人參多糖檢測(cè)方法及提取工藝優(yōu)選

肖志偉，樂智勇，朱國(guó)雪，梁生旺*

(1.廣東藥學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006；2.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京 102629；3、廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

人參多糖檢測(cè)方法及提取工藝優(yōu)選

肖志偉1，樂智勇2，朱國(guó)雪3，梁生旺1*

(1.廣東藥學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州510006；2.康美(北京)藥物研究院有限公司，北京102629；3、廣東藥學(xué)院，廣東 廣州510006)

目的：優(yōu)選人參多糖檢測(cè)方法和最佳提取工藝。方法：對(duì)比幾種檢測(cè)人參多糖方法的結(jié)果，優(yōu)選人參多糖檢測(cè)方法；采用正交試驗(yàn)法，以多糖提取率為考察指標(biāo)，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，優(yōu)選人參多糖提取工藝。結(jié)果：人參最佳檢測(cè)方法為苯酚-硫酸法；最佳提取工藝為加水量12倍，每次提取1h，提取3次。結(jié)論：苯酚-硫酸法檢測(cè)人參多糖含量準(zhǔn)確性高，方法穩(wěn)定可行；優(yōu)選工藝操作簡(jiǎn)單，提取率高，穩(wěn)定可行。

多糖檢測(cè)；人參多糖；水提工藝；正交試驗(yàn)

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根。具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神之功能[1]。人參主要化學(xué)成分為多種人參皂苷、糖類、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸及酯、維生素以及多種微量元素等[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷具有增強(qiáng)免疫力[3]、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、保護(hù)心肌細(xì)胞[4]等作用；人參多糖在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、抗輻射[8]等方面亦具有顯著的藥理作用。由于人參多糖的活性、相對(duì)分子量、溶解度和結(jié)構(gòu)的不同，不同的處理方法對(duì)其含量檢測(cè)的影響比較大。近年人參提取多為單一類成分的提取，利用率偏低。因此，本文對(duì)人參多糖檢測(cè)方法和人參醇提后的藥渣水提的提取工藝進(jìn)行研究，為提高人參多糖檢測(cè)準(zhǔn)確性和人參的利用率提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器

UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)(杭州庫(kù)侖科技有限公司)；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；XW-80A型旋渦混合儀(上海五九自動(dòng)化設(shè)備有限公司)；低速臺(tái)式離心機(jī)800B(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DHG-9001-1s型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(成都浩馳儀器有限公司)。

1.2材料

人參購(gòu)自康美(毫州)世紀(jì)國(guó)藥中藥有限公司；亞甲藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150317)；D-無水葡萄糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205，含量≥99.5%)；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、蒽酮、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀均為分析純；水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1人參藥材預(yù)處理

取人參藥材，加10倍量濃度為70%的乙醇水溶液，提取3次，每次提取3h，濾過，回收提取人參皂苷后的殘留物，烘干備用。

2.2葡萄糖對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖0.5g，加水溶解，并定容至50mL，此溶液質(zhì)量濃度為10mg·mL-1，用前稀釋100倍(質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1)。

2.3供試品溶液的制備

稱取預(yù)處理過的人參藥材50g，加入15倍量的水，100℃水浴提取3次，每次3h[9]，濾過，合并濾液，濃縮，加無水乙醇調(diào)濃度至80%，4℃冷藏，靜置4h。離心，棄去上清液，沉淀烘干作粗多糖樣品備用。精密稱取粗多糖樣品50mg，用蒸餾水溶解，并定容于50mL容量瓶中，制成一定濃度的多糖儲(chǔ)備液，備用。精密量取多糖儲(chǔ)備液2mL于25mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，備用。

2.4多糖檢測(cè)方法研究

2.4.1苯酚-硫酸法 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，在旋渦混合器上混勻，小心加入濃硫酸10mL，在旋渦混合器上小心混勻，置沸水浴中2min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白參比，在200～800nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)[10]。

準(zhǔn)確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.1方法測(cè)定吸光度值(A)。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.4.2蒽酮-硫酸法 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6mL，在旋渦混合器上混勻，沸水浴加熱10min，取出，在流水中冷卻20min。以蒸餾水為空白參比，在400～900nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)[10]。

準(zhǔn)確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.2方法測(cè)定吸光度值(A)。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2.4.3堿性酒石酸銅滴定法 精密量取供試品溶液1.5mL于10mL離心管中，加入15mL濃鹽酸，沸水浴加熱2h，冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8～7.2，移至200mL容量瓶中，加水定容，濾紙濾過，濾液作為待測(cè)液備用。

標(biāo)定堿性酒石酸銅液：用定量移液管吸取堿性酒石酸銅液甲、乙各5mL于150mL錐形瓶中，加10mL蒸餾水及數(shù)粒玻璃珠。用滴定管加入9.0mL葡萄糖對(duì)照品溶液于錐形瓶中，并將錐形瓶放在電爐上于2min內(nèi)加熱至沸騰，并保持微沸狀態(tài)。用葡萄糖對(duì)照品溶液滴定溶液至藍(lán)色剛褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖對(duì)照品溶液的體積。平行3次，取平均值[10]。

供試品溶液測(cè)定：按2.4.3方法，用供試品溶液滴定終點(diǎn)。平行3次，取平均值。

2.4.4多糖含量檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 多糖含量檢測(cè)結(jié)果

2.4.5 檢測(cè)方法重復(fù)性研究 按上述方法測(cè)定供試品溶液多糖含量，分別重復(fù)測(cè)定6次。3種檢測(cè)方法RSD值見表2。

表2 檢測(cè)方法重復(fù)性

由以上的結(jié)果可知苯酚-硫酸法準(zhǔn)確率高，穩(wěn)定可行，因此以下研究選擇苯酚-硫酸法作為人參多糖的檢測(cè)方法。

2.5苯酚-硫酸法方法學(xué)研究

2.5.1人參多糖最大吸收波長(zhǎng)的選擇 精密量取供試品溶液2mL于25mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，在旋渦混合器上混勻，小心加入濃硫酸10mL，在旋渦混合器上混勻，置沸水浴中2min，冷卻至室溫。以蒸餾水為空白參比，在200～800nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為486nm。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(分別相當(dāng)于葡萄糖0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg)置于25mL比色管中，加水至2.0mL，按2.4.1項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值(A)。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y=5.1159X+0.0068，r=0.9994。結(jié)果表明，葡萄糖進(jìn)樣濃度在9.422～99.924μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.5.3精密度試驗(yàn) 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.80mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測(cè)定A值，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果A值的RSD為0.978%，表明該方法精密度良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測(cè)定A值，每隔10min測(cè)定一次，測(cè)定2h。然后每隔20min測(cè)定一次，測(cè)定2h。再每隔30min測(cè)定一次，測(cè)定2h。結(jié)果A值RSD為0.952%，表明供試品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5重復(fù)性試驗(yàn) 取一批樣品，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1.0 mL于具塞試管中，按苯酚-硫酸法測(cè)定A值，結(jié)果A值的RSD為1.984%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取0.5 mL葡萄糖對(duì)照品溶液，加入0.5 mL供試樣品溶液，平行6份，按苯酚-硫酸法測(cè)定A值，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為101.34%，RSD值為1.638%[11]。

3 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝

3.1試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

以多糖提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)3個(gè)因數(shù)進(jìn)行考察。因素水平見表3。

表3 L9(34)因素水平表

3.2樣品溶液制備

取9份經(jīng)過預(yù)處理的人參藥渣，每份50g，按正交設(shè)計(jì)方案提取，過濾，濾液濃縮，加無水乙醇調(diào)濃度至80%，4℃冷藏靜置4h，離心，棄去上清液，沉淀，用蒸餾水溶解，定容，備用。

3.3樣品溶液含量測(cè)定

吸取上述溶液稀釋至合適濃度，按苯酚-硫酸法測(cè)定A值，計(jì)算多糖提取率。正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19；F0.01(2，2)=99；P<0.05。

由表4可知各因素對(duì)多糖提取率的影響排序?yàn)镃>A>B。由表5方差分析可知3個(gè)因素中提取次數(shù)(C)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)合實(shí)際情況確定最佳提取條件為A3B1C3，即12倍加水量，每次提取1 h，提取3次。

3.4最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批平行樣品，按最佳工藝提取，測(cè)定多糖含量，計(jì)算提取率，結(jié)果見表6，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表6 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

人參多糖的檢測(cè)方法很多，過去研究多為某單一方法的研究，并未對(duì)幾種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比研究，對(duì)人參藥材醇提后水提的多糖是否適用也沒有研究。本試驗(yàn)對(duì)苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、堿性酒石酸銅滴定法3種方法進(jìn)行對(duì)比研究，優(yōu)選出最佳的方法，并對(duì)選擇的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，確定其適用于醇提后人參藥渣水提的多糖檢測(cè)。

人參糖類物質(zhì)成分復(fù)雜，有單糖、低聚糖和多糖，經(jīng)乙醇沉淀純化的多糖是可溶于水、不溶于醇的極性大分子化合物。蒽酮-硫酸法準(zhǔn)確率高，但對(duì)純化過程要求高，重復(fù)性較差；堿性酒石酸銅滴定法需要將大分子多糖酸解成單糖標(biāo)定，對(duì)操作過程要求高，準(zhǔn)確率與重復(fù)性都不足；苯酚-硫酸法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高、重復(fù)性良好，是檢測(cè)多糖優(yōu)選的方法。

本試驗(yàn)以經(jīng)過70%乙醇水溶液提取3次，每次3h，然后烘干的人參為樣品，通過正交試驗(yàn)考察，得到人參經(jīng)過醇提后多糖水提的最佳工藝：加水量為12倍，每次提取時(shí)間為1h，提取3次。在最佳提取條件下，人參多糖的提取率約為8.35%，充分提取了人參藥材的多糖，提高了人參藥材的利用率。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 鄭宏鈞，詹亞華.現(xiàn)代中藥材鑒別手冊(cè)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001.

[3] 馬肅，王北辰，呂俊華，等.人參莖葉皂苷對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，1991，7(2)：126-128.

[4] 何道同，王兵，陳珺明，等.人參皂苷藥理作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(7)：118-121.

[5] 宋衛(wèi)崗，郭實(shí)士，易有年.人參多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，16(2)：107.

[6] 南敏倫，趙昱瑋，呂娜，等.人參多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其降血糖活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2014，25(17)：4506-4508.

[7] 潘延啟，文全泰，黃禮德，等.土人參多糖的抗氧化活性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(1)：30-31.

[8]HanY，SonS，AkhalaiaM，etal.Modulationofradiation-induceddisturbancesofantioxidantdefensesystemsbyginsan[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2005，2(4)：529.

[9] 宋利華，蕭偉，鹿麗麗，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選人參多糖的提取工藝[J].中草藥，2012，2(43)：283-287.

[10] 白鴻.保健食品功效成分檢測(cè)方法[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2011.

[11] 王丹，呂永磊，徐麗媛，等.人參多糖含量測(cè)定方法研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(4)：774-776.

OptimizationofDetectionMethodandExtractionTechnologyofGinsengPolysaccharides

XIAOZhiwei1，LEZhiyong2，ZHUGuoxue3，LIANGShengwang1*

(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity，KeyLaboratoryofDigitalQualityEvaluationTechniqueofTraditionalChineseMedicine(TCM)，StateAdministrationof(TCM)，Guangzhou510006，China；2.BeijingKangmeiPharmaceuticalResearchInstituteCo.Ltd，Beijing102629，China；3.GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To optimize the detection method and extraction technology of ginseng polysaccharides.Methods：The ginseng polysaccharide detection method was optimized by comparing the results of several detection methods.The extraction technology of polysaccharide fromPanaxginsengwas optimized by orthogonal test with amount of water，extraction time and extraction times as factors and with the content of polysaccharide as index.Results：The best detection method of ginseng polysaccharides was the method of phenol vitriol，the optimal condition of extraction technology was as following：12-folds water，extraction time of1.0h，extraction times of three times.Conclusion：The method of phenol vitriol is high accuracy and the extraction technology is simple，stable and practical with high extraction rate.

Polysaccharide detection；ginseng polysaccharide；water-extraction technology；orthogonal test

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.015

2015-10-20)

*

梁生旺，教授，研究方向：中藥質(zhì)量控制；Tel：(020)39352172，E-mail：swliang371@163.com