人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾所致SD大鼠認知和運動行為障礙的影響△

盧聰，金劍，王克柱，李瑩輝，曲麗娜，劉新民，4*，斯拉甫·艾白

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國醫(yī)學科學院 醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021；3.中國航天員中心 航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094；4.湖南省實驗動物中心 湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙 410331；5.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049)

人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾所致SD大鼠認知和運動行為障礙的影響△

盧聰1，金劍2，王克柱1，李瑩輝3，曲麗娜3，劉新民1，4*，斯拉甫·艾白5

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京100193；2.中國醫(yī)學科學院 醫(yī)學實驗動物研究所，北京100021；3.中國航天員中心 航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室，北京100094；4.湖南省實驗動物中心 湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙410331；5.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊830049)

目的：研究人參皂苷Rg1和Rb1對睡眠干擾致SD大鼠認知和運動行為障礙的影響。方法：將70只Sprague-Dawley 雄性大鼠隨機分為7組，每組10只，分別為：對照組(control)、模型組(model)、莫達非尼組(Modafinil，300mg·kg-1)、Rg1高劑量組(Rg1，12mg·kg-1)、Rg1低劑量組(Rg1，6mg·kg-1)、Rb1高劑量組(Rb1，12mg·kg-1)、Rb1低劑量組(Rb1，6mg·kg-1)。滾筒適應3d后開始連續(xù)15d睡眠干擾造模并同時進行給藥，于第15天開始自主活動實驗、步態(tài)實驗和Morris水迷宮實驗。結果：經過連續(xù)15d的睡眠干擾后，模型組大鼠的自主活動和步態(tài)行為均受到一定程度的下降，在水迷宮中潛伏期明顯增加，穿臺次數(shù)顯著下降，而莫達非尼和人參皂苷Rg1和Rb1各給藥組能不同程度地增加睡眠干擾大鼠的自主活動，增強大鼠左右肢的協(xié)調性，降低水迷宮中潛伏期。結論：兩種人參皂苷Rg1和Rb1對睡眠干擾15d后SD大鼠的認知和運動能力有改善作用。

人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；睡眠干擾；SD大鼠；自主活動；水迷宮；步態(tài)

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展，人們面臨著更多的連續(xù)性工作與學習的挑戰(zhàn)。在連續(xù)工作的狀態(tài)下，不可避免地會導致睡眠時間直線減少，睡眠質量嚴重降低。有研究表明睡眠干擾(Slee PInterruption，SI)或睡眠缺失(Slee PLoss，SL)可造成機體免疫力、作業(yè)能力、警覺性水平和判斷力降低，其中睡眠干擾對認知功能的影響最受關注[1]。因此，需要安全有效的防治措施改善睡眠，對提高工作效率、保障身心健康具有重要意義。目前，睡眠干擾的對抗措施主要包括藥物和非藥物療法兩種。非藥物療法主要通過制定合理的值班表、讓連續(xù)作業(yè)人員進行必要的體育鍛煉并給予必要的環(huán)境刺激，以此保證最佳身體狀態(tài)。藥物的應用主要為化學藥，如鎮(zhèn)靜催眠藥、中樞興奮藥等，而對傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究相對較少。《神農本草經》中記載人參“主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。久服，輕身延年”。相關研究表明，人參的多種成分如人參總皂苷、人參皂苷Rb1等有改善學習記憶的作用。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1和Rb1對東莨菪堿模型癡呆小鼠認知功能有改善作用[2]；楊國榆等[3]報道了人參皂苷對睡眠干擾大鼠行為、學習能力和記憶保持的影響。由于中醫(yī)藥在長期的臨床實踐中積累了豐富的臨床經驗和有效方劑，因此有著極好的應用前景，并需要現(xiàn)代方法進行評價。因此，本實驗選用人參皂苷Rg1和Rb1探索其對睡眠干擾所導致的認知和運動行為障礙的影響。

1 材料

1.1藥物與儀器

人參皂苷單體Rg1和Rb1(大連泓億生物技術有限公司，純度95%)；莫達非尼(廣州湘北威爾曼公司)。

滾筒式大小鼠睡眠干擾儀，大鼠自主活動實驗計算機圖像實時監(jiān)測分析處理系統(tǒng)、大鼠Morris水迷宮計算機自動測試分析處理系統(tǒng)及大小鼠步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)(北京鑫海華儀有限公司、中國航天員中心和中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所聯(lián)合研制)；分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2動物

SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠70只，體重220～240g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK京2006-0009。飼養(yǎng)條件：自由攝食攝水，實驗室安靜，溫度：22～24℃，濕度：40%～60%，12h照明/12h黑暗環(huán)境(8：00開燈，20：00關燈)。本實驗遵循實驗動物倫理原則。

2 方法

2.1實驗動物分組

采用隨機數(shù)字表法將動物分為對照組、睡眠干擾模型組、陽性藥莫達非尼組(300mg·kg-1)、人參皂苷Rg1高劑量組(12mg·kg-1)、人參皂苷Rg1低劑量組(6mg·kg-1)、人參皂苷Rb1高劑量組(12mg·kg-1)、人參皂苷Rb1低劑量組(6mg·kg-1)，分籠飼養(yǎng)，共7組，每組10只。依次進行自主活動實驗、步態(tài)實驗和Morris水迷宮實驗。

2.2給藥方法

睡眠干擾前一天(8：00)開始灌胃給藥，每只動物每天按8mL·kg-1·d-1灌胃給藥1次。行為學檢測期間，每只動物檢測前1h給藥。給藥持續(xù)直到行為學檢測全部結束。

2.3睡眠干擾實驗

實驗前先將動物放入滾筒式睡眠干擾儀中適應，連續(xù)3d，每天3h(滾筒轉速：1圈·min-1，每轉3圈，休息5min)[4]，在滾筒適應最后一天8：00開始給藥。在適應3d后，將模型組及各給藥組動物灌胃給藥后放入滾筒(8：00)中，開始進行睡眠干擾，參數(shù)設置與適應時保持一致，每天除取出灌胃給藥的時間之外動物全部在轉籠內進行睡眠干擾，連續(xù)干擾15d并于第15天開始進行行為學檢測，同樣測試完畢后繼續(xù)放入滾筒進行睡眠干擾，直至行為學檢測完全結束。對照組常規(guī)飼養(yǎng)。

2.4自主活動實驗

睡眠干擾15d，于第15天8：00開始進行自主活動檢測。

通過大鼠自主活動實時測試分析處理系統(tǒng)[5]進行測試，該系統(tǒng)由自主活動測試箱和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。動物活動場放置于測試箱內，在圓柱形桶的正上方安裝有攝像頭，自動監(jiān)測動物的運動軌跡并將所檢測到的活動信息傳送至計算機系統(tǒng)，軟件對采集到的動物運動軌跡進行分析，通過總路程、運動總時間等指標來反映動物的自主活動情況。實驗時間為10min，具體自主活動實驗步驟參照文獻進行[6-7]。

2.5步態(tài)實驗

睡眠干擾第16天8：00開始使用大小鼠步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)對運動中的步態(tài)組大鼠進行步態(tài)分析。光線從熒光管中發(fā)出，透過玻璃平板。當大鼠的腳掌與玻璃平板的表面接觸時，光線向下反射，使得下方的高速攝像頭捕捉到清晰的腳印圖像，通過大小鼠步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)全程采集大鼠行走過程的足印信息，然后利用步態(tài)分析系統(tǒng)自動識別分析大鼠足跡的步行周期、支撐距離、支撐時長、擺動時長、制動時長、推進時長、步頻等97種指標，以此客觀、準確和全面地反映動物步態(tài)的變化情況。在模型制作前，將大鼠置于大小鼠步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)中訓練1周，每天訓練3次，使大鼠在實驗時能以恒速無停頓地通過大小鼠步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)的通道。

2.6Morris水迷宮實驗

睡眠干擾第17天8：00開始進行水迷宮定位航行試驗。定位航行連續(xù)檢測5d，實驗時間為60s，定位航行檢測結束后24h進行空間探索試驗。

大鼠Morris水迷宮計算機自動測試分析處理系統(tǒng)由一個直徑180cm、高38cm的圓水池，攝像頭和分析系統(tǒng)組成。圓柱形平臺高13cm，圓面直徑為6cm，水深15cm，水溫控制在(25±2)℃，室溫25℃，實驗室內物品與人員位置保持不變，照明設備四周對稱，光照恒定，無光線直射在水池內。測試時將水迷宮中注入水，平臺隱于水面下2cm處，在水中加入墨汁調黑，以避免實驗動物直接觀察到平臺，并保證系統(tǒng)對目標正確識別。將水池平面劃分為4個象限(NE、SE、SW、NW)，平臺放置于目標象限的正中水域內，采用大鼠Morris水迷宮計算機自動測試分析處理系統(tǒng)自動記錄動物的運動軌跡，用于指標提取和分析。測試分為定位航行試驗和空間探索試驗兩個階段。

定位航行(placenavigation)試驗：連續(xù)檢測5d，測試動物空間定位能力。將動物從入水到尋臺成功所需的時間記作潛伏期。用潛伏期評價動物空間定位學習能力。

空間探索(spatialprobe)：在實驗第6天拆除平臺，從平臺所在象限的對側象限將動物面向池壁放入水中，讓動物在水中自由游泳。以實驗設定時間內穿過原平臺位置的次數(shù)、平臺象限的游程比率、平臺象限的時間比率等來評價動物空間記憶能力。空間探索實驗與定位航行實驗時間相同(90s)。

2.7統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠自主活動的影響

如表1顯示，與對照組比較，模型組的總路程、平均速度、運動總時間顯著降低(P<0.01)；靜息總時間顯著增加(P<0.01)；邊緣區(qū)時間降低(P<0.05)。與模型組比，Rg1高劑量組的總路程、平均速度、運動總時間增加(P<0.05)；靜息總時間降低(P<0.05)。與模型組比，陽性藥組的總路程、平均速度、運動總時間顯著增加(P<0.01)；靜息總時間顯著降低(P<0.01)。

3.2人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠步態(tài)的影響

如表2顯示，模型組與對照組比較，后肢步寬、左前推進指數(shù)顯著性增加(P<0.01)，雙支持時向-左前-右后、左前步幅、右前足跡最大面積、右前足跡最大強度、左后擺動時長、右前相對于左后對側協(xié)調性等21項指標降低(P<0.05)。與模型組比較，Rg1低劑量組、Rb1高劑量組左前推進指數(shù)顯著性降低(P<0.01)，Rb1低劑量組后置步寬顯著性降低(P<0.01)；Rg1高劑量、Rb1高劑量后肢步寬顯著降低(P<0.01)，Rb1低劑量組左前推進指數(shù)顯著降低(P<0.01)；Rg1低劑量組后肢步寬降低(P<0.05)。陽性藥組與模型組比，左前足跡最大面積、左前擺動時長等5項指標顯著增加(P<0.01)；左前足跡平均強度、左后擺動時長、右前擺動時長增加(P<0.05)。Rg1高劑量組與模型組比，左前步幅等10項指標顯著增加(P<0.01)。Rg1低劑量組與模型組比，右前擺動時長、右前相對于左后對側協(xié)調性增加(P<0.05)；左后擺動時長等12項指標顯著增加(P<0.01)。Rb1高劑量組與模型組比，左前擺動時長等12項指標顯著增加(P<0.01)。Rb1低劑量組與模型組比，左后相對于左前同側協(xié)調性增加(P<0.05)；右前相對于左后對側協(xié)調性等10項指標顯著增加(P<0.01)。

3.3人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠水迷宮成績的影響

3.3.1 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠水迷宮定位航行的影響 如表3顯示，與對照組比較，模型組在第2～5天的潛伏期顯著增加(P<0.01)。與模型組比，Rg1高劑量組在第2天顯著降低(P<0.01)；第4天降低(P<0.05)。Rb1高劑量組在第2天顯著降低(P<0.01)；第5天降低(P<0.05)。Rg1低劑量組在第2天降低(P<0.05)；Rg1、Rb1高劑量組，Rg1、Rb1低劑量組、陽性藥組在第3天顯著降低(P<0.01)。

表1 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠自主活動的影響 /s

注：給藥組與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；模型組與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表2 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠步態(tài)的影響

表2(續(xù))

表3 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠定位航行潛伏期的影響 /s

3.3.2 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠水迷宮空間探索的影響 如表4顯示，與對照組比較，模型組的穿臺次數(shù)顯著降低(P<0.01)。與模型組比，陽性藥組的穿臺次數(shù)增加(P<0.05)。

表4 人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠空間探索的影響

4 討論

睡眠干擾與認知功能下降、焦慮等神經精神疾病關系密切[8-11]。關于對抗睡眠干擾的措施，有作息制度的制定、睡眠衛(wèi)生等，藥物的研究主要是中樞興奮性藥和鎮(zhèn)靜催眠藥等化學藥[12]。而以上兩類化學藥都存在嚴重的不良反應，比如中樞興奮藥可以產生失眠，而鎮(zhèn)靜催眠藥長期使用有耐受性、成癮性。此類化學藥多屬于精神藥品，其應用受到嚴格的限制[13]。所以人們將更多的目光投向了作用緩和、不良反應小的中藥。人參因其作用廣泛而備受國內外學者的關注。相關研究表明，口服人參皂苷對睡眠干擾大鼠學習記憶能力受損有明顯的保護作用[14]。

從自主活動結果來看，睡眠干擾15d對SD大鼠自主活動影響顯著。人參對中樞神經系統(tǒng)的鎮(zhèn)靜和興奮雙向調節(jié)作用與用藥時神經系統(tǒng)的功能狀態(tài)、用藥劑量及人參不同成分有關[15]。與模型組相比，Rg1高劑量組動物自主活動增加，可能與以上因素相關，而其他給藥組的自主活動未顯現(xiàn)出顯著差異，可能與動物已適應該種滾筒轉動有關，但仍需進一步的研究。步態(tài)實驗結果表明，睡眠干擾15d后會造成SD大鼠運動行為障礙。人參皂苷Rg1、Rb1給藥后則可以顯著改善大鼠運動行為。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、Rb1可以提高東莨菪堿癡呆動物的水迷宮空間定位學習和記憶能力[2，16-17]。人參莖葉皂苷對睡眠干擾大鼠“Y”迷宮空間分辨學習能力有明顯改善作用[18]。人參皂苷的主要促智成分Rb1和Rg1可增強膽堿能系統(tǒng)的功能，增加腦突觸受體對3H-膽堿的攝取，增加乙酰膽堿的合成與釋放[19]。相關研究表明人參皂苷Rg1可通過多種途徑增加神經可塑性，如提高突觸效能、M-膽堿受體密度增加與BDNF表達增加[20-22]。水迷宮實驗結果表明，睡眠干擾15d后會造成動物空間記憶能力下降，兩種人參單體Rg1、Rb1給藥在一定程度上可以改善大鼠空間記憶能力，但并不明顯，其作用有待進一步研究。。

綜上所述，滾筒法睡眠干擾(20h·d-1)15d使SD大鼠認知和運動能力下降，而人參皂苷Rg1和Rb1給藥可以改善以上能力的降低，尤其是對運動能力的改善較為顯著，可為中藥的相關研究提供參考。

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EffectsofGinsenosideRg1andRb1onSDRats’sCognitionandExerciseBehaviorDisorderduetoSleepInterruption

LUCong1，JINJian2，WANGKezhu1，LIYinghui3，QULina3，LIUXinmin1，4*，SILafu·AiBai5

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.InstituteofLaboratoryAnimalScience，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100021，China；3.ChinaAstronautResearchandTrainingCenter，StateKeyLabofSpaceMedicineFundamentalsandApplication，Beijing100094，China；4.HunanLaboratoryAnimalCenter，HunanProvincialResearchCenterforSafetyEvaluationofDrugs，Changsha41033，China；5.XinjiangInstituteofTraditionalUighurMedicine，Urumqi830049，China)

Objective：To investigate the effects of ginsenoside Rg1and Rb1on SD rats’s cognition and exercise behavior disorder due to sleep interruption.Methods：Seventy healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，model group，300mg·kg-1of Modafinil group，4treatment groups (6mg·kg-1，12mg·kg-1of ginsenoside Rg1，6mg·kg-1，12mg·kg-1of ginsenoside Rg1).After3days of adaptation，the rats were administrated orally the treatments for consecutive15days with sleep disturbances at the same time，and then adopted locomotor activity，gait instrument，and Morris water maze to elevate.Results：After15days of sleep disturbances，the locomotor activities and gait behaviors of the model group rats were reduced to a certain extent，the latency of place navigation in the Morris water maze was increased significantly and the number of crossing in the target quadranta was significantly reduced.While these indexes were improved to different extents after modafinil and ginsenosides Rg1and Rb1oral administration.Conclusion：Ginsenosides Rg1and Rb1have a significant improvement in cognitive and motor ability of SD rats after15days’ sleep interruption.

Ginsenoside Rg1；ginsenoside Rb1；sleep interruption；SD rats；locomotor activity；Morris water maze；Gait instrument

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.010

2015-09-21)

科技部國際科技合作與交流專項(2011DFA32730)；全軍醫(yī)學科技“十二五”科研項目(BWS11J052)；新疆科技廳支疆項目(201491174)

*

劉新民，教授，博士生導師，研究方向：中藥神經藥理學；Tel：(010)57833245，E-mail：liuxinmin@hotmail.com