TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、PPAR-γ的表達特點*

顧培青 沈 洪朱 磊 劉亞軍 張 露 劉軍樓 徐 藝 成家飛（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

·研究報告·

TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、PPAR-γ的表達特點*

顧培青 沈 洪△朱 磊 劉亞軍 張 露 劉軍樓 徐 藝 成家飛
（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

目的 觀察三硝基苯磺酸 （TNBS）造模后第3日、7日、10日、14日大鼠結(jié)腸組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB （NF-κB）、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）表達的變化特點。方法 造模組采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型，將大鼠分為空白組、造模后3 d組、造模后7 d組、造模后10 d組、造模后14 d組。后4組分別于造模后第3日、7日、10日、14日處死，采用免疫組化法及實時熒光定量PCR法測定各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、PPAR-γ及mRNA表達。結(jié)果 造模后3 d大鼠結(jié)腸NF-κB表達顯著上調(diào)，10 d、14 d后表達較前逐漸回落；造模后3 d大鼠結(jié)腸PPAR-γ表達明顯下調(diào)，至14 d時其表達逐漸恢復(fù)。結(jié)論 TNBS大鼠結(jié)腸炎是炎癥性腸病的良好模型，造模后結(jié)腸NF-κB表達上調(diào)，PPAR-γ表達受抑制，在造模后14 d后模型自愈較為明顯，治療的療程選擇7～10 d為宜。

三硝基苯磺酸 炎癥性腸病 核轉(zhuǎn)錄因子-κB 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ

【Abstract】Objective：To observe the expression characteristics of NF-κB and PPAR-γ in colon tissue of TNBS rats after successful modeling on 3rdday，7thday，10thday and 14thday.Methods：The models were made with TNBS/ethanol solution enema method.The rats were divided into the blank group，3 d group，7 d group，10 d group and 14 d group.The latter four groups were killed according to time.The expression of NF-κB，PPAR-γ and mRNA was detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR method.Results：3 days after modeling，NF-κB expression of rat colon was significantly up-regulated，but after 10 days and 14 days，the expression gradually declined.3 days after modeling，PPAR-γ expression of rat colon significantly reduced.Till 14thday，the expression gradually restored.Conclusion：TNBS colitis in rats is a good model of IBD.After modeling，NF-κB of colon up-regulated and PPAR-γ expression was inhibited.14 d after modeling，selfhealing of model is more obvious，and the course of treatment lasting 7 to 10 days is appropriate.

【Key words】TNBS；Inflammatory bowel disease；NF-κB；PPAR-γ

炎癥性腸?。↖BD）主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克隆氏病（CD），是一組與遺傳、環(huán)境、免疫等因素相關(guān)的慢性腸道炎癥性疾病。目前的動物模型研究多種多樣，造模方法主要有藥物學(xué)方法、免疫學(xué)方法、特定基因敲除、基因缺陷、T細胞移植等等，其中免疫模型是IBD目前研究最活躍的領(lǐng)域。三硝基苯磺酸（TNBS）作為一種半抗原，用它誘導(dǎo)的大鼠實驗性結(jié)腸炎模型是研究IBD的經(jīng)典模型。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）作為炎癥反應(yīng)的樞紐，在IBD的發(fā)病機制中被廣泛研究。近年來發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜表面免疫細胞能夠表達過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ），并通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1、NF-κB等炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［1］。其活化后參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和表皮細胞的分化，尤其與IBD的發(fā)病機制和嚴重程度密切相關(guān)［2］。本實驗觀察TNBS造模后第3、7、10、14 d大鼠結(jié)腸組織中NF-κB、PPAR-γ表達的變化特點，既是對TNBS結(jié)腸炎模型的驗證，也為進一步研究提供數(shù)據(jù)參考?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，鼠齡3～4個月，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證編號2008001652254。

1.2 試劑與儀器 5%TNBS水溶液：Sigma公司，批號PP2297；DAB顯色試劑盒（20X）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號1409030031）；KIT-9921即用型免疫組化試劑盒（鼠/兔）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號 1411249921）；Trizol（Takara公司，批號9109）；Sybr green（Toyobo公司，批號43300）ELISA試劑盒 （中國Elabscience公司），Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo公司），光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus公司），Stepone plus熒光定量PCR （美國ABI公司），ABI-Veriti型普通PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 模型復(fù)制 按完全隨機設(shè)計法將大鼠分為空白組、造模后3 d組、造模后7 d組、造模后10 d組、造模后14 d組。造模組采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型［3］。大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉；用直徑2.0 mm長12 cm的輸液管經(jīng)液體石蠟潤滑后，由大鼠肛門輕緩插入深約8.0 cm處一次性推入TNBS造模溶液 （100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL），捏緊肛門提尾倒立1 min后放回籠中自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)?？瞻捉M大鼠予上述方法等量生理鹽水灌腸。

1.4 標本采集與檢測 1）標本采集。分別于造模后3、7、10、14 d脫頸椎法處死大鼠，立即開腹迅速剖取結(jié)腸，自肛門2 cm處向上取結(jié)腸6～8 cm，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冷0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，立即進行大體形態(tài)評分。取病變最嚴重處結(jié)腸，一部分置4%甲醛中固定，石蠟包埋、切片（4 μm）、HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。另一部分立即置于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。2）大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分。評分標準：（1）腸壁炎癥的嚴重程度，記為1分、2分、3分，分別代表輕度、中度、重度炎癥；（2）病變嚴重程度（累及部位），記為1分、2分、3分，即病變位于黏膜層，黏膜和黏膜下層，或透壁性損傷；（3）隱窩損害程度，記為1分、2分、3分、4分。即1/3隱窩損害，2/3隱窩損害，隱窩缺失、表面上皮完整，隱窩和表面上皮都缺失。上述3項指標的打分再分別乘以病變區(qū)域所占比例（參與比例）為最后得分。無明顯病變記為0分，累加所有分數(shù)，得出總分。3）免疫組化法檢測腸組織NF-κB、PPAR-γ表達。切取大鼠組織，固定、常規(guī)二甲苯脫脂，梯度酒精脫水、透明、包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用3%H2O2處理阻斷內(nèi)源性過氧化酶并孵育10 min，PBS沖洗3×5 min；微波抗原修復(fù)，正常血清工作液于37℃封閉10 min，再用一抗（稀釋100倍）4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min；DAB顯色，自來水充分沖洗后、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、二甲苯透明、干燥，樹脂封片。生物顯微圖像分析系統(tǒng)（復(fù)日，F(xiàn)R-988 Smart Scape2000）攝像、標記、分析。4）實時熒光定量PCR法檢測腸組織NF-κB、PPAR-γ mRNA表達。（1）抽提總RNA：按RNAiso Reagent操作說明書提取TNBS模型大鼠結(jié)腸黏膜組織總RNA，紫外分析及電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。（2）單鏈cDNA的合成：采用Prime Script TM RTreagent Kit試劑盒，嚴格按說明書操作。各目的基因的引物序列、產(chǎn)物大小如下。GAPDH：F-GGTGTGAACCACGAGAAAT ATGAC，R-TCATGAGCCCTTCCACAATG，擴增片段長度127 bp。PPAR-γ：F-GACCTGAAGCTCCAAGAATACC，R-TTCATGTGGCCTGTTGTAGAG，擴增片段長度99 bp。NF-κB P65：F-GCTCAAGATCTGCCGAGTAAA，R-GT CCCGTGAAATACACCTCAA，擴增片段長度113 bp。（3）RT-PCR：采用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒，在ABI7300上設(shè)置檢測文件，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：95℃，10 min（1個循環(huán)），PCR反應(yīng)：95℃，5 s；60℃，1 min（40個循環(huán)）。使用Sequence Detection software version1.2.3軟件分析PCR過程中樣本的Ct（循環(huán)閾值），Ct值隨模板濃度增大而減少。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，方差分析，最小顯著差法（LSD）進行兩兩比較，雙側(cè)檢驗以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分比較 見表1。圖1。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，與空白組相比，造模后3 d大鼠結(jié)腸病理評分顯著升高 （P＜0.05）；3、7、10 d之間病理評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；14 d病理評分較3 d有明顯下降（P＜0.05），與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與造模后3 d組比較，#P＜0.05。下同。

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2.2 各組大鼠腸組織NF-κB表達的比較 見表2。圖2。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，與空白組相比，造模后3 d大鼠結(jié)腸NF-κB免疫組化IOD值明顯增高 （P＜0.05）；造模后10、14 d較3 d大鼠結(jié)腸NF-κB免疫組化IOD值有明顯降低（P＜0.05）。

2.3 各組腸組織PPAR-γ表達的比較 見表3，圖3。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，造模后3 d大鼠結(jié)腸PPAR-γ免疫組化IOD值明顯下降（P＜0.05）；造模后14 d較 3、7、10 d大鼠結(jié)腸 PPAR-γ免疫組化IOD值均有明顯增加（P＜0.05）；造模后3、7、10 d之間PPAR-γ免疫組化IOD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。14 d與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 大鼠結(jié)腸病理圖片（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB免疫組化IOD值比較（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB免疫組化IOD值比較（±s）

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圖2 大鼠結(jié)腸組織NF-κB免疫組化表達情況（200倍）

表3 大鼠結(jié)腸組織PPAR-γ免疫組化IOD值（±s）

表3 大鼠結(jié)腸組織PPAR-γ免疫組化IOD值（±s）

與造模后7 d組比較，△P＜0.05；與造模后10 d組比較，▲P＜0.05。

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圖3 大鼠結(jié)腸組織PPAR-γ免疫組化表達情況（200倍）

2.4 各組大鼠腸組織NF-κB mRNA表達的比較 見表4。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，造模后3 d NF-κB mRNA 2-ΔΔCt值明顯升高（P＜0.05）；7 d、14 d組NF-κB mRNA 2-ΔΔCt值較3 d組有降低（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腸組織PPAR-γ mRNA表達的比較見表4。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，各組間PPAR-γ mRNA 2-ΔΔCt值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腸組織NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA表達的比較（±s）

表4 各組大鼠腸組織NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA表達的比較（±s）

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3 討 論

Morris在1984年首次成功地制造出三硝基苯磺酸（TNBS）動物模型，該模型建立之初用于反映CD的病理變化及藥物療效的研究［3］。隨后，人們將其用于UC的病理研究和藥效評價［4］。該模型主要采用灌腸給予以乙醇為溶劑的TBNBS溶液，刺激結(jié)腸炎的產(chǎn)生。其機制被認為首先是乙醇破壞鼠的腸黏膜屏障，TNBS作為半抗原與體內(nèi)蛋白結(jié)合成為抗原，產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，從而誘發(fā)結(jié)腸炎癥。通過對不同劑量的TNBS引起的大鼠UC模型觀察［5］，發(fā)現(xiàn)一次性注入直腸100 mg/kg劑量下引起的結(jié)腸組織呈慢性炎癥變化，病程較長，各種炎癥介質(zhì)發(fā)生明顯變化，腸黏膜發(fā)生潰瘍、水腫、糜爛、大量的炎性細胞浸潤等組織病理學(xué)改變，與UC患者出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)和病理變化十分相似。所以學(xué)界認為100 mg/kg是本模型的最佳劑量，與國外報道相似［6-8］。TNBS（100 mg/kg）造模后，結(jié)腸炎持續(xù)約7～8周時間，急性期主要限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主；慢性期主要為淋巴細胞和漿細胞浸潤，病理改變以血管增生和組織變形為突出表現(xiàn)；急、慢性期的大致分界點為3周左右［9-10］。IBD實驗一般用其急性期，以模仿IBD活動期的特征。本實驗觀察至大鼠造模后14 d為止，觀察其急性期內(nèi)結(jié)腸組織NF-κB及PPAR-γ表達變化特征，結(jié)果顯示：造模后3 d病變累及腸壁各層，局部有多量壞死的中性粒細胞積聚，見黏膜層隱窩壞死，輪廓存留，1只隱窩輕度損傷，2只見黏膜層壞死，未見明顯炎細胞浸潤，損傷局部組織無明顯肉芽組織增生。造模后7 d多數(shù)黏膜層全部壞死，損傷局部組織有明顯肉芽組織增生。黏膜層隱窩壞死，2只隱窩中度損傷。造模后10 d組病變炎癥程度與7 d組基本相似。造模后14 d組腸壁有重度炎癥反應(yīng)，損傷局部組織有明顯肉芽組織增生，病變累及黏膜下層、肌層，見黏膜層隱窩壞死。經(jīng)單因素方差分析兩兩比較顯示，造模后3 d、7 d、10 d之間病理評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后14 d組病理評分較3 d組有明顯改善P=0.030，提示造模后14 d時大鼠結(jié)腸炎癥已趨于緩解。

NF-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位B位點發(fā)生特異性結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。NF-κB可以調(diào)控任何含有B位點的基因轉(zhuǎn)錄，包括細胞因子及其受體 （IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2R）、粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）、促進或抑制凋亡蛋白（Bcl-xL、Fsa、FasL）、急性期反應(yīng)蛋白（CRP）、趨化因子（RANTFS、MCP、MTP）、補體、生長因子、酶分子、轉(zhuǎn)錄因子等。研究表明［11］，NF-κB在UC中呈現(xiàn)過度激活狀態(tài)，并導(dǎo)致細胞因子及黏附分子等過度和持續(xù)表達，放大炎癥反應(yīng)。NF-κB在許多炎癥反應(yīng)中發(fā)揮樞紐作用，尤其是NF-κB p65亞群，它在調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵性的作用。Rogler等［12］采用特異性的p65單克隆抗體，原位證實了UC患者腸黏膜巨噬細胞和上皮細胞NF-κB p65表達比正常對照明顯增強，且其表達與炎癥的嚴重程度呈正相關(guān)。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，造模后3 d大鼠結(jié)腸NF-κB表達顯著上調(diào)，10 d、14 d后表達較前逐漸回落；實時熒光定量PCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果類似。

PPAR是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，有α、β、γ三個亞類。PPAR-γ主要在棕色和白色脂肪組織、大腸、視網(wǎng)膜以及部分免疫系統(tǒng)表達，參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性、細胞增殖以及炎癥等多項生物功能［13］。研究表明，PPAR-γ是固有免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵因子，UC活動期表達低于正常并且與UC嚴重程度成負相關(guān)［14］。5-ASA是治療UC的經(jīng)典藥物之一，實驗證實它可能通過激活PPAR-γ起治療作用［15］?，F(xiàn)在學(xué)界認為PPAR-γ的配體通過抑制NF-κB的活化，減少促炎癥細胞因子的轉(zhuǎn)錄及表達，從而下調(diào)過度的免疫反應(yīng)。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示，造模后3 d大鼠結(jié)腸PPAR-γ表達明顯受到抑制，至14 d時其表達逐漸恢復(fù)。實時熒光定量PCR檢測PPAR-γ mRNA結(jié)果各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與數(shù)據(jù)標準差較大、抽樣誤差較大有關(guān)，擴大樣本量后應(yīng)會表現(xiàn)出類似免疫組化的結(jié)果。

以上可知，觀察治療措施對TNBS模型的干預(yù)效果，其療程選擇在7～10 d為宜，療程過長，如超過14 d，則無法排除模型本身自愈的可能。

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The Expression Characteristics of NF-κB and PPAR-γ in Colon Tissue of TNBS Rats

GU Peiqing，SHEN Hong，ZHU Lei，et al.Jiangsu Hospital of TCM，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

·研究報告·

R285.5 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1461-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.002

國家自然科學(xué)基金委員會青年科學(xué)基金項目（81302919）；江蘇省中醫(yī)藥局科技項目立項計劃（LZ13048）；江蘇省中醫(yī)院高峰學(xué)術(shù)人才培養(yǎng)工程（k2014yrc13）；江蘇省中醫(yī)院院級課題（Y14076）

（電子郵箱：shenhong999@163.com）

2016-04-24）