茯茶“散茶發(fā)花”加工前后差異化學成分的分離與鑒定

黃浩，趙熙，黃懷生，銀霞，粟本文，鐘興剛，黃建安，鄭紅發(fā)*，劉仲華*

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茯茶“散茶發(fā)花”加工前后差異化學成分的分離與鑒定

黃浩1,2,3，趙熙1，黃懷生1，銀霞1，粟本文1，鐘興剛1，黃建安2,3，鄭紅發(fā)1*，劉仲華2,3*

1. 湖南省茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2. 湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；3. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

以烏龍茶（大紅袍）、紅茶、綠茶、黑茶（天尖茶原料、金湘益茯磚茶原料）為加工原料，運用“散茶發(fā)花”技術，加工制得不同茶類散裝茯茶制品。本研究以不同性質茶葉的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣作為研究對象，將“發(fā)花”前后的茶樣經HPLC圖譜疊加比對分析，尋找“發(fā)花”前后主要新增差異化學成分，同時運用制備色譜制備目標差異化學成分，并經HR-MS和NMR技術對其進行結構鑒定。結果表明，在本研究的分離條件下，不同性質的5種茶葉原料經相同“發(fā)花”處理后，各組形成的差異化學成分基本表現一致，其中選取分離、鑒定的兩種新增差異化學成分均為黃酮醇化合物，分別是槲皮素和山奈酚。

茯茶；散茶發(fā)花；新增差異化學成分；黃酮類化合物；槲皮素；山奈酚

歷年來，我國西北地區(qū)游牧名族日常生活以牛、羊肉及奶制品等高脂、高熱量食物為主，蔬菜缺乏的邊疆地區(qū)將傳統(tǒng)茯磚茶作為膳食纖維添加而被人們廣泛攝取，氣候特點與飲食習慣造就了茯磚茶在邊疆地區(qū)的興起，該茶成了人們日常生活的必需品，“寧可三日無糧，不可一日無茶”[1]的美譽在邊疆地區(qū)的流傳見證了茯磚茶在我國邊疆地區(qū)的興旺與發(fā)展。生活水平的提升與健康理念的加強，現代化茯茶加工工藝的發(fā)展及創(chuàng)新型茯茶產品的涌現推動了茯茶產業(yè)鏈的形成和高速發(fā)展，顯著提升了茯茶制品的流通量，如今，茯茶制品的銷售區(qū)域也由過去的邊疆地區(qū)逐漸向內陸地區(qū)甚至全世界迅速擴張。

茯茶不僅因其獨特的加工工藝與風味品質聞名于世，且其突出的保健功效也逐漸成為人們關注的焦點。獨有的“發(fā)花”工藝與成品茶中形成的優(yōu)勢“金花”菌使現代化茯茶具備了區(qū)別于其加工原料的特有品質風味與保健功效[2]，現代科學研究證明，茯茶在調節(jié)高血脂癥、高血糖癥、減肥等保健功效方面有著突出的功效[3-5]，“金花”菌則被視作為保健功效的關鍵，因此，“發(fā)花”處理的茯茶成品中特異性功能成分的分離與鑒定成了研究的重點。本研究運用現代化茯茶加工新技術——茯茶“散茶發(fā)花”技術，分別以不同茶類原料茯茶的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣作為研究對象，對“發(fā)花”前后的茶樣經HPLC圖譜疊加比對分析，尋找“發(fā)花”前后主要新增差異化合物，并運用制備色譜制備目標差異化合物，經HR-MS和NMR技術對其進行初步鑒定，以期為茯茶保健功效的機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

“金花”菌——冠突散囊菌（）[6]，為湖南農業(yè)大學茶學教育部重點實驗室藏菌株，分離自湖南益陽茶廠有限公司產茯磚（800?g裝，產于2007年）。

1.2 供試茶葉及取樣

2013年產大紅袍（福建武夷山，代號A），2010年產紅茶（湖南石門，代號B），2011年產綠茶（湖南石門，代號C），2012年產天尖茶原料（湖南安化，代號D），2008年金湘益茯磚茶原料（湖南益陽，代號E）。按照“散茶發(fā)花”的技術要求[2]對以上4種不同茶類的5種茶葉原料進行“散茶發(fā)花”處理（n=6），恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10?d，“發(fā)花”后茶樣經70℃干燥4?h，編號并置于－20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

兒茶素、生物堿、槲皮素、山奈酚等標準品（純度≥95%）均購置Sigma公司，乙腈（色譜純，美國MERCK公司），甲醇（色譜純，美國Honeywell公司），乙酸（分析純，成都科龍化學試劑有限公司），超純水（Millipore超純水儀自制）。

1.4 儀器與設備

Delta320 pH計（Mettler）、Motic B1光學顯微鏡（Motic公司）、萬分之一電子天平（Mettler AE240）、MIKRO-35高速冷凍離心機（德國Hettich）、蘇凈雙人單面超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司生產）、振蕩恒溫培養(yǎng)箱（上海蘇坤實業(yè)有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（江蘇環(huán)保儀器廠）、高溫高壓滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）、恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備公司）、冷凍干燥儀（廣州貝立思有限公司）、旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）、Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6320離子阱質譜、Bruker 400 Ultra-ShieldTM超導脈沖傅立葉變換核磁共振、水浴鍋、5?mL一次性注射器（河南曙光健士醫(yī)療器械集團有限公司）、100?mL容量瓶、0.45?μm微濾過濾頭（Millipore）等。

1.5 “散茶發(fā)花”茯茶茶樣與茶湯制備

按照“散茶發(fā)花”的技術要求將各茶類原料加水至相同最終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，置培養(yǎng)箱中控溫、控濕培養(yǎng)10?d，“發(fā)花”結束后置于70℃恒溫干燥箱中4?h即可取出封存[7]。

準確稱取干燥茶樣2.0?g至錐形瓶，加沸水100?mL置90℃水浴鍋中浸提30?min，期間每10?min搖瓶1次，浸提結束后精細抽濾于100?mL容量瓶中冷卻定容，混勻備用[8-9]。分析檢測與鑒定樣品需經孔徑0.45?μm濾膜過濾。

1.6 “散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異化合物分析

1.6.1 “散茶發(fā)花”茯茶發(fā)酵前后HPLC圖譜 分析

色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器、自動進樣器及柱溫箱，色譜柱Welchrom C18（4.6?mm×250?mm，5?μm），流動相A為0.2%乙酸水溶液，流動相B為乙腈，流速為1?mL·min-1，柱后分流0.5?mL·min-1進入質譜離子源，柱溫30℃，進樣量5?μL，檢測波長280?nm，梯度條件[10]為：0~4?min，B：6%；4~16?min，B：6%~14%；16~22?min，B：14%~15%；22~32?min，B：15%~18%；32~ 37?min，B：18%~29%；37~47?min，B：29%~ 45%；47~52?min，B：45%；52~53?min，B：45%~6%；53~63?min，B：6%。

質譜條件：正、負離子ESI源的Agilent 6320離子阱質譜，霧化器壓力為45?psi，毛細管電壓：3.5?kV，干燥氣流速為12?mL·min-1，干燥氣溫度為350℃，質量掃描范圍：100~1000?amu。

1.6.2 “散茶發(fā)花”茯茶目標差異物制備與鑒定

（1）茶葉水提物制備：將茶葉粉碎后參照1.5提取，精細抽濾，濾液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮后至冷凍干燥器中凍干，獲得茶葉提取物干粉，袋裝封口置于－20℃冰箱中備用。

（2）色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱LUNA C18（50?mm×250?mm，10?μm），DAC：Novasep 50?mm，流動相：乙腈（0.1%三氟乙酸）∶硝酸鈰銨=70∶30，流速為118?mL·min-1，進樣量5?mL，運行時間為30?min。

（3）質譜測定條件：正、負離子ESI源的Agilent 6320離子阱質譜，霧化器壓力為45?psi，毛細管電壓：3.5?kV，干燥氣流速為12?mL·min-1，干燥氣溫度350℃，質量掃描范圍：100~1000? amu。

（4）NMR：Bruker 400 Ultra-ShieldTM超導脈沖傅立葉變換核磁共振儀。H-NMR和C-NMR：以氘代水為溶劑，丙酮為內標進行測定。

2 結果與分析

2.1 5種茶樣“散茶發(fā)花”茯茶樣品

按照“散茶發(fā)花”的技術要求將各茶類原料加水至相同最終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，放置培養(yǎng)箱控溫控濕培養(yǎng)10?d，“發(fā)花”結束后置于70℃恒溫干燥箱中4?h，取出封存。比對各茶樣“發(fā)花”的茯茶實物圖（圖1）發(fā)現，相同劑量和相同時間處理的“發(fā)花”茶樣均“金花”滿披，除外觀形態(tài)有細微差別外，其他并無表現出明顯差異。

2.2“散茶發(fā)花”茯茶“發(fā)花”前后差異化合物HPLC圖譜疊加比對分析

按照1.6.1的HPLC方法進樣分析，經HPLC圖譜比對分析，結果發(fā)現5種茶樣發(fā)花前后的差異化合物表現出一致性（圖2~圖6），同時分別在保留時間45.9?min和49.3?min左右新增兩個峰，且5種“發(fā)花”處理樣品中新增的兩個目標化合物在保留時間上呈現高度一致（圖7），這說明采用不同茶葉原料進行相同“發(fā)花”處理，最終形成了相同的差異化合物。

2.3 差異化合物制備

按照方法1.6.2對“發(fā)花”10?d的茶樣進行制備色譜分離制備，所得色譜圖如圖8所示，結果表明，在保留時間為12.5?min（差異化合物1）和22.5?min（差異化合物2）處分別檢測到單一流分，隨即分別對這兩處流分進行收集，再經旋轉蒸發(fā)儀在30℃水浴下濃縮以去除有機溶劑，最后再進行冷凍干燥并保存。

2.4 差異化合物結構鑒定

按照方法1.6.1，分別對所得流分1和2進行分析型HPLC進樣分析，所得色譜圖如圖9、圖10所示，結果表明，在保留時間為45.794?min和49.299?min處分別檢測到差異化合物1和差異化合物2，并將所得兩個化合物作HR-MS和NMR檢測分析。

根據化合物1和2的類別判斷可知，二者均為黃酮類化合物，化合物1，C15H11O7，淡黃色無定型粉末，MS，/：303.0500，[M+H]+（圖11）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d7.73 (1H, d,= 1.8 Hz, H-11)，7.63 (1H, dd,= 8.0 Hz, H-15)，6.88 (1H, 1H, d,= 8.0 Hz,H-14)，6.38 (1H, d,= 1.8 Hz H-8)，6.18 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.7(C-7)，162.6 (C-5)，158.4 (C-9)，148.9 (C-13)，148.2 (C-1)，146.3 (C-12)，137.3 (C-2)，124.3 (C-10)，121.8 (C-15)，116.4 (C-14)，116.1(C-11)，104.6 (C-4)，99.4 (C-6)，94.5 (C-8)，經與文獻對照[11-13]，以上數據與槲皮素基本一致，結構式見圖12，化合物1的關鍵HMBC二維核磁相關見圖13。

化合物2，C15H11O6，淡黃色無定型粉末，MS,/: 287.0553, [M+H]+（圖14）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d8.09 (2H, d,= 8.0 Hz, H-11, H-15)，6.90 (2H, d,= 8.0 Hz, H-12, H-14)，6.40 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8)，6.18 (d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.8(C-7)，162.6 (C-5)，160.7 (C-13)，158.48 (C-9)，148.2 (C-1)，116.4 (C-14)，

116.4 (C-12)，137.2 (C-2)，130.8 (C-15)，130.8(C-11)，123.9 (C-10)，104.7 (C-4)，99.4 (C-6)，94.6 (C-8)。經與文獻對照[12-14]，以上數據與山奈酚基本一致，結構式見圖15，化合物2的關鍵HMBC二維核磁相關見圖16。同時結合兩種化合物的高效液相色譜圖，其保留時間分別與標準品槲皮素、山奈酚均一致，見圖17。因此將目標差異化合物分別鑒定為槲皮素（化合物1）和山奈酚（化合物2）。

3 討論

從傳統(tǒng)的茯磚茶到多樣化的現代化茯茶的演變，經歷了加工工藝的改善與簡化，生產效率的提高，質量可控性的加強，產品形式的增加，消費者飲用方式的改變與產品價值的提升，同時工藝的改進使研究者們能夠更加便捷地獲得特定茶葉原料制茯茶，甚至非茶葉原料

制發(fā)花試驗材料[15]，茯茶“散茶發(fā)花”技術的應用為以冠突散囊菌為供試發(fā)酵真菌對特定植物材料或功能性生化成分的微生物代謝、生物轉化研究及功能性真菌發(fā)酵食品的開發(fā)奠定了基礎。

茯茶因其獨特的加工工藝、風味品質與突出的保健功效而聞名于世，獨有的“發(fā)花”工藝與成品茶中的優(yōu)勢“金花”菌使現代茯茶形成了區(qū)別于其加工原料的特有的品質風味與保健功效，其實質是“金花”菌通過在發(fā)酵過程中分泌復雜多樣的孢外酶以及微生物熱，直接或者間接利用茶葉生化成分作為滿足其生長、繁殖需要的營養(yǎng)基礎[16]，期間發(fā)生一系列復雜的生化反應，一方面形成了茯茶特異的風味品質，另一方面“金花”菌以茶葉功能成分為代謝基質或代謝出性質更為全面或功能更強的生化成分。

因此，“發(fā)花”處理的茯茶成品中特異性功能成分的尋找成了研究者們關注的重點，本研究運用現代化茯茶加工新技術的便捷性，分別以不同茶類原料制茯茶的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣為研究對象，對“發(fā)花”前后的茶樣經HPLC圖譜疊加比對分析，尋找“發(fā)花”前后主要差異化學成分，并運用制備色譜制備目標差異化合物，經HR-MS和NMR技術對其進行初步鑒定，結果表明，在本研究的分離條件下，不同性質的茶葉原料經相同“發(fā)花”處理，與其對應原料相比，各組形成的差異化學成分表現出高度一致性，差異化學成分均為黃酮醇化合物，分別為槲皮素和山奈酚。

黃酮類化合物因分子中有酚羥基而顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中；黃酮類化合物分子中γ-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子因有未共用的電子對，所以表現出微弱的堿性，其溶解度也因結構不同而具有很大的差異，黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有機溶劑和稀堿液中，而黃酮類化合物通常以黃酮糖苷的形式存在于茶葉中，因此本研究在各茶葉原料HPLC圖譜中未找到兩種目標黃酮醇化合物，經“發(fā)花”處理后，實質可能是在微生物分泌的酶和熱的作用下將原本以黃酮苷形式存在于茶葉中的黃酮類化合物經水解作用形成了黃酮醇化合物，從而在不同茶類“發(fā)花”制品的HPLC圖譜中檢測到相同的兩種差異黃酮醇化合物，此研究結果可能為“發(fā)花”茯茶的突出保健功效提供一定的理論基礎。

[1] 何晏文. 牧民的喝茶習慣與趙李橋的青磚茶[J]. 中國民族, 1980, 11: 31.

[2] 黃浩. 茯茶“散茶發(fā)花”技術研究[D]. 長沙: 湖南農業(yè)大學, 2010: 14-17.

[3] Li Q, Liu Z, Huang J, et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(6): 1310-1316.

[4] Fu D, Ryan EP, Huang J, et al. FermentedFu Zhuan tea, regulates hyperlipidemia and transcription factors involved in lipid catabolism [J]. Food Research International, 2011, 44(9): 2999-3005.

[5] Wu Y, Ding L, Xia H, et al. Analysis of the major chemical compositions in Fuzhuan brick-tea and its effect on activities of pancreatic enzymes[J]. African Journal of Biotechnology, 2013, 9(40): 6748-6754.

[6] 黃浩, 劉仲華, 黃建安, 等. “發(fā)花”散茶中“金花”菌的分離鑒定[J]. 茶葉科學, 2010, 30(5): 350-354.

[7] Qin J-H, Li N, Tu P-F, et al. Change in tea polyphenol and purine alkaloid composition during solid-state fungal fermentation of postfermented tea [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(5): 1213-1217.

[8] Zhang L, Li N, Ma Z-Z, et al. Comparison of the chemical constituents of aged Pu-erh tea, ripened Pu-erh tea, and other teas using HPLC-DAD-ESI-MSn [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(16): 8754-8760.

[9] Yang XR, Ye CX, Xu JK, et al. Simultaneous analysis of purine alkaloids and catechins inandvar. kucha by HPLC [J]. Food Chemistry, 2007, 100(3): 1132-1136.

[10] Luo Z-M, Du H-X, Li L-X, et al. Fuzhuanins A and B-the B-ring fission lactones of flavan-3-ols from Fuzhuan brick-tea [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(28): 6982-6990.

[11] 呂海鵬. 普洱茶的化學成分分析及其抗氧化活性研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2005: 33-34.

[12] Xiao Z, Wu H, Wu T, et al. Kaempferol and quercetin flavonoids from Rosa rugosa [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2006, 42(6): 736-737.

[13] Zhu Y-F, Chen J-J, Ji X-M, et al. Changes of major tea polyphenols and production of four new B-ring fission metabolites of catechins from post-fermented Jing-Wei Fu brick tea [J]. Food Chemistry, 2015, 170: 110-117.

[14] Kanegae A, Sakamoto A, Nakayama H, et al. New phenolic compounds fromL. fermented leaves [J]. Journal of Natural Medicines, 2013, 67(3): 652-656.

[15] 蔡正安, 劉素純, 劉杏益, 等. 冠突散囊菌在不同茶類及幾種植物材料上“發(fā)花”的研究[J]. 茶葉科學, 2011, 31(4): 263-268.

王增盛, 施兆鵬, 劉仲華, 等. 論茯磚茶品質風味形成機理[J]. 茶葉科學, 1991, 11(1): 49-55

Isolation and Identification of Variant Phytochemical in the Processing of Fu Tea by Fungal Fermentation with Loose Tea

HUANG Hao1,2,3, ZHAO Xi1, HUANG Huaisheng1, YIN Xia1, SU Benwen1, ZHONG Xinggang1, HUANG Jian’an2,3, ZHENG Hongfa1*, LIU Zhonghua2,3*

1. Hunan Tea Research Institute, Changsha 410125, China; 2. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

Several kinds of Fu tea were obtained by the technology of “fungal fermentation with loose tea” with different tea samples such as Dahongpao tea, black tea, green tea, the raw material of Tianjian tea and the raw material of Jinxiangyi brick tea. With different properties of tea samples (fungal solid state fermentation) generated from “fungal fermentation” as the research objects, this article has searched the main variant phytochemical through comparative analysis with the help of HPLC overlay method. Meanwhile, targeted variant compounds have been constructed with preparative HPLC with preliminary identification by HR-MS and NMR. The experiment indicated that under the detached condition of this study, different kinds of Fu tea generated the same compounds after “fungal fermentation”. And the two added variant compounds are flavonols, named quercetin and kaempferol respectively.

Fu tea, fungal fermentation with loose tea, variant compounds, flavonols,quercetin, kaempferol

TS272.5+4；Q946.84+1

A

1000-369X（2016）01-027-11

2015-06-02

2015-08-12

國家自然科學基金（31471706）、現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-23）、湖南省茶葉研究所所長基金（2015SJ01）。

黃浩，男，博士，主要從事茶葉加工及功能成分研究。*通訊作者