擬南芥RabA2b互作蛋白的篩選與鑒定

冷琳娜，蔣建軍，張　弛，王學(xué)路,3，蘇　偉

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所,上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070)

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擬南芥RabA2b互作蛋白的篩選與鑒定

冷琳娜1,2，蔣建軍1,2，張弛1,2，王學(xué)路1,2,3，蘇偉1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所,上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200438；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070)

Rab蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞囊泡的運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.擬南芥中存在數(shù)量龐大的RabA亞族成員，它們參與調(diào)控植物不同階段的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程.為了尋找擬南芥RabA亞族下游的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白，進(jìn)而闡明RabA在細(xì)胞活動(dòng)中的角色，本研究選取RabA2b蛋白進(jìn)行了深入研究.本研究首先構(gòu)建過(guò)表達(dá)RabA2b的擬南芥植株，同時(shí)結(jié)合免疫共沉淀方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)到多個(gè)Hsp70蛋白家族成員與RabA2b蛋白共沉淀.為了進(jìn)一步研究Hsp70成員與RabA2b的相互關(guān)系，將5個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70s蛋白分別構(gòu)建于植物表達(dá)載體，通過(guò)在煙草葉表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Hsp70s和RabA2b發(fā)現(xiàn)它們共定位于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周?chē)慕z狀結(jié)構(gòu).同時(shí)，體外pull-down實(shí)驗(yàn)證明了5個(gè)Hsp70s蛋白都能與RabA2b蛋白直接相互作用.此外，雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)進(jìn)一步證實(shí)了Hsp70s與RabA2b在煙草葉表皮細(xì)胞中的相互作用，說(shuō)明擬南芥中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70s可以作為RabA2b的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白一同調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程.

RabA2b； Hsp70； 相互作用； 調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白

Rab蛋白家族屬于小G蛋白超家族[1]，小G蛋白是一類(lèi)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架組裝和細(xì)胞囊泡運(yùn)輸?shù)榷喾N過(guò)程[2]中發(fā)揮重要作用的分子.Rab蛋白家族成員在不同的物種之間數(shù)量差異巨大，裂殖酵母(S.pombe)中只有7個(gè)Rab蛋白.黑腹果蠅(D.melanogaster)和線蟲(chóng)(C.elegans)分別有26個(gè)和29個(gè)Rab蛋白.相比較而言，擬南芥(A.thaliana)和人類(lèi)(H.sapiens)含有較多的Rab蛋白，分別為57個(gè)和60個(gè)[3-4].可以看出，隨著生物體復(fù)雜性的增加，Rab蛋白家族成員也隨之增多，這可能是出于細(xì)胞功能特化和精細(xì)調(diào)控的需求[5].盡管數(shù)量差異巨大，Rab家族成員在不同的物種中卻非常保守，它們都在細(xì)胞質(zhì)囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌A段發(fā)揮重要作用，并且都是通過(guò)結(jié)合GTP的活性形式與結(jié)合GDP的非活性形式之間的轉(zhuǎn)換來(lái)實(shí)現(xiàn)的[6].它們?cè)诓煌锓N中的功能差異可能是因?yàn)橄掠螏椭浒l(fā)揮功能的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白不同.

在擬南芥中，根據(jù)種系發(fā)生關(guān)系，57個(gè)Rab蛋白被分為RabA～RabH 8個(gè)亞族[2]，進(jìn)一步根據(jù)氨基酸序列的相似性和保守性，每個(gè)亞族被分為不同的子類(lèi)，最終擬南芥中的Rab蛋白被分為了18個(gè)子類(lèi)，各子類(lèi)成員之間具有更相近的生物學(xué)功能、亞細(xì)胞定位以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.RabA2b屬于RabA亞族，這個(gè)亞族十分龐大，擁有26個(gè)成員，占據(jù)了整個(gè)Rab家族的近一半，然而在釀酒酵母(S.cerevisiae)中，只有Ypt31/Ypt32與之對(duì)應(yīng)[5]，由此可見(jiàn)擬南芥中特異存在的RabA亞族在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了特定且必需的功能.研究發(fā)現(xiàn)RabA亞族中的RabA2和RabA3子類(lèi)蛋白主要定位在后高爾基體(post-Golgi)的一種新結(jié)構(gòu)域上，同時(shí)參與了囊泡從反面高爾基體(trans-Golgi compartment)到細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸，并且調(diào)控了細(xì)胞板的生成[6].RabA亞族成員在調(diào)控花粉管的形態(tài)、花粉管的伸長(zhǎng)、根毛的擴(kuò)張、細(xì)胞壁的組分等方面發(fā)揮了重要的作用[7-10].除此之外，RabA亞族成員在響應(yīng)外界環(huán)境的生物脅迫[11]與非生物脅迫[12]方面也發(fā)揮著重要的功能.但是目前在擬南芥中，對(duì)于RabA亞族成員的研究?jī)H僅是通過(guò)與各種細(xì)胞器標(biāo)記蛋白進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)以及研究負(fù)顯性突變體(dominant negative mutant)的表型來(lái)描述它們?cè)谥参矬w中所發(fā)揮的功能，而關(guān)于它們的作用機(jī)制還知之甚少.為此，尋找RabA亞族的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白能夠?yàn)殛U明其功能背后的分子機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ).

熱激蛋白(Heat Shock Protein， Hsp)是一類(lèi)受外界環(huán)境條件尤其是高溫誘導(dǎo)的蛋白，它們?cè)谏矬w應(yīng)對(duì)熱和其他環(huán)境脅迫方面發(fā)揮著極其重要的作用[13-14].熱激蛋白根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量的不同可以分為Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小分子熱激蛋白(small Hsp).其中，Hsp70是一類(lèi)在原核生物和真核生物中高度保守的分子伴侶蛋白[15].通過(guò)與ATP和ADP結(jié)合的兩種狀態(tài)的Hsp70之間的相互轉(zhuǎn)換[16]以及輔助蛋白的協(xié)助[17-18]，Hsp70能夠促進(jìn)細(xì)胞新合成蛋白質(zhì)的折疊、組裝，變性蛋白的重新折疊、組裝，蛋白聚集體的降解[19-20]以及前體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)[21].

在擬南芥中至少有17個(gè)Hsp70蛋白家族成員，其中包含了13個(gè)DnaK亞族成員和4個(gè)Hsp110/SSE亞族成員.根據(jù)蛋白質(zhì)序列分析可以把DnaK亞族成員分為4個(gè)子類(lèi).Hsp70-1至Hsp70-5(也稱(chēng)為Hsc70-1至Hsc70-3、Hsp70、Hsp70b)被預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，Hsp70-6至Hsp70-8(也稱(chēng)為cpHsp70s)定位于質(zhì)體中，Hsp70-9和Hsp70-10(也稱(chēng)為mtHsp70s)定位在線粒體中，Hsp70-11至Hsp70-13位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(也稱(chēng)為BiPs)[22-23].在擬南芥中，通過(guò)RNA干擾、過(guò)表達(dá)等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)Hsp70蛋白家族成員能夠影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程、植株形態(tài)和對(duì)外界環(huán)境的生物與非生物脅迫的響應(yīng)[24-26].除此之外，Hsp70蛋白在調(diào)控前體蛋白的降解[27]、細(xì)胞分裂過(guò)程[24]以及胚胎發(fā)育過(guò)程[27]中也發(fā)揮了重要的作用.

在擬南芥中，相對(duì)于RabA的其他子類(lèi)來(lái)說(shuō)，RabA2的研究較多，我們選取RabA2子類(lèi)中的RabA2b作為研究對(duì)象來(lái)篩選和鑒定它可能存在的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白.

1　材料與方法

1.1材料與試劑

擬南芥(Arabidopsisthaliana)： Col-0，煙草(Nicotianabenthamiana)，轉(zhuǎn)Hsp70-1-GFP、Hsp70-2-GFP、Hsp70-3-GFP、Hsp70-4-GFP、Hsp70-5-GFP、RabA2b-FLAG基因擬南芥，大腸桿菌克隆菌株EscherichiacoliDH5α，大腸桿菌表達(dá)菌株E.coliTransetta，根瘤農(nóng)桿菌菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101，煙草瞬時(shí)表達(dá)載體pCAMBIA-1302、pCAMBIA-mCherry、pXY104和pXY106，大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pMAL-c2X和pET-42a，這些材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基)： 2.2g/L MS粉，0.8%瓊脂粉，pH5.6～6.0，向其中添加潮霉素用于抗性篩選.大腸桿菌和農(nóng)桿菌完全培養(yǎng)基LB： 1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，向其中添加100μg/mL卡那霉素或100μg/mL氨芐青霉素或100μg/mL大觀霉素或50μg/mL慶大霉素或25μg/mL 利福平用于抗性篩選.細(xì)菌培養(yǎng)基中加入1%瓊脂粉即配制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基.

1.2方法

1.2.1植物材料和生長(zhǎng)條件

將干燥的擬南芥種子用75%(體積比)的酒精表面滅菌10min之后換用100%的酒精浸泡10min，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，4℃春化3d后，置于長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)(23℃，16h光照/8h黑暗).本研究中，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的植物材料為在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)10d的植物幼苗.用于觀察擬南芥根尖細(xì)胞中Hsp70-1、Hsp70-2、Hsp70-3、Hsp70-4、Hsp70-5亞細(xì)胞定位的植物材料為長(zhǎng)日照條件下豎直培養(yǎng)5d的植物幼苗，用于BiFC實(shí)驗(yàn)的煙草植株在長(zhǎng)光照條件下培養(yǎng)(28℃，16h光照/8h黑暗).

1.2.2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)10d大約2g的35S∶∶RabA2b-FLAG幼苗，用液氮進(jìn)行充分研磨后，加入等體積的植物蛋白提取緩沖液(Tris-HCI pH7.5 100mmol/L,NaCl 300mmol/L,EDTA 2mmol/L,Glycerol 10%, Triton X-100 1%)和適量蛋白酶抑制劑，振蕩混勻后，在靜音混合器上4℃孵育1h，12000r/min 4℃離心10min，取上清，重復(fù)離心1次，移取上清至裝有適量已經(jīng)用植物蛋白提取緩沖液預(yù)先洗過(guò)3遍的FLAG樹(shù)脂(Sigma)的EP管中，在靜音混合器上4℃孵育3h, 2000r/min 4℃離心2min，去上清，用植物蛋白提取緩沖液清洗5遍，加等量2×蛋白上樣緩沖液，95℃ 10min, 12000r/min離心2min,取100μL 上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待蛋白預(yù)染maker中代表175kDa的條帶剛剛進(jìn)入分離膠時(shí)切下溴酚藍(lán)上面的膠塊送樣至復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)平臺(tái)進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析.

1.2.3基因和氨基酸序列分析

在TAIR網(wǎng)站(http：∥www.arabidopsis.org/)上查找相關(guān)基因序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列.用Clustal X2.1軟件進(jìn)行Hsp70-1到Hsp70-5的氨基酸序列比對(duì).用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).

1.2.4蛋白質(zhì)共定位實(shí)驗(yàn)及BiFC實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pXY104-Hsp70-1至pXY104-Hsp70-5、pXY106-RabA2b、空載體pXY104和pXY106、pCAMBIA-1302-Hsp70-1至pCAMBIA-1302-Hsp70-5、pCAMBIA-mCherry-RabA2b分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，擴(kuò)大培養(yǎng)相應(yīng)的農(nóng)桿菌，收獲菌體.用煙草轉(zhuǎn)化緩沖液將菌體懸起后分組混合至每種農(nóng)桿菌的OD600=1時(shí)注射到煙草葉片中，黑暗培養(yǎng)16h后，在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)2d，用Leica SP8熒光共聚焦顯微鏡觀察相應(yīng)的熒光信號(hào).

1.2.5MBP-RabA2b與GST-Hsp70-1至GST-Hsp70-5重組蛋白的體外表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET-42a-Hsp70-1、pET-42a-Hsp70-2、pET-42a-Hsp70-3、pET-42a-Hsp70-4、pET-42a-Hsp70-5、pMAL-c2X-RabA2b和空載體pMAL-c2X分別轉(zhuǎn)化至E.coliTransetta菌株中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)相應(yīng)的大腸桿菌表達(dá)菌株約4mL，然后擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約為1時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，25℃培養(yǎng)5h收集菌體.向菌體中加入與融合標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的適量的蛋白結(jié)合緩沖液，加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL，每隔5min振蕩一次，其余時(shí)間置于冰上以保證低溫環(huán)境，振蕩懸浮充分后超聲破碎10min，超聲條件為超4s停10s.超聲破碎結(jié)束后，12000r/min 4℃離心10min，取上清，重復(fù)離心1次，分別移取上清至裝有已經(jīng)用結(jié)合緩沖液預(yù)先清洗3次的GST樹(shù)脂(購(gòu)買(mǎi)于金斯瑞生物科技有限公司)和MBP樹(shù)脂(購(gòu)買(mǎi)于紐英倫生物技術(shù)有限公司)的EP管中，在靜音混合器中4℃孵育3h，2000r/min 4℃離心2min，去上清，用蛋白結(jié)合緩沖液清洗珠子5～6遍，去上清.分別加入與標(biāo)簽蛋白相對(duì)應(yīng)的洗脫緩沖液300μL，在靜音混合器中4℃孵育30min，2000r/min 4℃離心2min，取上清分裝后在-80℃保存.

1.2.6體外Pull-down實(shí)驗(yàn)

將純化好的適量等量的GST-Hsp70-1至GST-Hsp70-5融合蛋白分別加入分裝有預(yù)先用蛋白結(jié)合緩沖液清洗3遍的GST樹(shù)脂的EP管中，在靜音混合器中4℃孵育2h，2000r/min 4℃離心2min，去上清，用蛋白結(jié)合緩沖液清洗2遍，分別加入適量的MBP-RabA2b融合蛋白以及適當(dāng)過(guò)量的MBP蛋白，4℃ 孵育2h，2000r/min 4℃離心2min，去上清，用蛋白結(jié)合緩沖液洗6～8遍，加入適量的5×蛋白上樣緩沖液，95℃ 10min，12000r/min離心2min，取適量上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在Western blot之后分別用MBP抗體和GST抗體檢測(cè)MBP標(biāo)簽信號(hào)的存在和樣品的上樣量.

2　結(jié)果與分析

2.1RabA2b相互作用蛋白Hsp70s的發(fā)現(xiàn)

為了找到擬南芥RabA亞族下游的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白，我們選取RabA2b蛋白進(jìn)行相互作用研究.首先，我們構(gòu)建了帶有FLAG標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)RabA2b擬南芥株系，使用FLAG樹(shù)脂沉淀植物材料中的RabA2b蛋白及其復(fù)合物，并通過(guò)LC-MS/MS分析與RabA2b相互作用的蛋白序列，結(jié)果如表1和圖1(見(jiàn)第474頁(yè))所示.

表1　LC-MS/MS獲得的RabA2b相互作用蛋白Hsp70s

質(zhì)譜分析結(jié)果表明與RabA2b共沉淀的蛋白包括了多個(gè)Hsp70家族成員，其中Hsp70-1與Hsp70-2的得分分別為500.03和265.65.除了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70家族成員Hsp70-1和Hsp70-2以外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留Hsp70蛋白BiP1、BiP2以及葉綠體熱激蛋白cpHsp70-2也有較高得分，分別為156.54、192.52和77.81.據(jù)此，我們推測(cè)Hsp70蛋白家族成員可能與RabA2b相互作用，它們可能協(xié)助RabA2b蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能.

2.2Hsp70s在擬南芥根尖細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

Chow等在2008年已經(jīng)報(bào)道RabA2b主要分布在細(xì)胞質(zhì)中靠近高爾基體(Golgi stacks)和液泡前體(prevacuolar compartments)，但不同于高爾基體與液泡前體并且與反式高爾基體(trans-Golgi compartment)部分重疊的一種新的結(jié)構(gòu)中，他們把這種結(jié)構(gòu)命名為Rab-A2/A3體(Rab-A2/A3 compartment)[6].因?yàn)榛プ鞯鞍讘?yīng)該具有相似的空間分布，所以我們推測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70家族成員Hsp70-1和Hsp70-2最有可能與RabA2b相互作用從而調(diào)控RabA2b的功能.在TAIR網(wǎng)站搜索與Hsp70-1和Hsp70-2氨基酸序列相似性高的蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)了另外3個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位Hsp70s蛋白，即Hsp70-3、Hsp70-4、Hsp70-5.使用Clustal X2.1軟件比對(duì)Hsp70-1至Hsp70-5的氨基酸序列，結(jié)果表明任意兩個(gè)預(yù)測(cè)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70s的氨基酸序列相似性都大于80%(圖2(a))；使用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，表明5個(gè)Hsp70s具有很近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖2(b)).由此，我們?cè)诮酉聛?lái)的研究中詳細(xì)研究了這5個(gè)Hsp70s蛋白與RabA2b的相互作用關(guān)系.

(a)

為了驗(yàn)證這一類(lèi)Hsp70s蛋白確實(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，我們首先構(gòu)建了過(guò)表達(dá)35S∶∶Hsp70s-GFP的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，使用Leica SP8熒光共聚焦顯微鏡觀察在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)5d的轉(zhuǎn)基因幼苗的根尖細(xì)胞，5個(gè)Hsp70s蛋白都廣泛地分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核中(圖3),與預(yù)測(cè)[26]和已有文獻(xiàn)報(bào)道[25,28]的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位相一致.同時(shí)Hsp70s蛋白的定位與文獻(xiàn)報(bào)道[6]的RabA2b蛋白的定位重疊.為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hsp70s與RabA2b是否真正具有相似的空間定位，我們接下來(lái)在煙草葉表皮細(xì)胞中進(jìn)行了Hsp70s和RabA2b的共定位實(shí)驗(yàn).

2.3Hsp70s分別與RabA2b在煙草葉表皮細(xì)胞中共定位

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hsp70s與RabA2b是否在細(xì)胞的相同部位發(fā)揮作用，我們分別構(gòu)建了紅色熒光蛋白mCherry與RabA2b的C端融合的植物表達(dá)載體RabA2b-mCherry和綠色熒光蛋白GFP與Hsp70s的C端融合的植物表達(dá)載體Hsp70s-GFP.將植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后，再共同轉(zhuǎn)化煙草葉表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)16h，在長(zhǎng)日照條件下再培養(yǎng)2d，取注射過(guò)農(nóng)桿菌的煙草葉片在熒光共聚焦顯微鏡下觀察.結(jié)果表明在煙草葉表皮細(xì)胞中5個(gè)Hsp70s-GFP的熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜中都有分布(圖4A1～A5，見(jiàn)第476頁(yè))，這與擬南芥根尖穩(wěn)定表達(dá)Hsp70s-GFP蛋白的結(jié)果相一致.除此以外，發(fā)現(xiàn)Hsp70s-GFP也定位于細(xì)胞核周?chē)慕z狀結(jié)構(gòu)上，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[29-30]我們初步推測(cè)細(xì)胞核周?chē)慕z狀結(jié)構(gòu)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確的結(jié)論還需要用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)記蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的共定位實(shí)驗(yàn)分析.另一方面，在細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周?chē)慕z狀結(jié)構(gòu)上也檢測(cè)到RabA2b-mCherry的熒光信號(hào)(圖4B1～B5)，這與Hsp70s-GFP的定位十分一致.通過(guò)疊加Hsp70s-GFP的綠色熒光信號(hào)和RabA2b-mCherry的紅色熒光信號(hào)，我們發(fā)現(xiàn)Hsp70s與RabA2b蛋白共同定位于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核周?chē)慕z狀結(jié)構(gòu)上(圖4D1～D5).由此可知，RabA2b與Hsp70s在細(xì)胞水平上具有相互作用的空間基礎(chǔ)，這為證實(shí)Hsp70s為RabA2b的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白提供了進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)證據(jù).

2.4Pull-down實(shí)驗(yàn)證明RabA2b與Hsp70s在體外相互作用

將RabA2b的編碼序列克隆到pMAL-c2X原核表達(dá)載體上，Hsp70s的編碼序列分別構(gòu)建到pET-42a載體上.將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體以及空載體分別轉(zhuǎn)入E.coliTransetta菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化后得到蛋白MBP-RabA2b、MBP以及GST-Hsp70s，其中MBP和GST-Hsp70s的組合作為陰性對(duì)照.將5個(gè)重組蛋白GST-Hsp70s分別與GST樹(shù)脂結(jié)合后，加入適量的MBP-RabA2b和適當(dāng)過(guò)量的MBP蛋白共同孵育，再洗去非特異性結(jié)合的蛋白.在Western blot之后，使用MBP抗體檢測(cè)洗脫液中的MBP標(biāo)簽信號(hào)，結(jié)果表明GST-Hsp70-1、GST-Hsp70-2、GST-Hsp70-3、GST-Hsp70-4、GST-Hsp70-5與MBP-RabA2b共孵育的洗脫液中都獲得了強(qiáng)的雜交信號(hào)，而在與MBP蛋白共孵育的樣品中只檢測(cè)到極微弱的雜交信號(hào)(圖5)，從而表明RabA2b在體外能夠特異地和5個(gè)GST-Hsp70s蛋白發(fā)生直接的物理相互作用.此結(jié)果既為Hsp70s蛋白是RabA2b可能的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白提供了分子生物學(xué)方面的證據(jù)，也證實(shí)了前期免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和LC-MS/MS的準(zhǔn)確性和可靠性.

2.5RabA2b分別與Hsp70s在煙草葉表皮細(xì)胞中相互作用

我們進(jìn)一步利用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)探究RabA2b與Hsp70s在植物體中是否也存在相互作用.我們首先構(gòu)建了與黃色熒光蛋白(YFP)的N端融合的RabA2b植物表達(dá)載體pXY106-RabA2b和與YFP羧基端融合的Hsp70-1至Hsp70-5植物表達(dá)載體pXY104-Hsp70-1至pXY104-Hsp70-5.將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體以及空載體pXY106、pXY104分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，然后兩兩混合共同轉(zhuǎn)入煙草葉表皮細(xì)胞中，經(jīng)黑暗培養(yǎng)16h、長(zhǎng)日照條件下再培養(yǎng)2d后，蛋白在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)Leica SP8熒光共聚焦顯微鏡觀察到pXY106-RabA2b分別與pXY104-Hsp70s共轉(zhuǎn)的煙草葉表皮細(xì)胞中出現(xiàn)非常強(qiáng)的不規(guī)則顆粒狀熒光信號(hào)(圖6A1～A5)，而與空載體配對(duì)的蛋白組合沒(méi)有檢測(cè)到任何熒光信號(hào)(圖6A6～A12)，說(shuō)明在煙草葉片中RabA2b和5個(gè)Hsp70s都能相互作用.

為了確定熒光信號(hào)在細(xì)胞中的具體定位，我們把煙草葉表皮細(xì)胞用DAPI(一種細(xì)胞核染料)染色(圖6B1～B12).顯微鏡觀察結(jié)果表明DAPI染色后細(xì)胞核發(fā)出的藍(lán)紫色熒光信號(hào)與相互作用信號(hào)并沒(méi)有重疊(圖6D1～D5)，也就是說(shuō)RabA2b和5個(gè)Hsp70s的相互作用不是發(fā)生在細(xì)胞核中.但是，關(guān)于它們發(fā)生相互作用具體位于細(xì)胞質(zhì)中的哪種結(jié)構(gòu)還需要使用帶有熒光標(biāo)記的各種細(xì)胞器的標(biāo)簽蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的共定位實(shí)驗(yàn)來(lái)證明.

3　討　論

在哺乳動(dòng)物和酵母當(dāng)中，Rab家族成員的調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白的篩選鑒定工作已經(jīng)取得了很大進(jìn)展.這些調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白主要包括肌球蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白、磷脂酰肌醇代謝相關(guān)的酶以及與囊泡出芽和融合有關(guān)的調(diào)節(jié)因子[31-33].但是在植物當(dāng)中，被篩選鑒定出的Rab調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白非常有限，并且由于Rab調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性造成了我們不能簡(jiǎn)單地通過(guò)不同物種間的蛋白序列比對(duì)找出植物中對(duì)應(yīng)的Rab調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白.在已有的與植物Rab蛋白相關(guān)的報(bào)道中，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)、共定位實(shí)驗(yàn)以及Pull-down實(shí)驗(yàn)，PI-4Kβ1已經(jīng)被證明是RabA4b[34]和RabA4d[7]的共同效應(yīng)蛋白，PI-4Kβ1分別與RabA4b和RabA4d參與調(diào)控了擬南芥根毛的極性擴(kuò)張以及花粉管尖端的生長(zhǎng)過(guò)程.除此之外，在番茄中，Rab11特異性地參與了SYP122依賴(lài)的囊泡運(yùn)輸過(guò)程[35]，但是SYP122是否為Rab11的調(diào)節(jié)或效應(yīng)蛋白還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.在gnom突變體細(xì)胞當(dāng)中，RabF2的分布發(fā)生了變化，暗示GNOM對(duì)于RabF2的定位有重要的作用[36]，但是至今還沒(méi)有直接的證據(jù)表明GNOM蛋白是RabF2的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白.本研究中我們通過(guò)體外Pull-down和BiFC實(shí)驗(yàn)分別證明了RabA2b能夠和5個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70s蛋白在植物體外和植物體內(nèi)發(fā)生相互作用，為進(jìn)一步證實(shí)Hsp70s為RabA2b可能的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白提供了分子生物學(xué)證據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步闡明RabA2b在擬南芥中參與調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程奠定了細(xì)胞學(xué)層面的基礎(chǔ).

Cazale等研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)Hsp70-1使植株的根變短，并且證明根尖分生區(qū)細(xì)胞的長(zhǎng)度并沒(méi)有明顯變化，造成短根表型的主要原因是突變體主根細(xì)胞數(shù)目的減少[24].也有研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)在Hsc70-1的T-DNA插入突變體背景下抑制Hsc70-4基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞分裂不正常，產(chǎn)生了只有單片子葉、兩片子葉不對(duì)稱(chēng)或者兩片子葉發(fā)生融合的畸形植株[27].另一方面，對(duì)于RabA2子類(lèi)成員的研究表明該子類(lèi)成員主要分布在細(xì)胞板特別是細(xì)胞板延伸的邊緣，RabA2a負(fù)顯性突變體的根生長(zhǎng)畸形，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該突變體大多數(shù)根細(xì)胞含有多個(gè)細(xì)胞核，這種現(xiàn)象是由于細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)的有絲分裂但卻沒(méi)有進(jìn)行徹底的胞質(zhì)分裂造成的[6].因此，在擬南芥中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的Hsp70s和調(diào)控囊泡從反面高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)腞abA2子類(lèi)成員在調(diào)控細(xì)胞分裂的過(guò)程中都發(fā)揮了極其重要的作用.在本研究中我們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了Hsp70s和RabA2b的相互作用關(guān)系.由此推測(cè)Hsp70s很可能和RabA2b蛋白一起參與了擬南芥根尖細(xì)胞的分裂過(guò)程，這將是我們今后研究的重點(diǎn).

對(duì)于擬南芥花粉管發(fā)育的研究表明RabA亞族成員RabA4d特異性地定位在花粉管，RabA4d的突變體表現(xiàn)出膨脹的花粉管，花粉管的生長(zhǎng)速率減慢同時(shí)花粉管細(xì)胞壁的組分發(fā)生了改變[7].另有研究發(fā)現(xiàn)編碼Hsp70輔助蛋白AtJ1的基因插入失活導(dǎo)致開(kāi)花延遲同時(shí)結(jié)實(shí)率降低[37].而且通過(guò)比較干燥的成熟花粉粒、吸水之后的花粉粒以及正在伸長(zhǎng)的花粉管的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的過(guò)程中都有大量的Hsp基因在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)[38].這預(yù)示著Hsp70s可能與RabA亞族成員在花粉管的伸長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，最終影響植物的結(jié)實(shí)率.

在植物抵御病原菌的入侵方面有研究發(fā)現(xiàn)AtHsp70-15缺失突變體對(duì)蕪菁花葉病毒表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性[25].同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明RabA6a和RabA4c在FLS2內(nèi)吞過(guò)程的不同階段發(fā)揮作用[11].分布在細(xì)胞質(zhì)膜上的FLS2是細(xì)菌鞭毛蛋白的受體蛋白，它在識(shí)別了細(xì)菌入侵信號(hào)之后，能將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部從而啟動(dòng)一系列的反應(yīng)來(lái)抵御病原菌的入侵.因此，Hsp70s和RabA亞族成員在植物免疫方面的作用也應(yīng)該引起重視.

在本研究過(guò)程中，無(wú)論是Hsp70s的亞細(xì)胞定位結(jié)果和Hsp70s與RabA2b的共定位結(jié)果還是Hsp70s與RabA2b的體外Pull-down結(jié)果和BiFC結(jié)果都證實(shí)了Hsp70s與RabA2b之間的相互作用，并且這種作用在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的5個(gè)Hsp70s蛋白間沒(méi)有差異，說(shuō)明了在擬南芥中這5個(gè)Hsp70基因在功能上是冗余的，同時(shí)也可以從側(cè)面反映Hsp70s和RabA2b蛋白協(xié)同發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，5個(gè)Hsp70s蛋白共同與RabA2b相互作用為處于復(fù)雜生活環(huán)境中的植物體提供了多重保障.

但是Hsp70s是否是RabA2b真正的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白與RabA2b共同參與調(diào)控細(xì)胞的分裂、花粉管的伸長(zhǎng)、抵抗病原菌的入侵或者是植物體其他的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，僅僅有亞細(xì)胞定位、共定位和蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)是明顯不夠的，遺傳學(xué)方面的證據(jù)也必不可少.如果我們能夠構(gòu)建RabA亞家族與Hsp70s的多突變體遺傳材料，分析細(xì)胞的分裂、花粉管的伸長(zhǎng)、抵抗病原菌的入侵等方面的遺傳表型，就能最終確定Hsp70s是否是RabA2b的調(diào)節(jié)蛋白或效應(yīng)蛋白參與調(diào)控了上述生命活動(dòng).但是對(duì)于本研究而言獲取遺傳學(xué)方面的證據(jù)非常困難，正如上文中分析的5個(gè)Hsp70s基因在功能上具有很強(qiáng)的冗余性，導(dǎo)致單基因的變化不會(huì)改變遺傳表型.同時(shí)這類(lèi)蛋白參與基礎(chǔ)細(xì)胞生命活動(dòng)，如果將多個(gè)Hsp70s基因同時(shí)突變，將造成植株死亡.另外，至今仍然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)針對(duì)Hsp70s家族成員特異的抑制劑[24]，所以在短時(shí)間內(nèi)很難在遺傳上獲得證據(jù)分析證實(shí)Hsp70s與RabA2b相互作用的生物學(xué)意義.下一步，我們既要克服困難逐步構(gòu)建RabA亞家族與Hsp70s的多突變體遺傳材料，也要運(yùn)用新的方法和技術(shù)研究在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中Hsp70s與RabA2b相互作用的重要生物學(xué)意義.

[1]KAHN R, DER C, BOKOCH G. The ras superfamily of GTP-binding proteins： Guidelines on nomenclature [J].TheFASEBJournal, 1992,6(8)： 2512-2513.

[2]VERNOUD V, HORTON A C, YANG Z,etal. Analysis of the small GTPase gene superfamily ofArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2003,131(3)： 1191-1208.

[3]PEREIRA-LEAL J B, SEABRA M C. Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins [J].JournalofMolecularBiology, 2001,313(4)： 889-901.

[4]BOCK J B, MATERN H T, PEDEN A A,etal. A genomic perspective on membrane compartment organization [J].Nature, 2001,409(6822)： 839-841.

[5]RUTHERFORD S, MOORE I. TheArabidopsisRab GTPase family： Another enigma variation [J].Currentopinioninplantbiology, 2002,5(6)： 518-528.

[6]CHOW C M, NETO H, FOUCART C,etal. Rab-A2 and Rab-A3 GTPases define a trans-Golgi endosomal membrane domain inArabidopsisthat contributes substantially to the cell plate [J].ThePlantCell, 2008,20(1)： 101-123.

[7]SZUMLANSKI A L, NIELSEN E. The Rab GTPase RabA4d regulates pollen tube tip growth inArabidopsisthaliana[J].ThePlantCell, 2009,21(2)： 526-544.

[8]PREUSS M L, SERNA J, FALBEL T G,etal. TheArabidopsisRab GTPase RabA4b localizes to the tips of growing root hair cells [J].ThePlantCell, 2004,16(6)： 1589-1603.

[9]LUNN D, GADDIPATI S R, TUCKER G A,etal. Null mutants of individual RABA genes impact the proportion of different cell wall components in stem tissue ofArabidopsisthaliana[J].PLoSOne, 2013,8： e75724.

[10]LYCETT G. The role of Rab GTPases in cell wall metabolism [J].JournalofExperimentalBotany, 2008,59(15)： 4061-4074.

[11]CHOI S W, TAMAKI T, EBINE K,etal. RABA members act in distinct steps of subcellular trafficking of the FLAGELLIN SENSING2 receptor [J].ThePlantCell, 2013,25(3)： 1174-1187.

[12]ASAOKA R, UEMURA T, ITO J,etal.ArabidopsisRABA1 GTPases are involved in transport between the trans-Golgi network and the plasma membrane, and are required for salinity stress tolerance [J].ThePlantJournal, 2013,73(2)： 240-249.

[13]RITOSSA F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP inDrosophila[J].Experientia, 1962,18(12)： 571-573.

[14]SUNG D Y, VIERLING E, GUY C L. Comprehensive expression profile analysis of theArabidopsisHsp70 gene family [J].PlantPhysiology, 2001,126(2)： 789-800.

[15]HSU S F, LAI H C, JINN T L. Cytosol-localized heat shock factor-binding protein, AtHSBP, functions as a negative regulator of heat shock response by translocation to the nucleus and is required for seed development inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2010,153(2)： 773-784.

[16]RAJAN V B V, D’SILVA P.ArabidopsisthalianaJ-class heat shock proteins： Cellular stress sensors [J].Functional&IntegrativeGenomics, 2009,9(4)： 433-446.

[17]SUNG D Y, KAPLAN F, GUY C L. Plant Hsp70 molecular chaperones： Protein structure, gene family, expression and function [J].PhysiologiaPlantarum, 2001,113(4)： 443-451.

[18]MAYER M, BUKAU B. Hsp70 chaperones： cellular functions and molecular mechanism [J].CellularandMolecularLifeSciences, 2005,62(6)： 670-684.

[19]WEGELE H, MüLLER L, BUCHNER J. Hsp70 and Hsp90—a relay team for protein folding [J].ReviewsofPhysiology,BiochemistryandPharmacology, 2004,151(1)： 1-44.

[20]BUKAU B, WEISSMAN J, HORWICH A. Molecular chaperones and protein quality control [J].Cell, 2006,125(3)： 443-451.

[21]FLORES-PéREZ, JARVIS P. Molecular chaperone involvement in chloroplast protein import [J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch, 2013,1833(2)： 332-340.

[22]WU S H, WANG C, CHEN J,etal. Isolation of a cDNA encoding a 70 kDa heat-shock cognate protein expressed in vegetative tissues ofArabidopsisthaliana[J].PlantMolecularBiology, 1994,25(3)： 577-583.

[23]LIN B L, WANG J S, LIU H C,etal. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily inArabidopsisthaliana[J].CellStress&Chaperones, 2001,6(3)： 201.

[24]CAZALé A C, CLéMENT M, CHIARENZA S,etal. Altered expression of cytosolic/nuclear HSC70-1 molecular chaperone affects development and abiotic stress tolerance inArabidopsisthaliana[J].JournalofExperimentalBotany, 2009,60(9)： 2653-2664.

[25]JUNGKUNZ I, LINK K, VOGEL F,etal. AtHsp70-15-deficientArabidopsisplants are characterized by reduced growth, a constitutive cytosolic protein response and enhanced resistance to TuMV [J].ThePlantJournal, 2011,66(6)： 983-995.

[26]SUNG D Y, GUY C L. Physiological and molecular assessment of altered expression of Hsc70-1 inArabidopsis: Evidence for pleiotropic consequences [J].PlantPhysiology, 2003,132(2)： 979-987.

[27]LEE S, LEE D W, LEE Y,etal. Heat shock protein cognate 70-4 and an E3 ubiquitin ligase, CHIP, mediate plastid-destined precursor degradation through the ubiquitin-26S proteasome system inArabidopsis[J].ThePlantCell, 2009,21(12)： 3984-4001.

[28]NOЁL L D, CAGNA G, STUTTMANN J,etal. Interaction between SGT1 and cytosolic/nuclear HSC70 chaperones regulatesArabidopsisimmune responses [J].ThePlantCell, 2007,19(12)： 4061-4076.

[29]BOEVINK P, OPARKA K, CRUZ S S,etal. Stacks on tracks： The plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network [J].ThePlantJournal, 1998,15(3)： 441-447.

[30]NEBENFüHR A, GALLAGHER L A, DUNAHAY T G,etal. Stop-and-go movements of plant Golgi stacks are mediated by the acto-myosin system [J].Plantphysiology, 1999,121(4)： 1127-1141.

[31]BEHNIA R, MUNRO S. Organelle identity and the signposts for membrane traffic [J].Nature, 2005,438(7068)： 597-604.

[32]GROSSHANS B L, ORTIZ D, NOVICK P. Rabs and their effectors： Achieving specificity in membrane traffic [J].ProcNatlAcadeSciUSA, 2006,103(32)： 11821-11827.

[33]MARKGRAF D F, PEPLOWSKA K, UNGERMANN C. Rab cascades and tethering factors in the endomembrane system [J].FEBSLetters, 2007,581(11)： 2125-2130.

[34]PREUSS M L, SCHMITZ A J, THOLE J M,etal. A role for the RabA4b effector protein PI-4Kβ1 in polarized expansion of root hair cells inArabidopsisthaliana[J].TheJournalofCellBiology, 2006,172(7)： 991-998.

[35]REHMAN R U, STIGLIANO E, LYCETT G W,etal. Tomato Rab11a characterization evidenced a difference between SYP121-dependent and SYP122-dependent exocytosis [J].PlantandCellPhysiology, 2008,49(5)： 751-766.

[36]UEDA T, UEMURA T, SATO M H，etal. Functional differentiation of endosomes inArabidopsiscells [J].ThePlantJournal, 2004,40(5)： 783-789.

[37]PARK M Y, KIM S Y. TheArabidopsisJ protein AtJ1 is essential for seedling growth, flowering time control and ABA response [J].PlantandCellPhysiology, 2014,55(12)： 2152-2163.

[38]WANG Y, ZHANG W Z, SONG L F.etal.Transcriptome analyses show changes in gene expression to accompany pollen germination and tube growth inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2008,148(3)： 1201-1211.

Identification and Characterization of RabA2b-interacting Proteins

LENG Linna1,2, JIANG Jianjun1,2, ZHANG Chi1,2, WANG Xuelu1,2,3, SU Wei1,2

(1.InstituteofPlantBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 3.CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

The small G-protein Rab family members play significant roles in cellular trafficking processes. InArabidopsis, the most prominent characteristic of the Rab family is possessing numerous RabA subfamily members, which participate in regulating distinct growth and developmental processes. To elucidate the molecular mechanisms underlying the RabA subfamily, we used RabA2b as a research object to screen and identify the downstream regulatory or effector molecules. Initially, we constructed RabA2b overexpression plants, and then through co-immunoprecipitation assay and LC-MS/MS assay, we detected a number of Hsp70 family proteins interacting with RabA2b. In order to explore the concrete relationship between Hsp70 family and RabA2b, we constructed related plant expression vectors of 5 Hsp70s, namely Hsp70-1 to Hsp70-5, as well as RabA2b, respectively. The results from co-localization assay showed that Hsp70s and RabA2b were both located in cytoplasm and fibrillar structures and on the plasma membrane in pavement cells ofN.benthamiana. At the meantime,invitopull-down assay confirmed that Hsp70s could directly interact with RabA2b. Furthermore, bimolecular fluorescence complementation assay further provided the evidence that the interaction between Hsp70s and RabA2b existedinvivo. These results suggest that Hsp70s serve as the regulatory or effector proteins of RabA2b to synergistically regulate the diverse growth and developmental processes inArabidopsis.

RabA2b; Hsp70; interaction; regulatory or effector protein

0427-7104(2016)04-0471-11

2015-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(KRH1322423)

冷琳娜(1992—)，女，碩士研究生；蘇偉，女，副教授，通訊聯(lián)系人，E-mail: weisu@fudan.edu.cn.

Q 37

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