人參皂苷Rc、Re、Rf 和Rg1對(duì)藥物代謝酶CYP1A1活性誘導(dǎo)作用研究

李　晗，王宇光，馬增春，譚洪玲，肖成榮，湯響林，張伯禮，高　月

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　330007；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京　100850)

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人參皂苷Rc、Re、Rf 和Rg1對(duì)藥物代謝酶CYP1A1活性誘導(dǎo)作用研究

李晗1,2，王宇光2，馬增春2，譚洪玲2，肖成榮2，湯響林2，張伯禮1，高月2

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津330007；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

目的研究人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1能否激活hAhR受體信號(hào)通路誘導(dǎo)CYP1A1基因及蛋白表達(dá)。方法利用前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pGL4.17-CYP1A1報(bào)告基因質(zhì)粒、pcDNA3.1-hAhR表達(dá)質(zhì)粒與pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1對(duì)AhR的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)；并利用Real-time PCR及Western blot技術(shù)對(duì)人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1的不同濃度、不同時(shí)間處理組進(jìn)行mRNA及蛋白的檢測(cè)。結(jié)果報(bào)告基因模型檢測(cè)結(jié)果顯示，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1對(duì)AhR具有轉(zhuǎn)錄激活作用，其中人參皂苷Re與Rf對(duì)AhR轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)明顯；同時(shí)不同濃度人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1均能上調(diào)CYP1A1 mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)論人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，這種誘導(dǎo)作用可能與上述皂苷成分激活A(yù)hR并提高其對(duì)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。

人參皂苷；AhR；CYP1A1；報(bào)告基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；Western blot；藥物相互作用

人參為五加科草本植物人參PanaxginsengC.A. Meyer的根，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有大補(bǔ)元?dú)狻⒁鏆夤堂?、生津養(yǎng)血、安神益智之功效，是目前中醫(yī)臨床常用中藥之一。人參皂苷(ginsenoside)在人參中含量約為4%，是人參主要有效成分之一[1]。根據(jù)皂苷元結(jié)構(gòu)的不同，人參皂苷被分為原人參二醇類皂苷，如人參皂苷Rb1-3、Rc、Rd、Rg3等；原人參三醇類皂苷，如人參皂苷Re、Rf、Rg1、Rh，以及齊墩果酸類皂苷，如人參皂苷Ro和Ri等。人參皂苷中的二醇型與三醇型皂苷數(shù)量較多，被認(rèn)為是人參的最重要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，人參皂苷具有改善機(jī)體免疫力[2]、增強(qiáng)記憶力[3]、抗衰老[4]、抗氧化[5]、促進(jìn)燒傷面愈合[6]和降血糖[7]等作用。隨著其研究的逐漸深入，參附注射液、參麥注射液、生脈飲注射液、人參健脾丸和人參歸脾丸等多種含有人參及其主要成分的制劑大量運(yùn)用于臨床的疾病治療，且在臨床用藥過(guò)程中，其多與其他化學(xué)藥物聯(lián)合使用。在聯(lián)合用藥時(shí)，中藥往往因其富含多樣的天然活性成分而容易發(fā)生藥物間相互作用[8]，這種相互作用是指兩種及兩種以上藥物同時(shí)或先后用藥時(shí)，在代謝環(huán)節(jié)上產(chǎn)生相互作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)臨床劑量的參附注射液中的主要成分紅參對(duì)大鼠 CYP1A2 在 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與肝微粒體酶活性水平具有上調(diào)作用，該上調(diào)作用可能會(huì)加速藥物代謝酶的代謝，從而對(duì)其他合用藥物產(chǎn)生影響[9]。細(xì)胞色素P450(CYP450)酶，簡(jiǎn)稱CYP，主要參與藥物體內(nèi)代謝，藥物對(duì)代謝酶可產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，此改變是導(dǎo)致相互作用發(fā)生的主要原因。CYP是其基因超家族(superfamily)編碼形成的一群蛋白酶[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷對(duì)CYP3A4具有一定的調(diào)控作用[11-12]，但對(duì)CYP其他亞型研究較少。CYP1A1是細(xì)胞色素P450家族成員之一，其表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)制屬于核受體介導(dǎo)型[13]。AhR是一種公認(rèn)的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，未與配體結(jié)合的AhR為一種胞漿蛋白，與配體結(jié)合后的AhR轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與核內(nèi)芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(aryl hydrocarbon nuclear translocator，ARNT)形成異源二聚體，形成的二聚體識(shí)別并結(jié)合靶基因的外源性反應(yīng)元件(xenobiotic response element，XRE)，調(diào)控CYP1A1轉(zhuǎn)錄，影響酶活性，從而改變蛋白質(zhì)功能[14]。CYP450酶系統(tǒng)在藥物相互作用方面具有重要意義，其中一個(gè)重要表現(xiàn)是P450酶的誘導(dǎo)可增加生物轉(zhuǎn)化率，從而降低藥物濃度，使藥效降低；若代謝形成活性藥物則增加了藥物作用或毒性。所以在藥物代謝過(guò)程中，藥物與藥物代謝酶之間的作用以及聯(lián)合用藥時(shí)產(chǎn)生的相互作用，已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[15]。

目前，人參皂苷類成分對(duì)于CYP1A1作用的研究報(bào)道較少。本文利用前期構(gòu)建含有CYP1A1啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4.17-CYP1A1、含有hAhR編碼區(qū)序列的pcDNA3.1-hAhR表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，在細(xì)胞水平上建立基于hAhR介導(dǎo)的CYP1A1藥物誘導(dǎo)劑的體外篩選模型，并利用此體外篩選模型對(duì)人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1進(jìn)行AhR轉(zhuǎn)錄激活特性篩選，篩選結(jié)果顯示人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1均能不同程度地提高AhR轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步檢測(cè)了人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1對(duì)LS174T細(xì)胞中CYP1A1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的影響，為人參及人參皂苷與其他藥物聯(lián)合用藥時(shí)產(chǎn)生相互作用的可能性進(jìn)行預(yù)測(cè)，有助于為臨床中西醫(yī)聯(lián)合用藥和合理化用藥提供有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而提高臨床應(yīng)用人參的安全性與有效性。

1　材料

1.1藥品與試劑人參皂苷Rc，20 mg，批號(hào)：11641-200802；人參皂苷Re，20 mg，批號(hào)：110754-201324；人參皂苷Rg1，20 mg，批號(hào)：110703-201529，人參皂苷Rf，20 mg，批號(hào)：111719-201104，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。TCDD(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)，10 mg，批號(hào)：ED-901-A，購(gòu)自美國(guó)Cerillant 公司。二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)；質(zhì)粒pGL4.17-CYP1A1、pcDNA3.1-hAhR和pRL-TK本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2(美國(guó)Mirus公司)；反轉(zhuǎn)錄與Real time-PCR試劑盒(北京全式金公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual luciferase reporter Kit)(美國(guó)Promega公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(北京普利萊公司)；Western blot試劑盒(美國(guó)Promega公司)；一抗 CYP1A1兔抗人(美國(guó)Proteintech公司)；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Microfuge 22R型離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)； GeneAmp PCR System 2400型PCR儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)；VICTOR X 型多標(biāo)記酶標(biāo)儀(美國(guó) Perkin Elmer公司)； Step one plus型Real-time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystem 公司)；Western blot電泳儀(瑞典Amersham公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；顯影照相儀(美國(guó)GE公司)。

2　方法

2.1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞系HepG2和LS174T購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。HepG2和LS174T細(xì)胞均生長(zhǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)為0.1的特級(jí)胎牛血清、100 mg·L-1青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中， 在37℃，飽和濕度為0.05 CO2的條件下貼壁培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2質(zhì)粒的擴(kuò)增及純化將實(shí)驗(yàn)室甘油凍存分別含有pGL4.17-CYP1A1報(bào)告基因質(zhì)粒、pcDNA3.1-hAhR表達(dá)質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒的菌液在LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按質(zhì)粒提取說(shuō)明書分別提取pGL4.17-CYP1A1、pcDNA3.1-hAhR和pRL-TK 3種質(zhì)粒，經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定A260 nm值，4℃保存待用。

2.3細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前1 d取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔5×105細(xì)胞接種于24孔板中，每組做4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為0.8，棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次。用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒，按照轉(zhuǎn)染試劑TransIT-X2說(shuō)明書，將250 ng pGL4.17-CYP1A1，500 ng pcDNA3.1-hAhR以及作為對(duì)照的50 ng pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。按1 ∶50比例加入TransIT-X2轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育30 min后加入HepG2細(xì)胞中，100 μL每孔。37℃，飽和濕度為0.05 CO2的培養(yǎng)箱孵育12 h后，分別加入含有20 μmol·L-1Rc、Re、Rf和Rg1的無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置2 nmol·L-1TCDD作為陽(yáng)性對(duì)照組。培養(yǎng)24、48 h后，棄去24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入100 μL報(bào)告基因裂解緩沖液，離心12 000 r·min-1，5 min，取上清。取20 μL上清液與100 μL螢火蟲螢光素酶檢測(cè)緩沖液混合后，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)的活性；再加入100 μL海腎熒光素酶檢測(cè)緩沖液，檢測(cè)海腎熒光素酶(Renilla luciferase)活性，計(jì)算兩種熒光素酶活性的比值。

2.4Real-time PCR檢測(cè)人參皂苷對(duì)CYP1A1 mRNA水平變化不同濃度的人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1(5、10、20、50 μmol·L-1)與完全激動(dòng)劑TCDD(2 nmol·L-1)分別處理LS174T細(xì)胞，藥物處理24、48 h后，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為94℃ 30 s，94℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以各目標(biāo)基因2-△△Ct值表示各目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。用于擴(kuò)增的特異性引物序列見表1(Tab 1)。

2.5Western blot檢測(cè)人參皂苷對(duì)CYP1A1的蛋白水平變化不同濃度的人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1(5、10、20、50 μmol·L-1)與完全激動(dòng)劑TCDD(2 nmol·L-1)分別處理LS174T細(xì)胞，藥物處理48 h后，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解20 min提取細(xì)胞全蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定，沸水浴煮10 min變性，50 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1脫脂奶粉于室溫下?lián)u動(dòng)封閉膜2 h，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，化學(xué)發(fā)光，顯影，圖像分析，用Image J軟件計(jì)算灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

Tab 1　Primer sequences used for Q-PCR reactions

3　結(jié)果

3.1基于報(bào)告基因技術(shù)對(duì)人參皂苷增強(qiáng)AhR轉(zhuǎn)錄活性作用篩選藥物處理HepG2細(xì)胞24和48 h后，以DMSO(0.1%)作為溶劑對(duì)照，2 nmol·L-1TCDD為陽(yáng)性對(duì)照組，將各藥物處理組熒光強(qiáng)度與溶劑對(duì)照組熒光強(qiáng)度比值為誘導(dǎo)倍數(shù)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1對(duì)報(bào)告基因激活效應(yīng)趨勢(shì)基本一致，在篩選濃度為20 μmol·L-1，處理時(shí)間為48 h時(shí)，人參皂苷Re激活效應(yīng)明顯(P<0.05)，在篩選濃度為20 μmol·L-1，處理時(shí)間為24、48 h時(shí)，人參皂苷Rf對(duì)AhR產(chǎn)生了中等強(qiáng)度的激活效應(yīng)(P<0.05)，誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.1、2.4，結(jié)果如Fig 1所示。

3.2人參皂苷對(duì)LS174T細(xì)胞CYP1A1 mRNA表達(dá)的影響進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人參皂苷對(duì)LS174T細(xì)胞CYP1A1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，不同濃度的人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1(5、10、20、50 μmol·L-1)分別處理LS174T細(xì)胞24、48 h后，均能誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，結(jié)果如Fig2所示。從劑量效應(yīng)上分析顯示，當(dāng)人參皂苷濃度為50 μmol·L-1誘導(dǎo)作用最強(qiáng)(P<0.01)；從時(shí)間效應(yīng)上分析顯示，48 h的誘導(dǎo)效應(yīng)高于24 h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致，表明人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1通過(guò)激活A(yù)hR受體，可進(jìn)一步上調(diào)其調(diào)控靶基因CYP1A1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果如Fig 2所示。

Fig 1　Fold induction of relative CYP1A1 luciferase activity by ginsenosides for 24 h or 48 h at different ±s,n=3)

A: Ginsenoside Rc; B: Ginsenoside Re; C: Ginsenoside Rf; D: Ginsenoside Rg1, Con: Control group.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.3人參皂苷對(duì)LS174T細(xì)胞CYP1A1蛋白表達(dá)的影響采用Western blot檢測(cè)人參皂苷對(duì)LS174T細(xì)胞CYP1A1蛋白表達(dá)的影響，不同濃度的人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1(5、10、20、50 μmol·L-1)分別處理LS174T細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1均能誘導(dǎo)CYP1A1蛋白表達(dá)，其中人參皂苷Re和Rf差異具有顯著性(P<0.05)，結(jié)果如Fig 3所示。

4　討論

人細(xì)胞色素P450是生物體內(nèi)代謝的重要酶系，CYP1A1主要分布于肝外，在肝臟中含量很低，但其是具有主要誘導(dǎo)能力的代謝酶之一[16]，AhR的下游靶基因眾多，在AhR信號(hào)途徑中，CYP1A1被認(rèn)為是經(jīng)典的下游靶位基因，此基因的轉(zhuǎn)錄激活也是AhR信號(hào)途徑活化的重要標(biāo)志之一[17]。CYP1A1可被多環(huán)芳烴類化合物誘導(dǎo)，并可催化一系列的多環(huán)芳烴化合物生成具有活性的代謝產(chǎn)物[18]。人參為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中草藥材，素有“百藥之王”的美譽(yù)，既作為藥物也可作為食品補(bǔ)充劑，人參皂苷是人參的主要有效成分之一。中藥中富含大量的天然活性成分，具有豐富的生理功能，越來(lái)越多應(yīng)用于臨床治療，如用于高血壓、抑郁癥、糖尿病及心臟病等，但是因中藥成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)較多，長(zhǎng)期應(yīng)用可能會(huì)影響肝臟藥物代謝酶的活性或者表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其他聯(lián)合應(yīng)用藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝產(chǎn)生影響。因此，有必要對(duì)藥物代謝酶與中藥的相互作用關(guān)系進(jìn)行深入研究。

報(bào)告基因法是將含有螢火蟲熒光素酶的編碼基因的質(zhì)粒與目的基因的調(diào)控序列連接在一起構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒并導(dǎo)入細(xì)胞中。此方法可以在藥物研發(fā)早期對(duì)化合物進(jìn)行高通量、快速的相關(guān)核受體激活活性篩選，從而初步判斷化合物是否具有潛在誘導(dǎo)CYP450的能力。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pGL4.17-CYP1A1報(bào)告基因質(zhì)粒、pcDNA3.1-hAhR表達(dá)質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，在細(xì)胞水平上建立基于hAhR介導(dǎo)的CYP1A1藥物誘導(dǎo)劑的體外篩選模型，并利用此體外篩選模型對(duì)人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1進(jìn)行不同濃度與不同時(shí)間的篩選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1能夠激活A(yù)hR的轉(zhuǎn)錄活性，其中人參皂苷Rf對(duì)AhR產(chǎn)生了中等強(qiáng)度的激活效應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1是否對(duì)CYP1A1表達(dá)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)選擇了內(nèi)源性核受體表達(dá)量較高的LS174T細(xì)胞，從CYP1A1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)兩個(gè)方面進(jìn)行進(jìn)一步地確證。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1通過(guò)激活A(yù)hR，能明顯地上調(diào)CYP1A1的mRNA表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性；同時(shí)隨著4種人參皂苷的濃度升高，CYP1A1的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中人參皂苷Re和Rf誘導(dǎo)表達(dá)差異具有顯著性。以上結(jié)果提示，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1能夠?qū)YP1A1表達(dá)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，同時(shí)因?yàn)锳hR作為CYP1A1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，因此推測(cè)這種作用可能起始于AhR對(duì) CYP1A1轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)節(jié)。

Fig 2　Fold induction of CYP1A1 mRNA expression relative to β-actin mRNA by the 4 kinds of ginsenoside at different concentrations in LS174T ±s,n=3)

A: Ginsenoside Rc; B: Ginsenoside Re; C: Ginsenoside Rf; D: Ginsenoside Rg1, Con: Control group.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

近年來(lái)，關(guān)于中藥及有效成分與藥物代謝酶相互作用的研究報(bào)道日益增多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種中藥可以對(duì)P450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或者抑制作用，例如葛根素或葛根提取物可以誘導(dǎo)大鼠CYP1A1/2、2A1和2C11的表達(dá)并抑制2B1、2E1和3A的活性[19]；圣約翰草為治療抑郁非處方藥，其能誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)，臨床上與地高辛合用可降低地高辛的血藥濃度，與華法林合用能夠減弱華法林的抗凝作用[20]；三七及其有效成分三七總皂苷對(duì)大鼠CYP1A1/2、2E1產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，與一些主要由CYP1A2進(jìn)行代謝的藥物如雌二醇、非那西丁等，以及由CYP2E1進(jìn)行代謝的藥物，如氨苯砜、含氟麻醉藥等合用時(shí)，可能引發(fā)潛在的相互作用[21]。因此，本研究考察了4種人參皂苷對(duì)AhR介導(dǎo)的CYP1A1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明人參及其有效成分與肝臟藥物代謝酶之間的相互作用。此研究不僅能為潛在的藥物相互作用提供一種預(yù)測(cè)方法，而且可為新藥研發(fā)提供具有實(shí)際意義的理論數(shù)據(jù)。

Fig 3　Fold induction of CYP1A1 protein expression relative to GAPDH by 4 kinds of ginsenoside at different concentrations in LS174T cells for 48 ±s,n=3)

A: Ginsenoside Rc; B: Ginsenoside Re; C: Ginsenoside Rf; D: Ginsenoside Rg1, Con: Control group.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

(致謝：感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所高月研究員提供了良好的實(shí)驗(yàn)條件；感謝王宇光副研究員在實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)方面的悉心指導(dǎo)。)

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Study on the induction of drug metabolizing enzyme CYP1A1 activity by Ginsenoside Rc,Re,Rf and Rg1

LI Han1,2, WANG Yu-guang2, MA Zeng-chun2，TAN Hong-ling2,XIAO Cheng-rong2,TANG Xiang-lin2, ZHANG Bo-li1, GAO Yue2

(1TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin330007，China；2InstituteofRadiationMedicineAcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China)

AimTo investigate the induction effect of ginsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 on CYP1A1, and further validate the role of aryl hydrocarbon receptor in CYP1A1 expression. MethodsDual luciferase reporter gene system was performed. Four kinds of ginsenoside were screened for aryl hydrocarbon receptor activation by reporter assays, and TCDD as the positive control. Further with different concentrations of ginsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 treated on LS174T cells, RNA and total protein were extracted to detect the regulating effect of ginsenosides on CYP1A1 mRNA and protein expression with Real-time PCR and Western blot technology respectively.ResultsReporter gene screening showed that the ginsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 could activate AhR and had potential effects on the induction of CYP1A1 enzyme.Meanwhile, dose-dependent induction of the gene expression were observed in response to ginsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 and the levels of CYP1A1 protein expression were increased by ginsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 in varying degrees. ConclusionGinsenoside Rc, Re, Rf and Rg1 can up-regulate the gene and protein expression of CYP1A1 possibly via the AhR-mediated CYP1A1 pathway.

ginsenoside; AhR; CYP1A1reporter gene; Real-time PCR; Western blot; drug interactions

2016-05-06，

2016-06-05

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No 2014ZX0930 4307001-003,2015ZX09501004003-003)

李晗(1989-)，女，博士生，研究方向：中藥藥理，E-mail: wzf38@126.com；

高月(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理，通訊作者，E-mail: gaoyue@bmi.ac.cn；

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.007

A

1001-1978(2016)09-1217-07

R284.1；R345.99；R392.11；R394.2

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.014.html

王宇光(1979-)，男，博士，副研究員，研究方向：分子藥理，通訊作者，E-mail: wangyg@bmi.ac.cn