莖點(diǎn)霉真菌Phoma adianticola引起的一種茶樹新病害

楊文，陳瑤，陳小均，姚雍靜，周玉鋒

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莖點(diǎn)霉真菌引起的一種茶樹新病害

楊文1，陳瑤1，陳小均2，姚雍靜1，周玉鋒1*

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006

對一種引起茶樹芽頭褐變的病原進(jìn)行了分離鑒定研究。通過柯赫氏法則，成功分離得到了致病菌株。菌株P(guān)DA培養(yǎng)條件下的形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS分子鑒定結(jié)果表明，此病原菌為莖點(diǎn)霉屬真菌。按照莖點(diǎn)霉屬真菌鑒定程序開展了鑒定研究。此菌在OA和MA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7?d后，菌落平均直徑6.0~6.4?cm；分生孢子器圓球形，具孔口，器外壁光滑或有菌絲附著；分生孢子橄欖球形，無隔，多數(shù)具2個游球，大小為4.9~6.3?μm×2.1~2.8?μm；NaOH顏色反應(yīng)呈黃綠色。根據(jù)上述特征，初步鑒定此病原菌為。由引起的茶樹芽頭褐變可能是茶樹的一種新病害。根據(jù)此菌侵染后的癥狀，暫將其表述為茶樹褐芽病。

莖點(diǎn)霉；；茶樹

近年來，在貴州省湄潭及其周邊茶區(qū)大面積發(fā)生一種主要為害茶樹夏秋季幼嫩芽葉的病害。此病最初在未展開芽頭基部出現(xiàn)褐色病斑，葉片展開后，葉莖交界處病斑擴(kuò)大，病斑顏色加深，葉片易脫落，同時又于新的芽頭基部出現(xiàn)褐色病斑；發(fā)生嚴(yán)重的茶樹枝條后期會鈍縮，以致新芽出芽率低或?yàn)榛窝?，明顯降低夏秋茶鮮葉下樹率；感病芽葉采摘后2?h內(nèi)整芽變黑，嚴(yán)重影響茶鮮葉品質(zhì)，導(dǎo)致茶農(nóng)減產(chǎn)減收。此病害的田間發(fā)病癥狀明顯區(qū)別于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料所記載的茶樹幼嫩芽葉病害，因而不能對癥制定科學(xué)的防治方法?；谏鲜霰尘?，本研究開展了該病害病原菌的分離與鑒定研究，為制定其預(yù)防和控制措施提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 田間調(diào)查與病葉采集

2013年6月至10月和2014年6月至10月，連續(xù)兩年對湄潭茶區(qū)發(fā)病茶樹進(jìn)行田間調(diào)查（每40?d調(diào)查1次），觀察病癥、記載和拍照；并采集典型發(fā)病芽頭用于病原分離。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)與單孢純化

采用常規(guī)組織分離法[1]，取發(fā)病茶樹芽頭病健交界處5?mm的組織，用75%的酒精表面消毒1?min，然后用無菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干表面的水分，貼于PDA培養(yǎng)基，25℃恒溫光照培養(yǎng)。菌落形成后及時從菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，至菌落中有大量黑色小點(diǎn)即分生孢子器產(chǎn)生。用接種針挑取新鮮的單個分生孢子器置于無菌水滴中，輕輕將分生孢子器輾壓，使分生孢子從中溢出，分布于無菌水中。然后逐步稀釋并鏡檢，直至100倍顯微鏡觀察的1個視野中僅鏡檢到1~2個分生孢子。最后蘸取最終稀釋倍數(shù)的分生孢子懸浮液，均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至單菌落產(chǎn)生，然后用接種針挑取菌絲，移至試管中PDA斜面培養(yǎng)3?d后，置于4℃冰箱內(nèi)存放備用。

1.3 病原菌回接與再分離

1.3.1 菌絲塊接種

水培茶樹枝條接種，接種20個枝條，在每個枝條芽頭基部接種1塊菌絲塊。取601茶樹品種的健康枝條，長10?cm，經(jīng)75%酒精表面消毒并用無菌水沖洗干凈，插入含pH值為6.5的霍蘭氏營養(yǎng)液的三角瓶中。取直徑5?mm菌餅接種于茶枝芽頭基部，接種后將三角瓶移入經(jīng)75%酒精消毒的15?cm高的塑料桶中，塑料桶中加入50?mL無菌水，用保鮮膜覆蓋桶口，置于25℃條件下培養(yǎng)，接種1?d后移去菌絲塊，以無菌PDA塊接種的葉片作對照，移去菌絲塊后觀察葉片發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率。

1.3.2 分生孢子懸浮液接種

為進(jìn)一步證實(shí)病原菌的致病性，采用1.3.1中水培茶樹枝條接種程序，進(jìn)行分生孢子懸浮液接種。釆用微型噴霧器，將1.2制好的分生孢子懸浮液均勻噴灑于整個茶樹枝條表面，共接種20個枝條，以噴灑無菌水的茶樹枝條作對照，在1.3.1相同條件下培養(yǎng)。接種后觀察發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌的再分離

分別對菌絲塊、孢子懸浮液接種后的發(fā)病芽頭按1.2的組織分離法進(jìn)行病原菌再分離，確認(rèn)前后兩次組織分離法分離所得病原菌在菌絲和孢子形態(tài)上是否一致，從而完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)Gruyter等[2]和《Identification Manual》[3]一書中的方法，將分離到的菌株接至OA和MA培養(yǎng)基上，置于25℃條件下培養(yǎng)7?d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子器和孢子形態(tài)。

1.4.2 NaOH顏色反應(yīng)

根據(jù)Gruyter等[2]和《Identification Manual》[3]一書中的方法，將供試菌株接種至新鮮的OA和MA平板中央，25℃條件下培養(yǎng)7?d后，在菌落邊緣滴加10?mol·L-1的NaOH溶液，處理后10?min觀察顏色變化情況，直至培養(yǎng)基顏色不變化為止。

1.4.3 病原菌rDNA-ITS分子鑒定

（1）基因組DNA提取

提取病原菌基因組DNA，釆用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（購自上海生工）操作。取50?mg新鮮菌絲用于DNA提取，其實(shí)驗(yàn)過程參照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒操作說明書的程序。

（2）rDNA-ITS擴(kuò)增

采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25?μL，各組分如下：模板DNA（20~50?ng·μL-1）0.5?μL，10PCR Buffer 2.5?μL，dNTP（10?mmol·L-1）1?μL，引物ITS1和ITS4（10?μmol·L-1）各0.5?μL，DNA聚合酶（5U·μL-1）0.2?μL，ddH2O 19.8?L，所用材料均購自生物工程（股份）有限公司。PCR擴(kuò)增在PTC-200型擴(kuò)增儀上完成，程序?yàn)?4℃預(yù)變性4?min，然后94℃ 45?s，55℃退火45?s，72℃延伸1?min，30次循環(huán)，72℃延伸10?min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5?μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）觀察、照相、保存。在紫外燈下從凝膠中切取目的條帶，經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測序。

獲得基因序列后，將菌株的rDNA-ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行序列比對并進(jìn)行同源性分析，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)觀察，最終確定病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間觀察病害癥狀表現(xiàn)

通過在貴州湄潭對此病進(jìn)行兩年的田間調(diào)查，結(jié)果表明，此病于每年6月初開始發(fā)生，8月中下旬大面積發(fā)生，主要危害茶樹芽頭。此病最初在未展開芽頭基部出現(xiàn)褐色病斑，葉片展開后，葉莖交界處病斑擴(kuò)大，顏色加深，葉片易脫落，同時又于新的芽頭基部出現(xiàn)褐色病斑（圖1）；發(fā)生嚴(yán)重的茶樹枝條后期鈍縮，新芽出芽率不高或?yàn)榛窝?，以致茶鮮葉絕收，明顯降低夏秋茶鮮葉的下樹率；感病芽葉采摘后2?h內(nèi)整芽褐變，使其無法出售加工。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)與純化

選擇癥狀典型的發(fā)病芽頭，釆用組織分離法分離得到病原菌后，通過顯微觀察進(jìn)行形態(tài)鑒定。2013和2014年2年共6次分離結(jié)果表明（表1），莖點(diǎn)霉屬真菌分離比例最高，分離率均超過46%，且每次分離的莖點(diǎn)霉屬真菌在菌落、顯微觀察的菌絲和孢子形態(tài)均相同；也分離到了部分炭疽病菌，其分離率均不超過19%；其他不產(chǎn)孢且未鑒定的真菌分離率均不超過45%。

2.3 病原菌回接與再分離

通過對上述2年6次分離到的菌株分別進(jìn)行菌絲塊接種，測定致病性。結(jié)果表明，所分離菌均可致病，但只有莖點(diǎn)霉菌株回接后的發(fā)病癥狀與田間調(diào)查時發(fā)病癥狀相似（圖2）。莖點(diǎn)霉菌株菌絲塊接種3?d后均可發(fā)病，發(fā)病率為100%。孢子懸浮液接種結(jié)果表明，接種莖點(diǎn)霉菌株5?d后開始發(fā)病，且只有幼嫩芽頭感病，先從芽頭基部出現(xiàn)癥狀，展開的葉片易脫落，其發(fā)病情況和田間癥狀一致（圖3）。對以菌絲塊和孢子懸浮液接種發(fā)病葉片進(jìn)行病原再分離，所得菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征均與接種的菌株相同。基于2年6次的菌絲塊和孢子懸浮液接種結(jié)果，確定分離到的莖點(diǎn)霉菌株為病原菌。

2.4 病原菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

（1）菌落特征

在OA培養(yǎng)基上，3?d以前菌絲為白色；第4天可見菌落中央變褐色且菌落表面可見黑色小點(diǎn)，即分生孢子器；培養(yǎng)7?d后，菌絲稀薄，菌落邊緣白色，中央褐色，中央白色氣生菌絲絨氈狀，菌落直徑6.2~6.4?cm（圖4）。在MA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7?d后，菌絲稀薄，菌落白色，中央淺褐色，菌落直徑為6.0~6.4?cm（圖5）。在PDA培養(yǎng)基上，3?d以前菌絲為白色，第4天可見菌落中央變褐色，培養(yǎng)7?d后，菌絲稀薄，菌落邊緣白色，中央褐色，可見少量黑色小點(diǎn)，即分生孢子器，菌落直徑6.2~6.5?cm（圖6）。

（2）顯微觀察結(jié)果

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲分隔，具橋接現(xiàn)象，內(nèi)具多個圓球形內(nèi)含物（圖7）。分生孢子器圓球形，具1~2個孔口，器外壁光滑或有菌絲附著，內(nèi)生分生孢子（圖8）。分生孢子為橄欖球形，無隔，多數(shù)具2個游球，分生孢子大小為 (4.9~6.3)?μm×(2.1~2.8)?μm（圖9）。

2.4.2 NaOH反應(yīng)

菌株在OA和MA培養(yǎng)基上生長7?d后，10?mol·L-1的NaOH溶液處理10?min后，培養(yǎng)基顏色均變?yōu)辄S綠色，1?h后觀察，仍為黃綠色（圖10）。

2.4.3 rDNA-ITS分子鑒定

用通用引物ITS1和ITS4對菌株的rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出517?bp的特異性片斷，產(chǎn)物測序獲得了如圖11所示的序列。

將菌株的rDNA-ITS序列輸入GenBank中進(jìn)行blast同源性比對，結(jié)果（表2）表明，在同源性較高的9個菌株中，鑒定到種的僅有2個（3個登錄號），分別為glomerata和，根據(jù)《Identification Manual》[3]一書中對這兩個種相關(guān)形態(tài)特征的描述，均與供試菌不符合。因而，分子水平的鑒定結(jié)果，只能將供試菌株鑒定到莖點(diǎn)霉屬這一級，在種級水平上的鑒定還需參照形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

本研究對引起貴州湄潭茶葉芽頭褐變的一種真菌進(jìn)行了分離和鑒定，采用柯赫氏法則分離得到了致病菌株，經(jīng)形態(tài)觀察和rDNA-ITS分子鑒定，確定其為莖點(diǎn)霉屬（）。

莖點(diǎn)霉屬真菌的種類很多，目前全世界報道的超過2?000種；其中多數(shù)為植物病原菌。莖點(diǎn)霉屬自Fries創(chuàng)建以來，在其分類和命名方面，Boerema、Gruyter和Noordeloos等人做了大量工作，他們于1992~2003年間，先后在Persoonia和MYCOTAXON兩個期刊發(fā)表了20篇主題為《Contributions towards a monograph of(coelomycetes)》的論文，系統(tǒng)地將菌落大小與顏色、厚垣孢子形成、晶體、分生孢子器和分生孢子的特點(diǎn)，產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)及類型，NaOH顏色反應(yīng)，以及該菌的寄主植物等作為該屬真菌不同種間的分類依據(jù)。2004年Boerema等[3]又編寫出版了《Identification Manual》一書，該書中詳細(xì)記錄了223個種，并編制了其檢索表，該書是目前最為完整和權(quán)威的莖點(diǎn)霉屬真菌鑒定手冊。

按照《Identification Manual》一書中的方法，需先將莖點(diǎn)霉屬真菌劃分至九大部分中的一個部分，再鑒定到種。根據(jù)分離到的菌株在培養(yǎng)基中產(chǎn)生分生孢子器、未發(fā)現(xiàn)厚垣孢子、光滑且有明顯孔口、分生孢子相對較小且無隔的特征，將病原菌劃分至Asect.。

分離到的菌株在OA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7?d后，菌落直徑6.2~6.4?cm，在OA和MA培養(yǎng)基上NaOH顏色反應(yīng)呈陽性，均變?yōu)辄S綠色，且處理1?h后，仍為黃綠色，根據(jù)這些特征，在Gruyter 等[2]發(fā)表論文的檢索表中，其檢索結(jié)果為。根據(jù)分生孢子無隔、其大小為 (4.9~6.3)?μm×(2.1~2.8)?μm，通常含2個油球，同時結(jié)合菌落直徑和顏色反應(yīng)特征，在《Identification Manual》一書的Asect.中檢索結(jié)果仍為。分子鑒定過程中，在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，與所測菌株同源性高且鑒定到種的為和，但是可以產(chǎn)生豐富的厚垣孢子鏈，且具大量氣生菌絲，在MA培養(yǎng)基上的NaOH顏色反應(yīng)是由綠色變?yōu)榧t色，這兩個菌的特征均與供試菌不符。在真菌鑒定研究中，形態(tài)學(xué)鑒定是基礎(chǔ)，分子鑒定是重要補(bǔ)充[4]，因此，本研究將引起貴州湄潭茶葉芽頭褐變的病原菌初步定為。

現(xiàn)有文獻(xiàn)記錄中，能以茶屬植物為寄主的莖點(diǎn)霉屬真菌主要有Cooke[5-6]、Pass[7-8]、Hara[5,9]、[10]和[11]。根據(jù)陸家云[6]的描述，Cooke主要侵染茶的莖部，它明顯區(qū)別于本研究病原菌的侵染部位。Pass是芽葉枯病病菌，此病于1970年在我國廣東相關(guān)茶園首次發(fā)現(xiàn)，可危害茶樹成葉、弱枝、芽葉和嫩梢，芽葉發(fā)病時，多數(shù)從葉尖或葉緣開始；此菌PDA上的菌絲為淡紅色，明顯區(qū)別于本研究病原菌[7-8]。Hara是茶心枯病病原菌，此病多發(fā)生在茶樹嫩葉和成葉上，有時芽梢也受害，在嫩葉上先從葉尖開始出現(xiàn)癥狀，在成葉上多從葉片的邊緣開始出現(xiàn)病斑，嫩芽梢受害時，從芽尖開始，逐漸蔓延至半個芽梢枯死，此病原菌較大的分子孢子[大小為 (7~11)?μm×(4~4.5)?μm]區(qū)別于本研究中的病原菌[9]。Kinsey[10-11]于2002年描述了和兩個原病菌的寄主包括茶屬植物，但是在OA上的NaOH顏色反應(yīng)呈陰性[3]，而在OA上培養(yǎng)7?d后的直徑僅為2.0~2.5?cm[3]，兩個菌的相關(guān)特征也明顯區(qū)別于本研究中的病原菌。

根據(jù)《Identification Manual》一書的描述，是一些蕨類植物病害的病原[3]，作為茶屬植物病害病原，未見關(guān)于的報道。此外，此病原菌的癥狀表現(xiàn)和相關(guān)特征也明顯區(qū)別于已有報道和記錄的以茶屬植物為寄主的莖點(diǎn)霉屬真菌?；诖?，初步認(rèn)為，由引起茶樹芽頭褐變的病害可能是茶樹的一種新病害。根據(jù)此菌侵染后的癥狀表現(xiàn)，特將此菌引起的茶樹芽頭病害暫表述為茶樹褐芽病。

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A New Disease of Tea Plant Caused by

YANG Wen1, CHEN Yao1, CHEN Xiaojun2, YAO Yongjing1, ZHOU Yufeng1*

1. Guizhou Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China; 2. Guizhou Plant Protection Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China

This paper aims to study the pathogen isolation and identification of a kind of disease causing browning on tea buds. The pathogenic strain was obtained according to Koch's Rule. The results of morphological observation of strains and the rDNA ITS molecular identification under the condition of PDA culture showed that the pathogen was a fungus of. The pathogenic strain was further identified in according to the identification procedures of. After 7 days on the OA and MA culture medium, the average diameter of colonies was 6.0-6.4?cm. Pycnidia were globose with 1-2 ostioles, glabrous or with some hyphal outgrowths. Conidia were ellipsoidal, aseptate, usually with two polar guttules, mostly (4.9-6.3)?μm× (2.1-2.8)?μm in size. The NaOH reaction was positive on OA and MA, the colour became yellow-green. The characteristics described above showed that the pathogen was preliminarily identified as. This disease of tea buds caused bymay be a new disease of tea plant. According to the symptoms of infection, this disease was temporarily described as the buds-browning disease of tea.

phoma,, tea plant

S571.1；Q949.32

A

1000-369X（2016）01-059-09

2015-07-02

2015-08-18

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字[2014]2101號）、貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NZ字[2012]3022號）。

楊文，男，副研究員，博士，主要從事茶樹病蟲害及其防控研究。*通訊作者：gzzhouyf@sohu.com