茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種的SSR分子標(biāo)記鑒定和系譜關(guān)系分析

黃丹娟，馬建強(qiáng)，陳亮

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茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種的SSR分子標(biāo)記鑒定和系譜關(guān)系分析

黃丹娟，馬建強(qiáng)，陳亮*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家茶樹(shù)改良中心，農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008

利用30對(duì)SSR引物，對(duì)26個(gè)植物新品種保護(hù)（PVP）申請(qǐng)茶樹(shù)品種及其13個(gè)近似品種與親本進(jìn)行了分子鑒定和系譜關(guān)系分析，探討SSR分子標(biāo)記在茶樹(shù)新品種保護(hù)工作和DUS測(cè)試中的應(yīng)用。研究結(jié)果顯示，30對(duì)SSR引物共檢測(cè)到131個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)的等位基因數(shù)為3~7個(gè)，平均4.4個(gè)。平均Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為1.04和0.51。39個(gè)參試品種的遺傳距離在0.03~0.70之間。在遺傳距離為0.15時(shí)，可將39個(gè)品種劃分為7類(lèi)，其中地理來(lái)源一致或遺傳背景相似的材料基本上聚為一類(lèi)。30對(duì)引物的品種鑒定能力差異較大，每對(duì)引物能鑒定的品種數(shù)為3~16個(gè)。通過(guò)4對(duì)核心引物的組合可以鑒定全部39個(gè)參試品種，并依此構(gòu)建了SSR指紋圖譜。

茶樹(shù)；PVP；SSR標(biāo)記；指紋圖譜

植物新品種保護(hù)（Plant variety protection，PVP）是知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種保護(hù)形式。1999年，我國(guó)加入國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（The international union for the protection of new varieties of plants，UPOV），隨后開(kāi)始植物新品種保護(hù)工作。山茶屬植物與茶組植物分別于1999年和2008年被列入國(guó)家林業(yè)局和農(nóng)業(yè)部發(fā)布的中華人民共和國(guó)植物新品種保護(hù)名錄。隨著農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新和知識(shí)產(chǎn)權(quán)意識(shí)的提升，茶樹(shù)新品種保護(hù)日益受到人們的關(guān)注和重視。目前，已獲得植物新品種權(quán)授權(quán)的茶樹(shù)品種有9個(gè)，正在進(jìn)行新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測(cè)試的申請(qǐng)品種有20多個(gè)。目前現(xiàn)行的茶樹(shù)DUS測(cè)試與品種鑒定通常采用基于外觀形態(tài)特征的田間觀察檢測(cè)方法，需要茶苗定植后兩年以上才能開(kāi)展，并且測(cè)試性狀多為多基因控制的數(shù)量性狀，受環(huán)境條件影響，可能導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果不穩(wěn)定，進(jìn)一步延長(zhǎng)測(cè)試周期。同時(shí)，近年來(lái)茶樹(shù)新品種的遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越集中在少數(shù)骨干親本上，根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行品種鑒定越來(lái)越困難。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單快速穩(wěn)定的測(cè)試技術(shù)，對(duì)于提升茶樹(shù)新品種保護(hù)和管理能力具有重要意義。

基于DNA標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的分子指紋圖譜，具有高度的特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，是植物品種鑒定中十分有效的輔助手段。其中，SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記因具有等位變異高、共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)[1]，在植物指紋圖譜研究中被廣泛應(yīng)用。UPOV在其生物化學(xué)和分子技術(shù)測(cè)試指南中已將SSR標(biāo)記作為DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的推薦標(biāo)記之一。目前，我國(guó)利用SSR標(biāo)記已構(gòu)建了玉米[2-3]、小麥[4-5]、水稻[6-7]等作物現(xiàn)有品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，并且在新品種DUS測(cè)試中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

本研究利用30對(duì)SSR引物對(duì)26個(gè)茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種及其13個(gè)近似品種與親本進(jìn)行分子鑒定和系譜關(guān)系分析，通過(guò)篩選特征引物組合，構(gòu)建參試品種的SSR指紋圖譜，探討其在茶樹(shù)DUS測(cè)試中的應(yīng)用潛力，以期為我國(guó)茶樹(shù)新品種權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的39個(gè)茶樹(shù)品種如表1所示，其中1~26號(hào)為已經(jīng)獲得新品種權(quán)或正在進(jìn)行DUS測(cè)試的品種，27~39號(hào)為對(duì)應(yīng)的近似品種和親本。從國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃（I）和勐海茶樹(shù)分圃（II）、貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所（III）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲料植物研究所（IV）采摘各參試品種無(wú)病蟲(chóng)害感染的一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB法[8]提取基因組DNA，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，ND-1000 UV-Vis Speetrophotometer檢測(cè)DNA濃度，稀釋到20?ng·μL-1用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

30對(duì)SSR引物的相關(guān)信息參見(jiàn)馬建強(qiáng)[9]的報(bào)道。引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為DNA 2?μL，10×PCR buffer (Mg2+) l?μL，2?U·μL-1Taq DNA polymerase 0.2?μL，10?μmol·L-1Forward primer 0.2?μL，10?μmol·L-1Reverse primer 0.2?μL，10?nmol·L-1dNTPs 0.2?μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4?min，然后94℃變性30?s，退火30?s（退火溫度根據(jù)所用引物確定），72℃延伸30?s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；隨后72℃下延伸7?min。PCR產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺凝膠和銀染法進(jìn)行檢測(cè)[10]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用人工讀帶方法，每對(duì)引物只分析目標(biāo)條帶附近的擴(kuò)增位點(diǎn)，等位基因按照電泳圖譜從上到下依次命名為A、B、C、D、E等。利用POPGENE[11]統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物在39個(gè)茶樹(shù)品種中擴(kuò)增等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na），計(jì)算有效等位基因（Effective number of alleles，Ne）、等位基因頻率（Allele frequency）、觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity，HE）、Shannon信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）。采用PowerMarker[12]計(jì)算基因型數(shù)（Genotype）、多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC），并根據(jù)Nei′s[13]遺傳距離，進(jìn)行Neighbor-Joining聚類(lèi)分析。根據(jù)所選SSR引物的擴(kuò)增條帶清晰程度、基因型個(gè)數(shù)、PIC值高低等因素，篩選出能鑒別所有品種的核心引物。將核心引物擴(kuò)增出的基因型轉(zhuǎn)換為[0, 1]數(shù)據(jù)矩陣，利用在線二維碼生成器（http://cli.im）構(gòu)建DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性

利用30對(duì)SSR引物對(duì)39份供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如表2所示。30對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出131個(gè)等位基因，每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為2~7個(gè)，平均4.4個(gè)；有效等位基因變異范圍1.29~4.49，平均2.53個(gè)；共檢測(cè)到239個(gè)基因型，平均達(dá)8個(gè)。引物觀測(cè)雜合度（HO）最大為0.76，最小為0.21，平均值為0.47；期望雜合度（HE）最大為0.79，最小為0.23，平均值為0.56。Shannon信息指數(shù)（I）變化范圍較大，為0.38~1.60，平均1.04。多態(tài)信息含量（PIC）最小為0.20，平均多態(tài)信息含量為0.51，引物TM391的PIC信息最高為0.74。

30對(duì)SSR引物在供試品種中共檢測(cè)出了131個(gè)等位基因，不同等位基因出現(xiàn)頻率差異很大。TM526的等位基因B出現(xiàn)頻率最高（84%），其次為T(mén)M584的等位基因C（82%）。出現(xiàn)頻率最低的為T(mén)M535的等位基因A和E，都只有1%（圖1）。

2.2 39個(gè)新品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建

將30對(duì)SSR引物的擴(kuò)增譜帶轉(zhuǎn)化為[0, 1]數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，30個(gè)茶樹(shù)品種中有23個(gè)具有特征譜帶（表3）。

利用特征引物可以快速準(zhǔn)確地鑒定這些茶樹(shù)品種。

根據(jù)特征譜帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，任何1對(duì)引物都不能區(qū)分開(kāi)所有品種，只有采用引物組合鑒定的方式才能將39個(gè)品種全部區(qū)分開(kāi)來(lái)。綜合考慮所選SSR引物的擴(kuò)增條帶清晰程度、基因型個(gè)數(shù)、PIC值高低等因素，將引物進(jìn)行排序，通過(guò)組合的方式，本研究采用最少4對(duì)引物（TM444、TM548、TM259、TM566），便可將參試品種全部區(qū)分開(kāi)來(lái)。利用這4個(gè)標(biāo)記的擴(kuò)增信息，將參試品種的等位基因轉(zhuǎn)換為l和0字符串，作為每一品種的分子身份證，并利用在線二維碼生成器（http://cli.im）建立39份供試材料的指紋圖譜（表4，圖2）。

2.3 品種系譜關(guān)系分析

根據(jù)30對(duì)SSR引物等位基因出現(xiàn)的頻率計(jì)算Nei′s遺傳距離（D），結(jié)果顯示39個(gè)品種的遺傳距離為0.03~0.70。其中來(lái)源于浙江的品種黃金斑和金玉緣的遺傳距離最小，來(lái)源于浙江的品種花欲容和來(lái)源于云南的品種云

茶奇蕊的遺傳距離最大。

根據(jù)Nei′s遺傳距離（D），繪制39份材料的Neighbor-Joining聚類(lèi)圖。當(dāng)D為0.15時(shí)可以將所有供試材料分為7類(lèi)，相同地理來(lái)源或遺傳背景的品種基本上聚為一類(lèi)。例如，第I和第II類(lèi)群主要聚類(lèi)了浙江省的品種，第IV和第V類(lèi)群分別聚類(lèi)了貴州和云南的品種。從遺傳背景來(lái)看，中茶125、中茶126和中茶128都是從龍井43的雜交后代中選育而來(lái)，黃金斑和金玉緣分別為黃金芽自然芽變后代培育獲得，云抗14號(hào)和云抗10號(hào)均選自南糯山群體，它們分別聚在了一起。

3 討論

3.1 SSR引物的多態(tài)性

利用分子標(biāo)記構(gòu)建指紋圖譜的原則之一就是利用盡量少的引物分開(kāi)盡量多的品種，以降低成本，提高檢測(cè)效率，這對(duì)所用標(biāo)記的多態(tài)性有一定要求。段艷鳳等[14]從138對(duì)SSR引物中篩選出6對(duì)多態(tài)性高、譜帶清晰的引物，構(gòu)建了88個(gè)馬鈴薯品種的指紋圖譜，引物多態(tài)信息含量均大于0.7。羅忠霞等[15]從342對(duì)SSR引物中篩選出了16對(duì)SSR核心引物，其平均多態(tài)信息含量達(dá)0.79，最終用2對(duì)引物即可鑒別所有52份甘薯種質(zhì)資源。本研究所用的30個(gè)SSR標(biāo)記是前期經(jīng)篩選過(guò)的，擴(kuò)增效果都比較清晰、穩(wěn)定，大部分樣品獲得了1~2條譜帶，平均多態(tài)信息含量為0.51。多態(tài)性較低的標(biāo)記（PIC＜0.25）有3個(gè)；多態(tài)性適中（0.25＜PIC＜0.5）的有9個(gè)；多態(tài)性高（PIC＞0.5）的達(dá)18個(gè)，占所有引物總數(shù)的60%。上述結(jié)果說(shuō)明，本研究選用的30個(gè)SSR標(biāo)記多態(tài)信息含量豐富，在品種鑒定方面具有較高的應(yīng)用潛力。

3.2 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

核心標(biāo)記組合法在構(gòu)建作物DNA指紋圖譜時(shí)十分有效。韓宗福等[16]從63對(duì)SSR引物中篩選出5對(duì)引物的組合，構(gòu)建了黃河流域棉花主栽品種的分子指紋圖譜。陸徐忠等[5]從前人研究的基礎(chǔ)上篩選出一套12對(duì)SSR核心引物（每條染色體1對(duì)）對(duì)127份水稻品種進(jìn)行了分子指紋分析。在茶樹(shù)DNA指紋圖譜構(gòu)建中，Ujihara等[17]、楊陽(yáng)等[18]、劉本英等[19]、王讓劍等[20]進(jìn)一步驗(yàn)證了核心SSR引物組合的適用性。本研究篩選出TM444、TM548、TM259和TM566等4對(duì)核心引物可區(qū)分開(kāi)所有的品種。這4對(duì)核心引物單獨(dú)可鑒定的品種數(shù)分別是13、11、9、7。根據(jù)劉峰等[21]提出的核心引物理論，可區(qū)分的最大品種數(shù)N=G1×……×Gn，Gn為n個(gè)引物在參試品種中檢測(cè)到的基因型。這4對(duì)核心引物組合理論上可鑒定的最大品種數(shù)為9009，理論上可以滿(mǎn)足現(xiàn)有茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種鑒定的需要。

3.3 DUS測(cè)試中近似品種選擇

在DUS測(cè)試中，需要將申請(qǐng)品種與近似品種進(jìn)行多方面比較，當(dāng)兩個(gè)品種存在明顯和穩(wěn)定的差異時(shí)，申請(qǐng)品種才具有特異性。因此，近似品種的選擇至關(guān)重要，必須以科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒êY選。系譜真實(shí)反映了品種之間的親緣關(guān)系，具有相同遺傳背景的品種，在表型性狀和SSR擴(kuò)增電泳圖譜上均具有相似性，因此，近似品種的選擇可以參考親緣關(guān)系分析[22]。本研究中，遺傳背景相似的品種大多聚在一起。例如黃金斑和金玉緣都是由黃金芽的自然突變單株選育而來(lái)，二者遺傳距離在所有參試品種中最小，只有0.03。有的品種與父母本中的一個(gè)親本聚在一起，而與另一個(gè)親本則相距甚遠(yuǎn)。如中茶126為毛蟹與龍井43的雜交后代，它與毛蟹分在了不同類(lèi)群，而與龍井43聚在一起。綜上所述，SSR標(biāo)記應(yīng)用于茶樹(shù)DUS測(cè)試近似品種輔助選擇是可行的。

本研究通過(guò)30對(duì)SSR引物對(duì)26個(gè)茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種及其13個(gè)近似品種和親本進(jìn)行分子鑒定和系譜關(guān)系分析，30對(duì)SSR引物中60%的引物多態(tài)性高，聚類(lèi)分析將地理來(lái)源一致或遺傳背景相似的材料基本上聚為一類(lèi)。通過(guò)4對(duì)核心引物的組合可以清晰地區(qū)分所有39個(gè)參試品種，并依此構(gòu)建了SSR指紋圖譜，為茶樹(shù)PVP申請(qǐng)品種鑒定、DUS測(cè)試和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面提供一定的理論依據(jù)。

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SSR Identification and Pedigree Analysis of PVP Application Cultivars in Tea Plant

HUANG Danjuan, MA Jianqiang, CHEN Liang*

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Thirty SSR markers were used in this study for molecular identification and pedigree analysis of 26 PVP application tea cultivars, and 13 similar cultivars and parents, for probing the possible application of PVP and DUS testing using SSR markers in tea plant. A total of 131 alleles were detected, the number of alleles detected by each SSR marker ranged from 3 to 7, with a mean of 4.4. The average values of Shannon index and polymorphism information content were 1.04 and 0.51, respectively. The genetic distance ranged from 0.03 to 0.70 between 39 cultivars. When the genetic distance was 0.15, they could be classified into 7 groups. Tea cultivars from the same province and genetic background were clustered into one group to some extent. The identification ability of the 30 SSR markers was quite different, each marker could identify 3-16 cultivars. The 39 tea cultivars could be clearly distinguished by 4 core primers which were used to construct the molecular fingerprinting of all cultivars.

tea cultivars, PVP, SSR markers, fingerprinting

S571.1；Q52

A

1000-369X（2016）01-068-09

2015-08-12

2015-09-14

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)項(xiàng)目（CARS-023）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2012C12905）資助。

黃丹娟，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)資源育種研究。*通訊作者：liangchen@tricass.com