趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，賈曉梅，段國辰，王志康，趙慶濤

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·論著·

趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，賈曉梅，段國辰，王志康，趙慶濤

目的通過觀察復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)肺腺癌患者癌組織中CCL20和CCR6的表達情況，探討CCL20和CCR6在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選取2009年2月—2011年12月河北省人民醫(yī)院收治的肺腺癌患者162例，根據(jù)隨訪期間的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況分為復(fù)發(fā)組(n=50)和非復(fù)發(fā)組(n=112)。采用免疫組織化學(xué)染色檢測CCL20和CCR6的表達；采用實時熒光定量PCR檢測CCL20、CCR6 mRNA的表達，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測CCL20、CCR6蛋白的表達。結(jié)果CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)，CCR6在肺腺癌組織中主要表達于細胞質(zhì)，二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達。復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6高表達率〔CCL20：38(76.0%)比9(8.0%)；CCR6：33(66.0%)比7(6.3%)〕和染色指數(shù)〔CCL20：(150.4±10.2)比(62.5±8.5)；CCR6：(134.4±11.3)比(58.0±9.5)〕均高于非復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6 mRNA表達較非復(fù)發(fā)組分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達較非復(fù)發(fā)組分別增加292.0%、188.0%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CCL20和CCR6在肺腺癌組織中呈高表達，且與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

肺腫瘤；趨化因子CCL20；受體，CCR6；復(fù)發(fā)；腫瘤轉(zhuǎn)移

張霄鵬，胡志娟，孟愛宏，等.趨化因子CCL20及其受體CCR6在肺腺癌組織中的表達及與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(25)：3065-3068,3073.[www.chinagp.net]

ZHANG X P,HU Z J,MENG A H,et al.Expression of chemokine CCL20 and its receptor CCR6 in lung adenocarcinoma and their relationship with recurrence or metastasis[J].Chinese General Practice，2016，19(25)：3065-3068,3073.

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的首位原因[1]。趨化因子主要調(diào)節(jié)體內(nèi)生理及病理情況下免疫細胞的轉(zhuǎn)移，通過激活G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體發(fā)揮作用[2]。不同的免疫細胞亞型表達特定的趨化因子受體，在靶器官中引導(dǎo)免疫細胞轉(zhuǎn)移、滯留及發(fā)揮功能[3]。多種腫瘤細胞表達趨化因子和趨化因子受體[4]。通過激活趨化因子/趨化因子受體軸，誘導(dǎo)自分泌和旁分泌環(huán)的形成，促進腫瘤的生長、血管生成，破壞抗腫瘤的免疫反應(yīng)[4-5]。例如，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4對腫瘤的擴散、部位特異性轉(zhuǎn)移以及患者存活起重要調(diào)節(jié)作用[4,6]。本研究通過觀察肺腺癌組織趨化因子CCL20及其受體CCR6的表達和定位，進一步探討CCL20及CCR6在非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)病中的作用以及與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2009年2月—2011年12月河北省人民醫(yī)院收治的肺腺癌患者162例。納入標準：(1)根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期系統(tǒng)進行術(shù)前及術(shù)后的組織病理分析[7]，術(shù)前評估為TNMⅠ或Ⅱ期，術(shù)后病理證實為腺癌；(2)均采用胸腔鏡肺癌根治術(shù)；(3)隨訪2年。排除標準：不愿合作者。根據(jù)隨訪期間的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況分為復(fù)發(fā)組(n=50)和非復(fù)發(fā)組(n=112)。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，患者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1手術(shù)方法及肺組織標本采集所有患者采用雙腔氣管插管和單肺通氣，常規(guī)全身麻醉。采用胸腔鏡肺癌根治術(shù)，根據(jù)病變的部位、性質(zhì)和手術(shù)方式進行體位選擇。通常采用側(cè)臥位，分別在腋中線第7或第8肋間，腋前線第4或第5肋間，以及肩胛下線第8或第9肋間做切口以插入胸腔鏡手術(shù)器械。標本袋收集病變樣本，移出胸腔。操作器械退出胸膜腔后縫合切口，然后經(jīng)一個原來的套管將胸腔引流管引出并固定于皮膚上，接水封瓶引流和進行肺的復(fù)張。部分病變肺組織以10%甲醛溶液固定；其余病變肺組織迅速放入液氮，并轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

1.2.2肺腺癌組織CCL20、CCR6免疫組織化學(xué)染色10%甲醛溶液固定，石蠟包埋的肺腺癌組織切片厚約4 μm。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，熱修復(fù)140 ℃，2 min；3%過氧化氫去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次；滴加鼠抗人CCL20單克隆抗體或鼠抗人CCR6單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗2 min×3次；依次滴加聚合物輔助劑和辣根酶標記的兔抗IgG工作液，37 ℃孵育20 min，每步后均進行PBS沖洗，2 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、樹膠封固鏡檢。PBS替代一抗作陰性對照。

1.2.3肺腺癌組織CCL20、CCR6免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評價由2名有經(jīng)驗的病理醫(yī)生采用雙盲法評價組織切片CCL20和CCR6陽性腫瘤細胞比例和染色強度，評分均為0～3分，其中0～25%腫瘤細胞染色陽性為0分；26%～50%腫瘤細胞染色陽性為1分；51%～75%腫瘤細胞染色陽性為2分；76%～100%腫瘤細胞染色陽性為3分；趨化因子或其受體高表達的定義為50%以上的腫瘤細胞染色陽性；不著色，陰性為0分；淡黃色，弱陽性為1分；棕黃色，陽性為2分；棕褐色，強陽性為3分。每個標本計算染色指數(shù)：染色指數(shù)=染色強度×陽性腫瘤細胞比例/100%。

1.2.4肺腺癌組織CCL20、CCR6 mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測引物設(shè)計使用Primers軟件，CCL20引物序列上游：5′-ATGTGCTGTACCAAGAGTTT-3′，下游：5′-CAAGTCTGTTTTGGATTTGC-3′；CCR6引物序列上游：5′-CCATTCTGGGCAGTGAGTCA-3′，下游：5′-AGCAGCATCCCGCAGTTAA-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列上游：5′-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 5 min，然后3步反應(yīng)：95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35個循環(huán)，于每個循環(huán)的第3步(即72℃ 30 s)收集熒光信號。擴增完畢后，進入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ)，將RQ用于統(tǒng)計分析。

1.2.5肺腺癌組織CCL20、CCR6蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測提取肺腺癌組織總蛋白，測定總蛋白水平，上樣蛋白總量為50 μg，以3%十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液定容于等體積，加入5×上樣緩沖液，常溫下聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，4 ℃電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)孵育相應(yīng)一抗(1∶200)和二抗(1∶5 000)，然后化學(xué)發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件分析Western blot圖片，以目的蛋白與內(nèi)參吸光度比值進行半定量分析。

2　結(jié)果

2.1兩組CCL20、CCR6表達情況CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)，CCR6在肺腺癌組織主要表達于細胞質(zhì)；二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達(見圖1)。復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6陽性腫瘤細胞比例評分的總分分別為109、96分，非復(fù)發(fā)組分別為44、42分(見表1)；復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6染色強度評分的總分分別為138、140分；非復(fù)發(fā)組分別為142、138分(見表2)。

表1　兩組CCL20、CCR6陽性腫瘤細胞比例評分分布情況〔n(分)〕

表2　兩組CCL20、CCR6染色強度評分分布情況〔n(分)〕

2.2兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數(shù)比較兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3兩組CCL20、CCR6 mRNA和蛋白表達比較復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6 mRNA表達較非復(fù)發(fā)組分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達較非復(fù)發(fā)組分別增加292.0%、188.0%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

3　討論

近年來，肺癌已成為世界癌癥相關(guān)死亡的首位原因。據(jù)估計，2010年，僅在美國，肺癌的新增病例為222 000人，死亡病例為157 000人[8]。腺癌常表現(xiàn)為周圍型肺實質(zhì)腫塊。顯微鏡下可見到腺癌由新生的立方和柱狀細胞構(gòu)成，傾向于形成有纖維基質(zhì)支持的腺樣結(jié)構(gòu)。細胞核可變大或不規(guī)則，含有明顯的核仁，胞質(zhì)中可見黏蛋白。腺癌傾向于氣管外生長，但也可循肺泡壁蔓延，常在肺邊緣部形成直徑為2～4 cm的腫塊。腺癌早期即可侵犯血管、淋巴管，常在原發(fā)癌引起癥狀前即已轉(zhuǎn)移，易轉(zhuǎn)移至肝、腦和骨，更易累及胸膜而引起胸腔積液[9]。

表3　兩組CCL20、CCR6高表達率和染色指數(shù)比較

注：a為t值

表4　兩組CCL20、CCR6 mRNA和蛋白表達比較

注：A為CCL20在肺腺癌組織中的表達情況；B為CCL20在癌旁組織中的表達情況；C為CCR6在肺腺癌組織中的表達情況；D為CCR6在癌旁組織中的表達情況

趨化因子組成趨化細胞因子家族，在生理狀態(tài)及炎性狀態(tài)下，趨化全身白細胞的遷移，參與血管的生成、胚胎的發(fā)育、自身免疫以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[10]。BABA等[11]首先確定CCL20為GPR-CY4的高度選擇性和功能性激動劑，然后按照趨化因子受體的命名法將此受體命名為CC趨化因子受體6或CCR6。經(jīng)典鈣動員和/或CCR6轉(zhuǎn)染細胞系的遷移實驗一致表明CCL20趨化因子的唯一受體是CCR6，且CCL20無法引發(fā)其他已知的趨化因子受體的生物應(yīng)答[11]。趨化因子及其受體在多種細胞中表達，其中包括白細胞和腫瘤細胞[12]。一些癌細胞或腫瘤相關(guān)的白細胞產(chǎn)生的趨化因子是腫瘤細胞的生長因子。趨化因子也能通過吸引內(nèi)皮細胞使血管再生或通過影響癌細胞的運動或遷移促進腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，CCL20在肺腺癌組織中主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)，CCR6在肺腺癌組織中主要表達于細胞質(zhì)，二者在肺腺癌癌旁組織中均無明顯表達；復(fù)發(fā)組CCL20、CCR6高表達率和染色指數(shù)均明顯高于非復(fù)發(fā)組；與非復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組肺腺癌組織中CCL20、CCR6 mRNA表達分別增加82.3%、56.4%，CCL20、CCR6蛋白表達分別增加292.0%、188.0%。

以往在其他惡性腫瘤的研究中，也發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞CCL20及CCR6表達增加。對人胰腺導(dǎo)管腺癌組織的諾瑟雜交分析顯示，與正常胰腺組織相比，惡變組織中CCL20的轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)[13]。原位雜交顯示，導(dǎo)管樣癌細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞在體外均來源于CCL20 mRNA。而且胰腺腫瘤細胞系不僅表達了CCL20的轉(zhuǎn)錄，同時表達了其特異性受體CCR6的轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，乳腺癌腫瘤細胞有CCL20 mRNA及蛋白的強烈表達[14]。RUBIE等[15]也研究了肝細胞癌中CCL19、CCL20、CCL21、CXCL12及其受體的表達，發(fā)現(xiàn)所有趨化因子在正常肝臟和肝細胞癌組織中均有表達，而CCL20是肝細胞癌組織中唯一表達明顯上調(diào)的趨化因子。在肝細胞癌組織中唯一明顯上調(diào)的趨化因子受體是CCR6。CHANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌腫瘤細胞中CCL20過表達，與正常對照、完全緩解和長期無病患者比較，未治療的、復(fù)發(fā)的和遠處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血清CCL20水平明顯升高。在以有效的自分泌和旁分泌環(huán)為基礎(chǔ)的前提下，結(jié)直腸癌腫瘤細胞以非極性的方式同時表達CCL20和CCR6，與正常結(jié)腸黏膜比較，結(jié)直腸癌黏膜CCR6表達上調(diào)，其相應(yīng)的CCL20表達也上調(diào)[17]。KIRSHBERG等[18]研究了CCL20/CCR6/白介素17(IL-17)在NSCLC生長中的特異性作用，結(jié)果顯示CCL20在77.5%的腫瘤患者中高表達，CCR6在16.5%的腫瘤患者中高表達，CCR6的高表達與短的無病存活相關(guān)，與疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險獨立相關(guān)；CCL20刺激后癌細胞的克隆形成能力增加，這一效應(yīng)部分依賴于ERK磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；在NSCLC患者中有IL-17表達，IL-17增加了癌細胞產(chǎn)生CCL20；CCL20/CCR6促進了NSCLC疾病的進展，CCR6被認為是潛在的新的預(yù)后標志物，CCL20/CCR6/IL-17軸是潛在的新的治療靶點。

綜上所述，肺腺癌組織中有CCL20和CCR6的高表達。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者CCL20和CCR6表達比例更高，且CCL20、CCR6 mRNA和蛋白的表達明顯增加。肺腺癌的發(fā)生發(fā)展可能與CCL20及CCR6高表達介導(dǎo)的腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。進一步研究其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能為肺腺癌的治療提供新的靶點。

作者貢獻：張霄鵬負責(zé)全面工作；胡志娟負責(zé)論文撰寫；孟愛宏負責(zé)篩選患者入組；賈曉梅負責(zé)資料收集；段國辰、王志康、趙慶濤負責(zé)完成手術(shù)臨床操作。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Expression of Chemokine CCL20 and Its Receptor CCR6 in Lung Adenocarcinoma and Their Relationship with Recurrence or Metastasis

ZHANGXiao-peng,HUZhi-juan,MENGAi-hong,JIAXiao-mei,DUANGuo-chen,WANGZhi-kang,ZHAOQing-tao.DepartmentofThoracicSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China

Correspondingauthor:ZHANGXiao-peng,DepartmentofThoracicSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China；E-mail:13931115929@163.com

ObjectiveTo observe the expression status of CCL20 and CCR6 in cancer tissue of patients with recurrent and non-recurrent lung adenocarcinoma and explore the effects of CCL20 and CCR6 in the development of the disease.Methods162 lung adenocarcinoma patients who received treatment in Hebei General Hospital from February 2009 to December 2011 were selected.The patients were divided into recurrent group(n=50) and non-recurrent group(n=112) according to their recurrence and metastasis conditions.The expression,the mRNA expression and the protein expression of CCL20 and CCR6 were detected by immunohistochemistry staining,real-time PCR and Western-blot method respectively.ResultsCCL20 was mainly expressed in cell membrane and cytoplasm of lung adenocarcinoma tissue,while CCR6 expressed in cytoplasm of lung adenocarcinoma tissue.The two had no significant expression in para-carcinoma tissue of lung adenocarcinoma.The high-expression ratio and the staining index of CCL20 and CCR6 in recurrent group was significantly higher than those of the non-recurrent group(P<0.05).The high-expression ratio of CCL20 and of CCR6 between recurrent and non-recurrent group were 38(76.0%) to 9(8.0%) and 33(66.0%) to 7(6.3%) separately;and the staining index of CCL20 and CCR6 between the two groups were(150.4±10.2) to(62.5±8.5) and(134.4±11.3) to(58.0±9.5) respectively.Compared with non-recurrent group,the mRNA expression of CCL20 and CCR6 in recurrent group increased by 82.3% and 56.4% respectively,the protein expression of CCL20 and CCR6 increased by 292.0% and 188.0% respectively,showing significant differences(P<0.05).ConclusionPresenting high expression in lung adenocarcinoma tissue,CCL20 and CCR6 are related with the development of lung adenocarcinoma.

Lung neoplasms;Chemokine CCL20;Receptors,CCR6;Recurrence;Neoplasm metastasis

050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院胸外科(張霄鵬，段國辰，王志康，趙慶濤)，腎內(nèi)科(胡志娟)，門診部(賈曉梅)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科(孟愛宏)

張霄鵬，050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院胸外科；E-mail:13931115929@163.com

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.25.013

2016-04-12；

2016-06-18)