xì)胞表面形貌和超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞高度、寬度及粗糙度的變化。激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)觀察細(xì)胞骨架F-actin的分布和重組。結(jié)果細(xì)胞周期檢測顯示DSF-Cu將CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。Annexin-V/PI檢測細(xì)胞凋亡顯示隨藥物濃度增加，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組早凋率和晚凋率、壞死率細(xì)胞均明顯增加。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)信號發(fā)現(xiàn)DSF-Cu可促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的增加及誘導(dǎo)MMP下降。AFM成像表明，與對照組相比，隨著藥物濃度增大，細(xì)胞逐漸變小，胞質(zhì)濃縮，高度增加，膜表面粗糙度降低，變得平整光滑；細(xì)胞偽足由對照組的豐富密集，逐漸變短、萎縮，甚至完全破壞。LSCM進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)DSF-Cu引起F-actin熒光強(qiáng)度減弱，結(jié)構(gòu)重排，嚴(yán)重影響微絲的功能。結(jié)論DSF-Cu可誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞依賴線粒體的凋亡途徑，利用AFM 在單細(xì)胞水平上分析DSF-Cu對細(xì)胞膜的毒性作用，為鼻咽癌的治療提供新的思路。

雙硫侖；原子力顯微鏡；細(xì)胞骨架；活性氧；凋亡；鼻咽癌；線粒體膜電位

鼻咽癌是一種鼻咽部的鱗狀上皮細(xì)胞癌，臨床上具有發(fā)病部位較深、病變難以被早期發(fā)現(xiàn)，以至就診時許多病人已是中晚期，且癌變后易發(fā)生侵潤轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[1]。目前臨床治療以放療聯(lián)合輔助化療為主，盡管聯(lián)合放化療可以提高鼻咽癌的局控率和生存率，但是兩種手段對正常細(xì)胞均有明顯的毒性作用，化療后患者常出現(xiàn)骨髓抑制、胃腸功能紊亂等不良反應(yīng)，或者由于照射劑量過大，導(dǎo)致鄰近高危區(qū)域損傷，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[2]。

雙硫侖(disulfiram，DSF)是一種在臨床使用了60年的抗酗酒藥物，是能夠抑制醇脫氫酶的二硫代氨基甲酸鹽藥物，具有安全性好、低毒且價格低廉的特性[3]。近年來研究顯示，DSF對乳腺癌、白血病、黑色素瘤及結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，并能增強(qiáng)順鉑等化療藥物對癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[4-5]。進(jìn)一步研究還表明，DSF螯合Cu2+可以明顯增強(qiáng)DSF對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時赦免正常細(xì)胞[6]，但關(guān)于其對鼻咽癌作用的相關(guān)報道較少，且其具體的抗腫瘤分子機(jī)制也尚未闡明。

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)成像是一種新型的具有納米級分辨率的表面成像技術(shù)，具有分辨率高、樣品制備簡單、可在近生理環(huán)境下直接觀測生物樣品等優(yōu)點(diǎn)，近來被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)通過AFM 觀察DSF-Cu誘導(dǎo)CNE-2Z 細(xì)胞形貌及超微結(jié)構(gòu)的變化，旨在探討DSF-Cu對人低分化鼻咽癌細(xì)胞的抗腫瘤作用的分子機(jī)制，及提供微觀形態(tài)學(xué)參考，為臨床治療鼻咽癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與試劑

1.1主要試劑雙硫侖購自Sigma-Aldrich，經(jīng)DMSO 溶解并稀釋成2 mmol·L-1儲存液，分裝，-20 ℃保存，臨用前用無菌PBS稀釋成所需工作液濃度。氯化銅(copper chloride)購自Sigma-Aldrich；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司。Annexin V-FITC/PI apoptosis detection Kit(BMS500FI)購自eBioscience；Rhodamine Phalloidin(PHDG1-A)購自Cytoskeleton；PI/RNase Staining Buffer(550825) and Mitochondrial membrane potential JC-1 Detection Kit(551302)購自BD；2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、離心管、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶均為Corning產(chǎn)品。Falcon細(xì)胞過濾網(wǎng)為BD產(chǎn)品；無菌35 mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿為杭州生友生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(Coulter Gallios)為美國Beckman Coulter Gallios產(chǎn)品；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM 510 Duo Scan)為Carl Zeiss產(chǎn)品；原子力顯微鏡 ( BioScope Catalyst NanoScope-V ) 為Bruker 產(chǎn)品；倒置顯微鏡 (IX 51) 為Olympus產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，放在5% CO2、37 ℃的恒溫孵箱中進(jìn)行孵育。細(xì)胞貼壁生長，每隔2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞長至70%～80%時，加0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞計數(shù)并用于實(shí)驗(yàn)。

1.3檢測DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響CNE-2Z 細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入含0、25、50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu的培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞與培養(yǎng)基于EP管內(nèi)，1 000 r·min-1離心5 min，去除上層液體，PBS緩沖液重懸洗滌2次，加入1 mL 70%冷乙醇，于4 ℃固定過夜。1 000 r·min-1離心5 min，PBS緩沖液重懸洗滌2 次。每管樣品各加入200 μL PI/RNase 染液充分混合并重懸細(xì)胞，37 ℃室溫避光孵育15 min。 用Falcon細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長615 nm檢測PI熒光信號。獲取至少10 000個細(xì)胞，用MidFit軟件分析細(xì)胞周期的分布。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率收集各組細(xì)胞，1 200 r·min-1，離心5 min，PBS緩沖液重懸洗滌1次。將細(xì)胞重懸于200 μL binding buffer，再各加入5 μL Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃室溫避光孵育15 min后再用200 μL binding buffer重懸洗滌1次。最后加入200 μL binding buffer重懸，上流式細(xì)胞儀檢測，用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm和630 nm分別檢測Annexin V-FITC和PI熒光信號。獲取至少10 000個細(xì)胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA)軟件分析。

1.5檢測DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞活性氧生成的影響利用熒光染料DCFH-DA的熒光強(qiáng)度變化，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。 而DCFH不會透過細(xì)胞膜，因此探針很容易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，故DCF熒光強(qiáng)度與活性氧的水平成正比。收集各組細(xì)胞，1 200 r·min-1離心5 min，PBS緩沖液重懸洗滌1次后將細(xì)胞重懸于200 μL DCFH-DA染液，37 ℃室溫避光孵育15 min后，再加入200 μL PBS緩沖液重懸洗滌1次。最后加入200 μL PBS緩沖液，混勻，上流式細(xì)胞儀檢測，用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測DCF熒光信號。獲取至少10 000個細(xì)胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA) 軟件分析。

1.6檢測DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞線粒體膜電位電勢的影響利用熒光探針JC-1檢測CNE-2Z 細(xì)胞線粒體膜電位電勢的改變，JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的理想熒光探針，JC-1探針以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。因此可以根據(jù)顏色的變化直接反映出線粒體膜電位的變化。加入不同濃度的DSF-Cu培養(yǎng)24 h后，胰酶消化及PBS重懸細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清；加入200 μL JC-1染液，混勻，37℃避光孵育15 min；然后加入500 μL洗液重懸細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清；加入200 μL洗液，混勻，上流式細(xì)胞儀檢測，用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm和590 nm分別檢測JC-1 Green和JC-1 Red熒光信號。 獲取至少10 000個細(xì)胞，用Kaluza Analysis 1.3(Beckman Coulter，USA)軟件分析。

1.7原子力顯微鏡成像觀察將多聚賴氨酸浸泡消毒過的蓋玻片置于6孔板中，按1×108·L-1接種CNE-2Z細(xì)胞，加入不同濃度的DCF-Cu孵育24 h后，用1%戊二醛固定細(xì)胞10 min，用超純水洗滌細(xì)胞3次，自然晾干。實(shí)驗(yàn)采用150Al-G硅探針，微懸臂的彈性系數(shù)為2.8 N·m-1。將制備好的樣品置于原子力顯微鏡的XY掃描臺上，定位待掃描樣品區(qū)域，采ScanAsyst mode成像，掃描區(qū)域50×50 μm2，掃描頻率0.8 Hz，用AFM圖像自帶軟件Nanoscope analysis software 8.14對掃描方向上出現(xiàn)的低頻背景噪音做平滑處理。

1.8激光掃描共聚焦顯微鏡檢測CNE-2Z細(xì)胞F-actin結(jié)構(gòu)調(diào)整CNE-2Z細(xì)胞懸液濃度至1×109·L-1，接種于無菌35 mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h，每孔分別加入含0、25、50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu的培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min后，用含0.5% Triton X-100的PBS緩沖液通透細(xì)胞5 min；用含有10%綿羊血清封閉30 min，然后每皿加入100 nmol·L-1Rhodamine-phalloidin 50 μL，室溫避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后，加入Hoechst 33258染細(xì)胞核；最后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，滴加抗淬滅劑后直接用LSM 510 Duo Scan laser scanning confocal microscope(Carl Zeiss)進(jìn)行觀察、拍照。用Aim Image Examiner Software分析處理圖片。

2　結(jié)果

2.1DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響不同濃度25、50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后，隨藥物濃度增加，CNE-2Z細(xì)胞處于G2/M期的比例，與對照組(9.91±0.68)%相比，實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞依次增加至：(13.89±1.91)%、(20.36±1.28)%、(24.21±1.19)%、(31.02±2.02)%和(35.40±1.70)%，而G0/G1期細(xì)胞比例則從對照組(50.94±0.71)%，逐漸降低至(46.89±1.71)%、(42.79±1.64)%、(39.82±1.49)%、(32.45±4.07)% 和(27.66±4.06)%，S期細(xì)胞比例無明顯變化。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，表明DSF-Cu將CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。見Fig 1。

2.2DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞凋亡的影響為了進(jìn)一步說明DSF-Cu對CNE-2Z 細(xì)胞的毒性作用，接下來利用Annexin-V/FITC雙染法檢測DSF-Cu誘導(dǎo)CNE-2Z 細(xì)胞凋亡。與對照組(0.33±0.12)%相比，隨用藥濃度的增加，CNE-2Z細(xì)胞早凋率依次增加至(0.58±0.12)%、(2.99±0.46)%、(5.43±1.26)%、(5.87±3.72)% 和(31.02±13.41)%；而晚凋和壞死率，對照組為(1.23±1.44)%，實(shí)驗(yàn)組依次增加至(1.13±0.85)%、(7.31±3.43)%、(16.39±5.49)%、(33.13±7.38)%和(51.92±8.27)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，表明DSF-Cu可顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡。見Fig 2。

Fig 1　Cycle arrest of CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.3DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞ROS生成的影響利用DCFH-DA熒光探針檢測不同濃度25、50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化。隨藥物濃度的增加，與對照組DCF的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)13.01±5.27相比，實(shí)驗(yàn)組依次為12.06±4.19、17.30±6.14、29.85±10.25、38.49±13.44和49.80±15.83。實(shí)驗(yàn)組熒光峰值整體右移，細(xì)胞內(nèi)ROS染料的熒光明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。表明DSF-Cu可促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平的增加，在DSF-Cu 誘導(dǎo)凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見 Fig 3。

Fig 2　Apoptosis of CNE-2Z cells stained with Annexin V-FITC/PI after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.4DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞線粒體膜電位電勢的影響以熒光探針JC-1檢測MMP，并以綠色熒光的比例代表膜電位下降的比例。不同濃度25、50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后，與對照組(0.71±0.38)%相比，實(shí)驗(yàn)組MMP下降的比例依次增加至(1.61±0.73)%、(7.96±2.55)%、(30.87±7.06)%、(65.46±12.44)%和(94.61±1.56)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。表明DSF-Cu可促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞線粒體膜電位的明顯下降，參與DSF-Cu 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。見Fig 4。

2.5DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞表面形貌的影響用AFM 對對照組和作用不同濃度DSF-Cu實(shí)驗(yàn)組CNE-2Z細(xì)胞進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)有明顯變化。對照組細(xì)胞呈長梭形，胞體飽滿，細(xì)胞表面布滿顆粒狀隆起，粗糙不平。從胞體伸出很多細(xì)絲狀偽足，細(xì)胞與細(xì)胞之間通過絲狀偽足緊密連接。經(jīng)過低濃度50 nmol·L-1DSF-Cu處理后，細(xì)胞發(fā)生皺縮、變圓，胞體邊緣的絲狀偽足部分回縮。隨用藥濃度增加至100 nmol·L-1，細(xì)胞形貌破壞加劇，尤其絲狀偽足結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，細(xì)胞膜表面變得光滑、圓潤。這些變化均隨DSF-Cu濃度的增大而愈加明顯，當(dāng)藥物濃度達(dá)到150和200 nmol·L-1DSF-Cu時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全被破壞，不僅皺縮更明顯，而且開始出現(xiàn)胞質(zhì)外漏、邊緣模糊，膜表面變得異常平整，光滑，偽足結(jié)構(gòu)完全消失。見 Fig 5。

Fig 3　Levels of ROS in CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry

**P<0.01vscontrol group

AFM不僅可以得到高分辨的細(xì)胞表面形貌圖，還可以實(shí)現(xiàn)對單細(xì)胞的定量分析。用AFM 自帶軟件分別對每組細(xì)胞高度測量發(fā)現(xiàn)：與對照組(1.85±0.23) μm相比，50、100、150、200 nmol·L-1DSF-Cu實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞高度依次增加至(2.31±0.38)、(3.18±0.26)、(3.64±0.31)和(4.08±0.42) μm(P<0.01)。細(xì)胞寬度測量發(fā)現(xiàn)：與對照組(37.29±3.4) μm相比，50、100、150、200 nmol·L-1DSF-Cu實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞寬度依次減小至(27.17±1.12)、(23.74±0.63)、(18.86±1.17)和(14.64±1.25) μm(P<0.01)。對每組細(xì)胞(2×2) μm2區(qū)域細(xì)胞膜表面粗糙度進(jìn)行分析測量發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞表面均方根粗糙度(root-mean-squared roughness，Rq)與對照組(88.18±22.57) nm相比，50、100和150 nmol·L-1DSF-Cu實(shí)驗(yàn)組Rq依次降低至(73.17±12.76)、(64.06±9.96)和(53.70±15.07) nm(P<0.01)。平均粗糙度(average roughness，Ra)與對照組(71.11±19.57) nm相比，50、100和150 nmol·L-1DSF-Cu實(shí)驗(yàn)組Rq依次降低至(59.19±11.02)、(51.17±8.79)和(42.12±13.49) nm(P<0.01)。值得注意的是，最高濃度200 nmol·L-1實(shí)驗(yàn)組的Rq和Ra分別為(97.19±35.12)和(74.74±26.46) nm，反而高于其他各組。分析以上數(shù)據(jù)說明，隨著藥物濃度增大，細(xì)胞形貌破壞加劇。見Fig 6。2.6DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞F-actin的影響利用Rhodamine-Phalloidin染色觀察50、100、150和200 nmol·L-1DSF-Cu作用于CNE-2Z細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的表達(dá)和分布的影響。對照組CNE-2Z細(xì)胞胞質(zhì)密集分布豐富的F-actin，且在胞體四周布滿很多細(xì)絲狀F-actin。 經(jīng)過不同濃度的DSF-Cu處理后，F(xiàn)-actin發(fā)生重組，結(jié)構(gòu)遭到明顯的破壞，表現(xiàn)為F-actin 熒光強(qiáng)度逐漸減弱，絲狀結(jié)構(gòu)回縮直至完全消失，微絲分布紊亂，在最高濃度組形成“戒指”樣形狀，分布在細(xì)胞膜。見Fig 7。

3　討論

鼻咽癌在中國南方，尤其是廣東省，其發(fā)病率較歐美等其他地區(qū)高25～30倍[9]。鼻咽癌臨床上屬上皮源性惡性腫瘤，惡性程度較高，有著高度的侵襲性及轉(zhuǎn)移性，患者5年生存率僅60%左右[10]。臨床治療以放療聯(lián)合順鉑化療為主，但在治療過程中大劑量多藥聯(lián)合化療的毒副反應(yīng)導(dǎo)致患者不耐受等嚴(yán)重并發(fā)癥，影響其療效，且在一定程度上誘發(fā)了鼻咽癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。當(dāng)前新型的分子靶向治療藥物存在開發(fā)成本高、價格昂貴等問題，而從價廉且毒副作用小的傳統(tǒng)藥物中開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)。

DSF是一種能夠抑制醇脫氫酶的二硫代氨基甲酸鹽藥物，臨床上廣泛用于抗酗酒，價格低廉，安全性好，近年來其抗腫瘤活性越來越受到關(guān)注[4]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，DSF-Cu復(fù)合物可選擇性地殺傷多種惡性腫瘤，且同時赦免正常細(xì)胞。目前關(guān)于DSF-Cu的抗腫瘤的具體作用機(jī)制尚不完全明確，且其對鼻咽癌作用的相關(guān)報道也很少。本研究結(jié)果表明，DSF-Cu可誘導(dǎo)人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞阻滯，表明DSF-Cu可通過阻滯細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)變，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)信號發(fā)現(xiàn)DSF-Cu可促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加及誘導(dǎo)MMP的下降，提示DSF-Cu可能是通過影響ROS的水平，導(dǎo)致線粒體功能改變，氧化還原水平失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。ROS作為重要的凋亡誘導(dǎo)因子，在線粒體途徑的凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)多種分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，均可產(chǎn)生一定量的ROS，如超氧化物陰離子自由基、過氧化氫、氫過氧基和氫氧根等。一方面ROS 參與正常的各種代謝活動，另一方面既使ROS產(chǎn)生的多一些，也會被細(xì)胞內(nèi)各種活性氧清除劑，例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等所清除，維持一定的動態(tài)平衡。而當(dāng)各種因素導(dǎo)致的ROS過量生成時，在ROS 釋放與蓄積過程中，ROS 會促使線粒體內(nèi)膜上形成大量非特異性的通透轉(zhuǎn)換孔, 使膜間隙的正離子不斷進(jìn)入基質(zhì), 導(dǎo)致內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失,使線粒體膜電位逐漸下降直至消失，從而使線粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色素C等促凋亡因子釋放入細(xì)胞質(zhì)中，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DAN的氧化損傷，從而引發(fā)細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[11]。因此ROS的產(chǎn)生堆積和MMP的降低都是細(xì)胞凋亡中的重要事件，且兩者相互促進(jìn)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 已有文獻(xiàn)報道，DSF-Cu的抗腫瘤作用與NF-κB通路、JNK通路及ROS有關(guān)[12]，DSF可直接與線粒體膜上游離的巰基結(jié)合形成二硫化物，影響線粒體膜電位及誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，從而活化一系列氧化還原相關(guān)的信號通路，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Fig 4Mitochondria-dependent apoptosis of CNE-2Z cells stained with JC-1 after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by flow cytometry

**P<0.01vscontrol group

Fig 5　Morphological changes of CNE-2Z cells after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by atomic force microscope

A1～E1：Peak force error images;A2～E2：Height images;A3～E3：Three-dimensional morphology images;A4～E4：Profile line analysis of height and width of cells corresponding to the white lines in A2～E2

AFM是一種新型的具有納米級分辨率的表面成像工具，在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用正日益廣泛。 能夠在接近生理?xiàng)l件下對細(xì)胞進(jìn)行表面超微結(jié)構(gòu)和生物機(jī)械性能的測量，比如細(xì)胞的硬度、黏附力以及抗原-抗體親和力等分析[13]。尤其在研究藥物對腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制方面， AFM 顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢，成為細(xì)胞生物學(xué)研究的一種有效工具。細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，對調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和生理過程，如物質(zhì)運(yùn)輸、激素和藥物的作用、 信號傳導(dǎo)、 細(xì)胞表面識別、 細(xì)胞存活等起著關(guān)鍵作用[14-15]，因此細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化直接影響著細(xì)胞的正常功能。本研究從納米級水平上定性定量地分析了DSF-Cu作用CNE-2Z 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、 變圓，絲狀偽足回縮以至結(jié)構(gòu)遭到完全破壞；且胞質(zhì)外漏、 邊緣模糊、 膜表面的顆粒減少，變得異常光滑、平整，細(xì)胞膜表面粗糙度明顯下降。以上結(jié)果與流式檢測到的DSF-Cu具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相吻合。細(xì)胞偽足與癌細(xì)胞的運(yùn)動、遷移和侵襲能力密切相關(guān)，AFM觀察到CNE-2Z細(xì)胞絲狀偽足的變化，說明DSF-Cu可能通過抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力而發(fā)揮其抗腫瘤活性。最后利用激光共聚焦顯微鏡觀察到經(jīng)DSF-Cu作用后的CNE-2Z細(xì)胞，胞內(nèi)的骨架蛋白之一的F-actin發(fā)生重排，結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，再次證實(shí)DSF-Cu可抑制CNE-2Z細(xì)胞的遷移和侵襲能力，具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。至于細(xì)胞骨架的這些變化僅僅是DSF-Cu對CNE-2Z細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性過程中的一種現(xiàn)象，還是F-actin的重組在DSF-Cu抗腫瘤效應(yīng)中參與了信號傳導(dǎo)及蛋白調(diào)節(jié)作用尚需進(jìn)一步研究。

Fig 6　Histograms of statistical results of morphological changes of CNE-2Z cells

A:Height;B:Width;C:Root-mean-squared roughness(Rq);D:Average roughness(Ra).**P<0.01vscontrol group

綜上所述，本研究證實(shí)DSF-Cu可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與線粒體凋亡通路有關(guān)。同時，原子力顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡相結(jié)合，在納米級的水平上為揭示細(xì)胞的生理病理狀態(tài)提供了微觀形態(tài)學(xué)參考，同時為實(shí)現(xiàn)通過單細(xì)胞研究抗腫瘤藥物的抗癌機(jī)制提供有用的數(shù)據(jù)支持。

Fig 7Expression and distribution of F-actin stained with Rhodamine-phalloidin(red) and the nuclei stained with Hoechst 33258(blue) after treated with different concentration of DSF-Cu for 24 h determined by laser scanning confocal microscope

(致謝:本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞檢測、激光掃描共聚焦顯微鏡的拍攝、原子力顯微鏡的測試部分主要在暨南大學(xué)分析測試中心完成，細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理部分在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝楊亞萍、汪亞帷、李夢佳、張可凡和孫曉雪在細(xì)胞培養(yǎng)、檢測各個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、論文寫作和數(shù)據(jù)處理所做的工作；感謝梁志紅在原子力顯微鏡使用過程中的指導(dǎo)工作；感謝陳麗新、王立偉、楊海峰和朱林燕在實(shí)驗(yàn)設(shè)計、論文修改所做的工作。)

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DSF-Cu induces apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells by affecting function of mitochondria and cytoskeleton

YANG Ya-ping1，WANG Ya-wei2，LI Meng-jia2，ZHANG Ke-fan2，SUN Xiao-xue2，LIANG Zhi-hong1，CHEN Li-xin2，WANG Li-wei3，YANG Hai-feng4，ZHU Lin-yan2

(1.AnalysisandTestCenter；2.DeptofPharmacology，MedicalCollege；3.DeptofPhysiology，MedicalCollege，JinanUniversity，Guangzhou510632，China；4.DeptofPathology，GuangdongHospitalofChineseMedicine，Guangzhou510120，China)

AimTo study the mechanism of DSF-Cu induced apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells by affecting the function of mitochondria and cytoskeleton.MethodsThe cell cycle，the rate of apotosis，the levels of intracellular ROS and MMP in CNE-2Z cells were tested by flow cytometry after treated with different concentration of DSF-Cu. The changes of the cell surface morphology，ultrastructure，cell height，width and roughness were detected by AFM. The distribution and reorganization of cytoskeleton F-actin were observed by Laser scanning confocal microscope.ResultsCells were incubated with different concentration of DSF-Cu(0～200 nmol·L-1) for 24 h，the apoptotic ratio increased significantly and the treatment of DSF-Cu resulted in a concentration-dependent accumulation of CNE-2Z cells in G2/M phase. Furthermore，the treatment of DSF-Cu was able to increase the production of intracellular ROS and decrease the MMP in CNE-2Z cells. In addition，AFM imaging showed that compared to the control group，with the increase of DSF-Cu concentration，the CNE-2Z cells became smaller，cytoplasm condensed，the height increased，and the surface roughness reduced. Moreover，the filopodia became shorter，shrinked and even completely destroyed after treated with different concentration of DSF-Cu. At last，the LSCM image showed that the fluorescence intensity of F-actin networks was decreased，then the structure was rearranged and destroyed obviously by treated with DSF-Cu.ConclusionDSF-Cu can induce apoptosis and arrest cell cycle at G2/M phase in CNE-2Z cell through a mitochondria-dependent pathway. Above findings highlight the applications of AFM at the single cell level for the investigation of antineoplastic drug in nasopharyngeal carcinoma therapy.

disulfiram； atomic force microscope；cytoskeleton；ROS；cell apoptosis；nasopharyngeal carcinoma；mitochondrial membrane potential

2016-05-19，

2016-06-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31070997，81372382)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No S2013010013780，2015A 030313363)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(No A201506)

楊亞萍(1982-)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：腫瘤藥理，E-mail：652012387@qq.com；

汪亞帷(1990-)，男，碩士生，研究方向：氯通道與腫瘤，并列第一作者，E-mail：530916550@qq.com；

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.006

A

1001-1978(2016)09-1208-10

R329.24；R329.25；R329.28；R739.63；R979.9

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.012.html

楊海峰(1973-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理，通訊作者，E-mail：yang_hf@126.com；

朱林燕(1973-)，女，教授，研究方向：氯通道與腫瘤，通訊作者，E-mail：tzhuly@jnu.edu.cn