多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選人參醇提工藝

韓宵，朱磊，閆春風(fēng)，翁慧瀝，董海榮*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 中藥研究所，河北 承德 067000；2.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德，067000；3.河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北 承德 067000)

多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選人參醇提工藝

韓宵1，2，3，朱磊2，3，閆春風(fēng)2，3，翁慧瀝2，3，董海榮2，3*

(1.承德醫(yī)學(xué)院 中藥研究所，河北 承德067000；2.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德，067000；3.河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北 承德067000)

目的：通過(guò)多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選人參醇提的最佳取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)。方法：采用正交試驗(yàn)法考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑用量及其交互作用對(duì)人參醇提工藝的影響。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)(UV)法測(cè)定人參總皂苷和蒸發(fā)檢測(cè)器-高效液相色譜法(HPLC-ELSD)測(cè)定人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。并以人參總皂苷得率，人參皂苷Rg1、Re轉(zhuǎn)移率，人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率，人參總皂苷得率和出膏率為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)判。結(jié)果：確定最佳醇提工藝為70%乙醇6倍量，提取3次，每次2h。結(jié)論：該法簡(jiǎn)單、易行、重復(fù)性好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

人參；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參總皂苷；正交試驗(yàn)法

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、安神益智的功能[1]。人參具有增強(qiáng)記憶力、提高免疫力、改善心血管、延緩衰老、抗腫瘤等多種藥理作用[2-3]。其主要活性成分為多種人參皂苷、糖類(lèi)、揮發(fā)油、有機(jī)酸、氨基酸、維生素以及多種微量元素。人參皂苷的活性最強(qiáng)，具有抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常和益智的作用[4-6]。本研究采用正交試驗(yàn)法[7-11]，以人參皂苷Rg1、Re轉(zhuǎn)移率，人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率，人參總皂苷得率和出膏率為指標(biāo)，進(jìn)行人參醇提工藝研究，實(shí)現(xiàn)人參醇提工藝工業(yè)化生產(chǎn)。

1 儀器與材料

Agilent1260高效液相色譜儀；Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；AE240十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士梅特勒)；UV-2401PC紫外分光光度儀(日本島津)；人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110703-201027，110754-200822，110704-201223)；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

人參藥材由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司藥物研究院董海榮工程師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0～20 min，19.5% A；20～32 min，27%A；32～40 min，32% A；40～50 min，33% A；50～60 min，38% A；60～70 min，38% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為85 ℃，氣體流速為1 L·min-1，增益為2；進(jìn)樣量為10 μL[12-14]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.928 7、0.170 6、0.452 1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取人參提取液1 g，精密稱(chēng)定，加入80%甲醇50 mL，回流提取2 h，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)铀?5 mL，微熱使其溶解。用水飽和的正丁醇振搖萃取4次(15、15、10、10 mL)，合并正丁醇萃取液，用氨試液洗滌2次，每次15 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得[12-14]。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣4、6、8、10、15、20 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，人參皂苷Rg1：Y=1.529 8X-2.424 9(r=0.999 6)；人參皂苷Re：Y=1.284 2X-1.332 5(r=0.999 1)；人參皂苷Rb1：Y=1.359 3X-1.614 8(r=0.999 7)。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1、Rg1、Re分別在3.715～18.574、0.682～3.412、1.808～9.042 μg線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參皂苷Rb1、Rg1、Re峰面積 RSD值分別為1.02%、1.73%、1.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定人參皂苷Rb1、Rg1、Re的峰面積，計(jì)算峰面積RSD分別為0.25%、0.75%、0.43%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批人參提取液，按2.1.3項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果人參皂苷Rb1、Rg1、Re含量的RSD分別為1.78%、1.97%、1.88%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的人參提取液適量，精密稱(chēng)取6份，每份約0.5 g，精密加入對(duì)照品溶液3 mL，按2.1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果人參皂苷Rb1、Rg1、Re的平均回收率分別為100.5%、99.5%、97.7%，RSD分別為1.67%、1.46%、1.53%。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取正交試驗(yàn)1～18號(hào)樣品按2.1.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算人參皂苷Rb1、Rg1、Re的含量。

2.2人參總皂苷的含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取人參皂苷Re對(duì)照品，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取人參提取液100mg，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，超聲處理(250Hz，490W)，放置室溫，甲醇補(bǔ)重，濾過(guò)，即為供試品溶液。

2.2.3線(xiàn)性關(guān)系考察 精密移取對(duì)照品溶液20、40、80、120、160、200μL，分別置具塞試管中，氮?dú)獯蹈扇軇尤?%香草醛高氯酸試液0.5mL，置60℃恒溫水浴上，充分混勻后，加熱15min，立即用冷水冷卻2min，加入77%硫酸溶液5mL，搖勻；以試劑作空白，消除氣泡后，于540nm處測(cè)定吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=3.6998X-0.0123(r=0.9998)，線(xiàn)性范圍為21.321～213.21μg。

2.2.4精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液80μL，加入具塞試管中，氮?dú)獯蹈扇軇?，?.2.3項(xiàng)下方法處理，于540nm處重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算A值RSD為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批人參提取液的6份供試品溶液各80μL，按2.2.3項(xiàng)下方法處理，于540nm處測(cè)定A值，計(jì)算RSD為1.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品80μL，按2.2.3項(xiàng)下方法處理，分別在10、20、30、45、50、60min，測(cè)定540nm處A值，計(jì)算RSD為1.28%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的人參提取液50mg，置于錐形瓶中，共6份，各精密加入人參皂苷Re對(duì)照品1mL，按2.2.3項(xiàng)下方法處理，于540nm處測(cè)定A值，結(jié)果平均回收率為100.2%，RSD為1.27%，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2.8樣品含量的測(cè)定 取正交試驗(yàn)1～18號(hào)樣品按2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法處理，測(cè)定540nm處A值，計(jì)算人參總皂苷含量。

2.4人參乙醇回流提取工藝的優(yōu)選

2.4.1正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，本研究確定采用L18(37)正交表，對(duì)乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、溶劑用量(D)4個(gè)試驗(yàn)因素進(jìn)行考察，并考察因素A與B、C的交互作用的影響。其提取工藝因素水平表見(jiàn)表1。取30g人參藥材(1～2cm段)18份，按照正交試驗(yàn)因素水平表操作，加熱回流，合并提取液并濃縮回收乙醇，得浸膏提取物備用。

表1 因素水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 以人參皂苷Rg1、Re轉(zhuǎn)移率(Ⅰ)、人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率(Ⅱ)、人參總皂苷得率(Ⅲ)和出膏率(Ⅳ)為指標(biāo)，采用加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行綜合評(píng)分，優(yōu)選人參醇提工藝。轉(zhuǎn)移率或得率最高值為100分，最低值為0分。以轉(zhuǎn)移率或得率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高、最低兩點(diǎn)帶入，得人參皂苷Rg1、Re、Rb1轉(zhuǎn)移率和人參總皂苷得率三者的直線(xiàn)方程分別為Y=2.656 0X-135.511 3；Y=2.554 9X-135.385 8；Y=21.459 2X-97.424 9，將正交表中各個(gè)轉(zhuǎn)移率或得率帶入，得到相應(yīng)的分值。出膏率最低值為100分，最高分為0分，以出膏率為橫坐標(biāo)，得分為縱坐標(biāo)，將最高、最低兩點(diǎn)帶入，得直線(xiàn)方程為Y=-20.491 8X+261.885 2，將正交表中各個(gè)轉(zhuǎn)移率帶入，得到相應(yīng)的分值。權(quán)重系數(shù)依次為0.4、0.3、0.2、0.1，綜合評(píng)分=Ⅰ得分×0.4+Ⅱ得分×0.3+Ⅲ得分×0.2+Ⅳ得分×0.1。試驗(yàn)結(jié)果及綜合見(jiàn)表2。采用spss 20軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表2(續(xù))

據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果表極差R值大小表明，影響人參醇提工藝因素排序?yàn)镃>A>B>AC>E>D。在給定的水平條件下，各因素對(duì)提取效果的影響情況為A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C2>C1、D1>D3>D2。因素A和C對(duì)人參醇提工藝影響較大，因素A、C、B和因素A與因素C的交互作用對(duì)人參醇提工藝影響較大，而因素D的影響小于E，可以認(rèn)為是由于誤差引起的。

表3 方差分析表

注：F0.01(2，5)=13.27；F0.05(2，5)=5.79。

由方差分析表來(lái)看，因素C對(duì)人參醇提工藝影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，因素A對(duì)人參醇提工藝影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因素B和D的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。故從大生產(chǎn)降低能耗、節(jié)約成本考慮，確定最佳提取條件為A2B1C3D1，即70%乙醇，6倍量，提取2 h，提取3次。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選的最佳提取工藝A2B1C3D1，取300 g人參(1～2 cm段)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，見(jiàn)表4。結(jié)果表明工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

人參所含的化學(xué)成分很復(fù)雜，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rf等為其主要活性成分；2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中人參藥材[8]含量測(cè)定項(xiàng)下以人參皂苷Rg1和Re的總量及人參皂苷Rb1的含量來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量；人參皂苷為紫外末端吸收，采用203nm，乙腈-水梯度洗脫檢測(cè)，存在基線(xiàn)漂移、干擾等問(wèn)題。因此本試驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定人參皂苷Rb1、Re、Rg1的含量，以人參皂苷Re、Rg1、Rb1轉(zhuǎn)移率為主要指標(biāo)來(lái)優(yōu)選人參醇提工藝。并采用人參總皂苷得率和出膏率為次要指標(biāo)來(lái)更全面優(yōu)化醇提工藝，為日后優(yōu)化其制劑工藝奠定基礎(chǔ)。

人參醇提正交試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度和提取次數(shù)為人參醇提工藝的主要影響因素，提取時(shí)間和溶劑用量的影響不明顯。故在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)為節(jié)約生產(chǎn)成本，選用6倍量提取2h。最終優(yōu)選工藝為A2B1C3D1，即6倍量70%乙醇，提取2h，提取3次。

人參提取工藝的方法有滲漉提取、回流提取、超聲提取等。人參回流提取較滲漉提取有生產(chǎn)周期短、醇用量小等優(yōu)點(diǎn)；較超聲提取有裝置簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，工業(yè)化生產(chǎn)中使用普遍。本試驗(yàn)研究醇提工藝的最佳工藝，可應(yīng)用于人參及其制劑的生產(chǎn)中。

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OptimizationofEthanolRefluxExtractionTechniqueforPanaxginsengbyMulti-indexComprehensiveWeightedScoreEvaluation

HANXiao1，2，3，ZHULei2，3，YANChunfeng2，3，WENGHuili2，3，DONGHairong2，3*

(1.InstituteofChineseMateriaMedicaofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.JingfukangPharmaceuticalGroupCo，Chengde067000，China；3.NewMaterialsEngineeringTechnologyCenterofTCMofHebeiProvince，Chengde067000，China)

Objective：To optimize ethanol reflux optimal extraction technique forPanaxginsengand confirm the optimum extraction process parameters by multi index comprehensive weighted score evaluation.Methods：Orthogonal experiment method was applied to investigate ethanol concentration，extraction time，extraction times，solvent consumption and their interaction effects on ginseng alcohol extraction process.The total ginseng saponins was determined by UV and the content of ginsenoside Rg1，Re and Rb1were determined by HPLC-ELSD.With transfer rate of Rg1and Re ginsenosides,ginsenoside Rb1,tatal ginseng saponin yeild and the extract rate as the index，the extraction was comprehensive evaluated by using the weighted scoring method.Results：The optimum factors was6times of70% ethanol，refluxing and extracting for2h，for3times.Conclusion：The optimized extraction process is simple，easy，with good reproducibility and suitable for industrial production.

Panaxginseng；ginsenoside Rg1；ginsenoside Re；ginsenoside Rb1；orthogonal design

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.016

2015-10-25)

*

董海榮，工程師，研究方向：中藥新藥研發(fā)；Tel：(0314)2292392，E-mail：donghairong312@163.com