苦參堿對人角膜成纖維細胞細胞周期和凋亡的影響

鄧 珍袁滿紅周珍華劉洪偉（.浙江省杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 00；.南華大學附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽 400；.天津市第四中心醫(yī)院，天津 0040；4.重慶市中醫(yī)院，重慶 4000）

·實驗報告·

苦參堿對人角膜成纖維細胞細胞周期和凋亡的影響

鄧 珍1袁滿紅2周珍華3劉洪偉4△
（1.浙江省杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 311100；2.南華大學附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽 421001；3.天津市第四中心醫(yī)院，天津 300140；4.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的 觀察苦參堿對體外培養(yǎng)的人角膜成纖維細胞周期和凋亡的影響。方法 將分離培養(yǎng)的人角膜成纖維細胞（HCFs）純化后，用不同濃度的Mat干預培養(yǎng)的HCFs的生長，并以0.1%地塞米松作為對照，在干預48 h后用流式細胞儀（FCM）檢測細胞周期和細胞凋亡。結果 Mat在80 mg/L以下的藥物濃度處理HCFs 48 h后，未引起其明顯的凋亡率的改變，并能使其細胞周期阻滯于G2/M期。而160 mg/L以上的藥物濃度處理HCFs 48 h后，引起明顯的細胞凋亡。結論 Mat在80 mg/L以下的濃度范圍內，既能阻滯HCFs的細胞周期，又不增加其凋亡的發(fā)生率。

苦參堿 角膜成纖維細胞 細胞周期 凋亡

苦參堿（Matrine）是從豆科槐屬植物苦豆子、苦參等中分離得到的生物堿，屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物，具有多方面的藥理活性和臨床功能［1-6］。苦參型生物堿的主要活性成分為C15H24N2O［7-8］，其功效豐富，但最重要的是其抗成纖維細胞增殖作用。激光角膜屈光性手術治療屈光不正，已經讓接受治療的近視患者獲得了較為滿意的裸眼視力，但是仍有患者會因為haze的出現(xiàn)而影響視力。研究表明，基質成纖維細胞的過度增殖是引發(fā)角膜屈光性手術后haze和屈光回退的原因［9］。

因此，有效地抑制成纖維細胞增殖的藥物無疑將會改善激光角膜屈光手術的預后，讓患者獲得更大的滿意度。目前應用于激光角膜屈光手術后抗增殖的藥物最常見的是糖皮質激素，但是由于此激素對于眼睛的不良反應，限制了其廣泛應用。隨著對苦參堿研究的深入，我們有望尋找到一種能替代糖皮質激素的抗成纖維細胞增殖安全有效的藥物?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本與試藥 南華大學附二醫(yī)院眼科角膜移植術后剩下的角膜環(huán)被用于本課題的研究 （來源是否符合醫(yī)學倫理委會員審查）?？鄥A（Mat）的標準品：中國藥品生物制品檢定所。地塞米松（Dxm）的標準品，胰蛋白酶：美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基：杭州四季青生物工程公司。鼠抗人AE1/AE3單克隆抗體、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。Ⅱ型膠原酶：武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱 （Galaxy）來自美國RSBiotech公司；流式細胞儀來自美國Bechman coulter Epics Altrag型；光學顯微鏡來自日本尼康公司；倒置相差顯微鏡來自日本奧林巴斯公司。

1.3 取材與細胞培養(yǎng) 手術無菌臺上取下角膜移植后的角膜環(huán)，應用PBS液進行三次漂洗，并且對角膜上皮及內皮進行多次刮除，置于0.25%胰酶溶液，在4℃冰箱消化過夜后，將角膜用剪刀剪碎成約1 mm見方的小塊，置于2 g/LⅡ型膠原酶溶液中，放置于37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內消化4 h，等剪碎的角膜組織塊消化后，低速離心（800 r/min，10 min），應用PBS進行1次漂洗加入DMEM培養(yǎng)基 （含胎牛血清20%，青霉素、鏈霉素均為100 μmol/mL，pH值7.2～7.4），吹打均勻后將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每3日換培養(yǎng)液1次。

1.4 設計分組 陰性對照組：不加Mat及Dxm。陽性對照組：（Dxm）終質量濃度為1 mg/L。實驗組（Mat用藥組）：Mat終質量濃度分別為10、20、40、80、160 mg/L。

1.5 細胞周期和細胞凋亡的測定 制備單細胞懸液，將單細胞懸混液在75 mL的培養(yǎng)瓶中接種，將細胞懸液瓶放在37℃、95%濕度、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，1 d后取出，加入不同的條件培養(yǎng)基，進行2 d的培養(yǎng)后，讓其消化成單細胞懸液后離心（800 r/min，6 min），放棄上清，應用PBS進行多次清洗，而后進行離心（800 r/min，6 min），再次棄去上清，收集1×106以上的細胞，用終濃度為70%的冰乙醇進行固定，再應用4℃冰箱固定1 d，再次應用PBS漂洗3次，經0.5 g/L的RnaseA消化30 min，終質量濃度65 mg/L的碘化丙錠（PI）染色1 h后流式細胞儀測定，結果用Multicycle軟件計算細胞各時期細胞數(shù)百分比率，分析細胞周期，計算凋亡率，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s），比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HCFs的原代培養(yǎng) 膠原酶消化24 h后細胞貼壁，呈梭形，1周左右見細胞數(shù)目逐漸增多，10 d后細胞漸融合。角蛋白陽性為角膜上皮細胞，傳代3代后，所有的細胞均表現(xiàn)為角蛋白陰性，則表明成纖維細胞中沒有角膜上皮的污染。見圖1。

圖1 HCFs圖片（200倍）

2.2 Mat對HCFs周期和凋亡的影響 見表1。流式細胞儀檢測結果表明，10、20、40、80、160 mg/L Mat作用于HCFs 48 h后，與陰性對照組相比：G0/G1期的細胞數(shù)目雖稍有增加，但與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而G2/M期的細胞數(shù)目增加，S期細胞數(shù)目減少，與對照組比較均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨著Mat濃度的增加，G2/M期的細胞數(shù)目進一步增加，而S期細胞數(shù)目明顯減少，這表明Mat對HCFs的細胞周期分布具有顯著調節(jié)作用。Dxm組與陰性對照組相比，G0/G1期明顯增加，S期明顯減少差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而G2/M期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。流式細胞儀檢測結果也表明，濃度為160 mg/L 的Mat作用細胞后可以引起明顯細胞凋亡（P＜0.05），而小于 80 mg/L的濃度則差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。DNA指數(shù)（DI）在各藥物濃度組間差異未有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 Mat和Dxm對HCFs細胞周期的影響（±s）

表1 Mat和Dxm對HCFs細胞周期的影響（±s）

與Dxm組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別n S陰性對照組 3 29.13±0.65 Dxm（1 mg/） 3 15.57±0.95△Mat（10 mg/） 3 24.13±1.04*△G0/G1 G2/M 60.50±1.70 11.40±0.66 72.67±1.47△11.77±0.90 59.63±1.16*16.23±1.38*△Mat（20 mg/） 3 23.30±1.59*△60.97±2.39 15.73±1.40*△Mat（40 mg/） 3 62.13±1.91 17.60±2.59*△20.23±3.39*△Mat（80 mg/） 3 61.53±3.66 19.80±1.81*△18.67±1.15*△Mat（160 mg/） 3 64.60±3.86 23.00±1.71*△12.57±1.37*△

表2 Mat和Dxm對HCFs細胞凋亡的影響（±s）

表2 Mat和Dxm對HCFs細胞凋亡的影響（±s）

組別 n陰性對照組 3 Dxm（1 mg/） 3 Mat（10 mg/） 3 Apotosis（%） DI 1.78±0.37 1.01±0.01 1.51±0.34 1.02±0.00 1.88±0.33 1.02±0.03 Mat（20 mg/） 3 2.08±0.26 1.01±0.02 Mat（40 mg/） 3 1.99±0.28 1.01±0.03 Mat（80 mg/） 3 2.21±0.44 1.02±0.04 Mat（160 mg/） 3 8.64±1.21*△1.01±0.02

3 討 論

近年來隨著激光角膜屈光性手術技術的發(fā)展，其治療效果已經得到廣泛認同［10］。越來越多的人愿意選擇激光手術，但是術后haze的出現(xiàn)仍然是個不容忽視的問題。目前臨床上激光角膜屈光性手術后經常應用皮質類固醇，但可引起高眼壓癥、繼發(fā)性青光眼、并發(fā)性白內障的危險。為了減少這些不良反應，近年來全球對haze的發(fā)有了很多的研究［11-13］。

Wilson撰文表明，角膜的上皮損傷是造成角質膜細胞凋亡的主導原因，所以角膜愈合反應的啟動因素是角膜細胞的凋亡［14］?？傊悄こ衫w維細胞的增殖直接促成了haze的形成［15］。所以，預防激光角膜屈光性手術后haze的形成的有效方法是阻斷其增殖，從而提高手術的療效。

脫離了正常生存環(huán)境、在人體外培養(yǎng)的角膜基質成纖維細胞可以自行進行增殖，與體內不同，而與在體激活的角膜基質成纖維細胞極其相似。角膜成纖維細胞在傳代后可獲大量細胞供研究使用，通過觀察Mat對體外培養(yǎng)的人角膜纖維細胞增殖的影響，來近似地了解苦參堿應用于體內激活角膜成纖維細胞的作用，為該藥的應用提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗將10、20、40、80、160 mg/L的Mat和1 mg/L 的Dxm分別同時作用于HCFs 48 h后，用流式細胞儀分析了細胞周期和凋亡的變化，其結果顯示：1）低于160 mg/L濃度的Mat作用于HCFs 48 h后，G2/M期的細胞數(shù)目增加，S期細胞數(shù)目明顯減少，說明Mat使成纖維細胞合成DNA減少，同時還干擾有絲分裂前的準備，阻礙有絲分裂的進行。而Dxm則表現(xiàn)為G0/G1期細胞數(shù)目的增加，主要是抑制DNA的合成。2）DNA指數(shù)（DI）是衡量細胞是否為二倍體的一個指標。在正常二倍體細胞中，DI值為（1.01±0.1）。當DI＞1.1，表示細胞是異倍體；而當DI＜0.9時，則為測試誤差。由DI指數(shù)來看，上述各組濃度Mat之間均未見顯著性差異，說明160 mg/L以下的質量濃度對細胞沒有致畸變作用。3）藥物在80 mg/L以下時，對HCFs不產生明顯的凋亡，也就不會因為該細胞的過度凋亡而啟動角膜的過強愈合反應。

Haze的形成主要原因是角膜成纖維細胞的增殖，所以我們所尋找的激光角膜屈光性手術后用藥必須是能抑制該細胞增殖的藥物，但是同時卻不能引起該細胞的凋亡，因為角膜組織不同于人體其他組織，各種原因所致的角膜成纖維細胞的凋亡反過來又會啟動角膜創(chuàng)面的愈合反應，就此引起級聯(lián)反應，導致更多的角膜成纖維細胞增殖，從而影響激光角膜屈光性手術的療效。

為了解決該矛盾，我們在發(fā)現(xiàn)了苦參堿對人角膜成纖維細胞呈時間-劑量依賴性抑制增殖后，還必須要篩選出合適的藥物作用濃度，在保證藥物有效抑制增殖的同時而不誘導明顯的凋亡。但是筆者在該實驗中是對體外培養(yǎng)的人角膜成纖維細胞所做的處理，可能具體的藥物濃度還是會跟臨床用藥有所差異，故而該實驗結果還需進一步的動物實驗來完善。所以Mat是一種有可能成為極具潛力的激光角膜屈光性手術后的新型候選藥物，但其抑制增殖的機制和適宜的臨床用藥濃度還有待于更深入的研究。

［1］ 王學武.苦參堿栓劑的研制［J］.中草藥，1983，14（3）：10-12.

［2］ 王勤環(huán).慢性病毒性肝炎藥物治療新研究［J］.醫(yī)學研究通訊，2001，30（4）：8-11.

［3］ 全紅，王建明，程立華.苦參總堿貼片抗心律不齊的實驗研究［J］.中醫(yī)藥學報，2001，29（5）：46.

［4］ 魏紅，李中文.苦參堿乳膏劑的動物藥動學及生物利用度研究［J］.中國藥學雜志，2001，36（3）：183-185.

［5］ 黃潔，仵文英，席枝俠，等.苦參堿脂質體的研究制備與包封率測定［J］.醫(yī)藥導報，2008，27（1）：87-88.

［6］ 楊少武，李玲霞.國內苦參堿制劑學研究進展［J］.實用藥物與臨床，2012，15（1）：52-53.

［7］ Wang Z，Wu Y，Wang Y，et al.Matrine inhibits the invasive properties of human glioma cells by regulating epithelial to mesenchymal transition［J］.Molecular Medicine Reports，2015，11（5）：3682-3686.

［8］ Zhong-wei，Jun-kui，WANG，et al.Matrine pretreatment improves cardiac function，n rats with diabetic cardiomyopathy via suppressing ROS/TLR-4 signaling pathway［J］.中國藥理學報，2015，（3）：323-333.

［9］ Netto MV，Mohan RR，Ambrosio R Jr，et al.Wound healing in the cornea：a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy［J］.Cornea，2005，24：509-522.

［10］黃春麗，周奇志.準分子激光角膜表層屈光手術進展［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2014，11（6）：15-19.

［11］譚業(yè)雙，劉磊，李新宇.LASEK術后Haze的發(fā)病機制與防治的研究進展［J］.眼科新進展，2007，27（7）：546-548.

［12］郝小飛，袁滿紅.準分子激光角膜表層切削手術后Haze的防治［J］.西南軍醫(yī)，2011，13（2）：289-291.

［13］馬雅玲，李娜，侯力華，等.絲裂霉素C和地塞米松防治LASEK術后角膜Haze的對比實驗研究［J］.寧夏醫(yī)學雜志，2011，33（6）：490-493，577.

［14］Wilson SE，Mohan R，Hong JW，et al.The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy：elusive control of biologica lvariability and after effect on custom laser vision cirrection［J］.Arch Ophthalmol，2001，119（6）：889-896.

［15］Hollingsworth JG，Bonshek RE，Efron N.Correlation of the appearance of the keratoconic cornea in vivo by confocal microscopy and in vitro by light microscopy［J］.Cornea，2005，24 （4）：397-405.

R969 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1549-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.029

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2016-03-23）